嗜肺军团菌血清1型基因检测及分子分型研究

嗜肺军团菌血清1型基因检测及分子分型研究 嗜肺军团菌血清1型基因检测及分子分型研 究 rIt人兽共患病 (,hill(scJ0t1rnalofZoonoses1l5l 文章编号:1002—2694(2O10)12—1151一O3 嗜肺军团菌血清1型基因检测及分子分型研究 杨梦.程慧键,熊长辉.徐晓倩.陈福辉,刘晓青,周海建!.袁辉 摘要:目的了解青曼市宾格业中央空调争却塔水中分离的嗜肺军团茁菌株的基因特征.方法6株分离嗜肺军团菌 茼株守经血清学凝笔试验,胶乳:疑试验确定专Ipl型嗜肺军团菌后,利用PCR技术对军团茁羁5SrRNA基因和嗜肺军 团忙nip毒了』莹因的特异E《世行扩憎.应喟多纽点:刮宁(SP}T)分析.获得相应的SBT型别.使用脉冲场凝胶电泳(PFGE) 分型技术?时茁雄世"全警龟岸1)NA酶切电铲型.并嗣BioNumerics数据库软件进行分型分析.结果断有的菌株均带有 橇村异性5SrR,困及nl奇力警图,SB'I,分型悻均为S'I,l型.PF(;聚分析结果显示前彳末带型之问有差异,6栋 菌可分勺1种带型.结论街昌市女共场所专却塔水中分离的1.p1型嗜肺军团菌菌株基因呈多样性. 关键词:嗜肺军团蓿:血清l型:兮子兮型 中图分类号:R1264文献标识码:A GeneticcharacteristicsofLegionellapneumophilaserotype1strains YAN(Mcng,(,HEN(;Hui—jian.XI()NGChang—hui.XUXiao—qian CttENFLrt1ui.IIUX()一qing,ZH{)UHal,jian.YUANHui (1.,7,",,Xif,'(Jtr,7",L,(,,,fI)isea(?on/t'olandPrevention,Nanc,]1a11330029: 2.,'a/iouu/hz.,ti/ut~,f"'((Hlllill(1lg{(厶/(,Disease(7uuttolandI'1-(3'U#tl~ir』『『,Chi,r(1,,,rr /…f)i.wasf,(,…,,o/"lit/PrcJf』ention.P,eijing102206,(Pitina) ABS''1RAC'I,:InO1'r?…n/Jrl{幽cgcnf, 一]glF[iC{isticsofLegiom4lapneumophilaserot},ix-1(I])strainsisola)ed fton:(,()()linR"vVal(,rwilbin10\V(rs()f(,cI]:ral,l_r 【'ondilkminginhotelsinNanchangcity,sixI,})isobLteswereideI:tifie(1asI.p1t)v st,r(}logicL1agglu*inafiontvstandlal,x;gglIuinationtes1.rhenPCRwasusedtodelectthest -ionellaspp.SSrRNA )e;ail? ~ei]enn(1IP,irulcm'mipgnL.【,(?lL,I1 【ingh}lc(1:yI;e(SB1,)andpulsedfieldgelelectrophoresis(PFGE)wercLlse(tinn1o— l(uDIrB't)D1g.Alls[I'fnwe}'(positi~ewid:5StR\1gcnPand.tipgene._j,heSBI,typeofallsix tr|【inswaSr1.However. tI'【(,lEresullsh(}wc{{di… [}elWucnpatterns()fsixslrainswhichcouldbedivide({intofoL】rPI:GE"attern.SixLeg ,(7 『f,umophil"isoblit.fron1cooling~,valcrin1()wrsit1publicplacesofcentralairconditioni ngsyslcm1sNanchangCity V~C'I'gcnctiL,djv,^】tv. KEYW(}RI}S:,P??lla 军【州病是军L制引起的,一种饥会获得性呼吸 道传染病.菌日前人约订5()个种.72个血清 型.9o以J的军}j1茼忡炎都是由嗜肺军团茼引起 的.嗜肿军刚菌皿清l蒲株(I.p1)为主要的致病 m清.军[才1荫的q一长和繁殖与环境素密切相 关.尤其在供水系统,空渊系统中较为常见.主要 是通过气溶胶的式进行传播.本研究采用基因捡 测,多化点测睁,脉冲场凝胶电泳分型技术.埘南昌 巾宾馆业一{央渊冷却塔水r}1分离到的嗜8市军【才1蔺 血清1型(1.p1)菌株进行分f特征研究. 1材料与方法 1.1菌株来源6侏I1)1嗜怖军同茼均为2OO6 年南昌市6个不同寅馆的中尖窄凋冷却塔水污染状 况监测中检得,作为PF(E实验分子量标准对照的 沙门菌H9812菌株,由中同疾病预防控制中心传染 病预防控制所提供. 1.2主要试剂军团菌诊断血清购自上海市疾病 预防控制中心,GVPC琼脂,BCYE~琼脂,无半胱氨 酸BCYE琼脂,胶乳凝集试剂盒购自英国{)XOID 生物公司,PCR扩增反应试剂盒购自上海宝生物工 程有限公司,均在有效期内使用.7对管家基因引 物由上海生工合成,限制性内切酶S,i1,Xba}, 蛋白酶K购自大连TAKAP,A公司. 通讯作者:袁辉,Email:1xcdcyuanhui@】26.COlD 作者单位:J.江西省疾病预防控制中心.南昌330029; 2.中国疾病预防控制中心传染瘸预防控制所,北京 1022(16 l52中国人兽共患病 ChineseJOUrnalofZoonoses 1.3主要仪器PCR扩增仪,脉冲场凝胶电泳仪, 凝胶成像仪为美国BIO—RAD公司产品,水浴摇床, 二氧化碳培养箱为美国NUAIRE公司产品. 1.4细菌DNA模板制备挑取单个菌落于 1O0雎I裂解液中混匀.于100?煮沸10min,冰浴5 min,10000r/rain离心5rain,取上清液做为PCR 扩增的模板. 1.5PCR扩增PCR方法参考文献[2].用 5SrRNA和Mip两套引物分别扩增,循环参数为: 5min预变性;94?30S,55?30S,72?60S, 94? 扩增35个循环;最后72?再延伸5rain.5SrRNA 预计扩增片段为130bp,Mip预计扩增片段为450 bp.产物检测用1含G0ldViewTMDNA染料的 琼脂糖凝胶电泳,利用DI2000DNAMarker确定 产物分子量大小. 1.6多位点测序(SBT)使用国际SBT数据库 中公布的引物,对7个基因 位点(flaA,pilE,asd,mip,DIoDIps,proA和neuA) 进行PCR扩增,测序,将得到的序列信息与数据库中 的序列进行比对,获得相应的SBT型别编号,见l. 表1扩增引物序列 Table1ThesequenceofprimersusedinPCR 1.7脉冲场凝胶电泳使用S一厂I作为内切酶. 分子量标准株H9812用XbaI酶切,其余参数与受 试菌株相同.具体步骤如下:用棉签刮取经培养过 夜的适量细菌,均匀悬浊于细菌悬浮液CSB中,使 其浓度为5.0个麦氏单位.取400肚I细菌悬浊液 置于高压灭菌的1.5mI离心管中,37?孵育5min 后,加入2OL蛋白酶K(20mg/mI).用400I溶 解完全且已于56?水浴30min以上的1 SeakemGold胶(内含1SDS)混匀后,将混合液 加入模具,室温下静置15rain.制成胶块.将胶块 移入5mI细胞裂解液中,54?水浴摇床(170r/ min)孵育2h,50?水浴摇床中使用同温度纯水清 洗2次.每次10min,同温度TEbuffer清洗4次, 每次15min,清洗后胶块置TE中备用.用刀片切 下2mm宽的胶块放入1.5mI离心管中,用5OU 的SfiI于50?酶切4h.将胶块贴于梳齿包埋于 lSeskemGold琼脂糖,待胶凝固后,将胶小心放 人含2500mI0.5XTBE缓冲液电泳槽中,电泳 21.5h,电泳起始转换时间5.3S,最后转换时间 49.9S,电压6V/cm,电场夹角120.,电流控制在 155mA左右,温度14?.电泳结束后.将胶块放 入1ptg/ml的EB液中染色30min,清水脱色1h 后,凝胶成像系统GelDoeXR下观察结果. 1.8聚类分析采用BioNumerics软件对全染色 体DNA酶切图谱进行聚类分析. 2结果 2.15SrRNA,mip基因PCR检测结果6株实验 菌株军团菌属特异性5SrRNA基因及嗜肺军团菌 主要毒力基因mip检测均为阳性(7号菌株为嗜肺 军团菌其它血清型),见图l. 130bp M+一7765543221lM A:5SrRNA(通用引物)扩增片段为130bp 5SrRNA(generallendthing)expandto130bp l50bp Mll223455677一+M B:mip(嗜肺团菌引物)扩增片段为450bp TheMip(1eadthingofLegionellapneumophila) expandsto450bp 图15SrRNA,mip基因PCR检测结果 Fig.1ThePCRresultsof5SrRNAandmip 2.2SBT分型结果6株Ip1型嗜肺军团菌SBT 分型均为ST1型,各基因位点等位基因号见表2. 2010,26(12)患in共al患ofZ病o.学nos报es1153 2.3PFGE分型及聚类结果6株Ip1型嗜肺军 ,得到的图谱 团菌经SfiI酶切后进行PFGE电泳 使用BioNumerics软件处理.按100的相似性系 数进行分型,菌株之间的相似性系数为72, 100,6株Ip1型嗜肺军团菌分为4种不同带型, 见图2. Dic9(Tol'傩?1.O,lH>0.OS.O%IIo_0P'伽LO PFGE 图26株LPI型嗜肺军团菌PFGE结果聚类图 Fig.2TheclustertreeofsixLegionellapneumophilasero— type1strainsbasedonPFGEpatterns 3讨论 自1976年军团菌被发现以来,已有多起军团菌 暴发及散发病例报道.作为新发传染病之一,军团 菌病已成为世界各国普遍关注的公共卫生问题. 2006年我们对南昌市宾馆业中央空调冷却塔军团 菌污染状况进行调查,结果显示,南昌市中央空调冷 却塔存在军团菌的污染?,且其污染率高达53.8, 检出菌型中以Lpl型为主. PCR方法检测细菌比已往所有传统的外显蛋 白质表型检测更为可靠.5SrRNA是军团菌属共有 基因,高度保守,其rDNA序列拷贝作为属检测依 据是非常可靠的.巨噬细胞感染增强蛋白(mip)是 军团菌的主要毒力因子之一,在嗜肺军团菌抵抗宿 主细胞内杀灭机制中发挥重要作用,mip基因序 列可用作嗜肺军团菌种特异性靶序列来扩增.我们 应用PCR技术,对6株Ip1型嗜肺军团菌进行 5SrRNA属基因和,P型特异性基因检测,均携带 嗜肺军团菌属,种基因,从分子角度得以验证. Ipl型嗜肺军团菌是引起人类肺炎最多见的血 清型之一.有报道指出,Ip1型菌株包括至少3个 血清亚型奇,采用常规的血清学分型方法,对于暴 发疫情溯源存在困难,因此采用何种分型方法对于 结果分析起着关键作用.目前应用比较广泛的核酸 指纹分型技术主要是基于电泳图谱分析的一种分子 分型方法,脉冲场凝胶电泳(PFGE)已在国际上广 为应用.本次研究中的6株Lpl型嗜肺军团菌 株分别采自南昌市6所宾馆的中央空调冷却塔水, 按100的相似性系数进行分型,从图2PFGE聚 类图可以看出,菌株间相似性系数存在差异,说明南 昌市宾馆业中央空调冷却塔水分离到的Lpl型嗜 肺军团菌基因存在多样性. 多位点测序分型(MlST)技术是一种以核苷酸 序列分析为基础的分型方法,它是高通量测序技术 和成熟的群体遗传学相结合的产物.该方法简单易 行,重复性强,能够反映病原菌的群体进化生物学, 在流行病学调查和病原菌的分型鉴定中发挥了巨大 作用.可利用MIST方法的高分辨率,进行流行菌 株间亲缘关系的判定.但本研究中发现,在Lpl 血清型嗜肺军团菌内,菌株7个管家基因的PCR产 物序列均无差异,均为ST1型,即未观察到位于同 一 血清型内部的基因突变,揭示了本地区同一血清 型内各菌株管家基因碱基序列的高度保守. 中央空调冷却塔是空调系统中唯一与外界相通 的部分,一旦冷却塔水被军团菌污染,极易形成气溶 胶,使带有军团菌的气溶胶扩散至空气中造成空气 污染,同时对周围环境也存在潜在危害.本研究结 果表明,军团菌分子分型方法可以用于不同宾馆军 团菌分子流行病学监测及军团菌分子遗传学特征的 研究.还可用于研究军团菌优势基因型和优势菌群 的分布特征. (下转第l156页) 鹏i呈叁;鹏脯小小小小小小 ?d?一???^ 1l56I}】罔人兽jt患病 (,l1ines0JoLIFI1alofZoonoses2010.26(12) 的?分泌器怎样识圳底物?特异伴侣的作用是什 么?分子伴侣的进化,结构上的.些共同特征以及 分子伴侣与相应底物相互作用区域的特点?刺激川 型分泌的信号是什么?存宿主细胞内不同的效应蛋 白是怎样发挥功能的?用TI,SS输送异源蛋白质能 够促进新的疫苗和治疗方法的发展.f?型分泌可能 为定向输送工程蛋白,影响细胞信号转导等提供有 用的工具,从而为人类治疗衣原体引起的疾病作出 贡献. 参考文献: (1]MalSUFnOU)A.l('ctrf)nHli(r()scopicobservat{ol1.4()fsiirfacepro ]eclions'm0hhzmydiapszim?rotieulaleI)odi~-".3Baeteriol, l982,150:38364. [2]lj(,tts1tJ.TwiggsIE.SalMS,etIl1.})informaticandBio chemicalcvidcn(cfor"】(,idenlifleationof1hetYlX1i1>eerelion systeil1needlcprotcinof(filam3'clia"cht"}lu{is(".Bacterio1. 2f)()8,190:l6)1690. 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