调节性T细胞

调节性T细胞 调节性T细胞(Treg)及其流式检测方法 2010-02-20 00:08:01 来源:易生物实验 浏览次数:366 网友评论 0 条 关键词:调节性细胞检测调节性T细胞Treg流式T细胞 Treg细胞概述 高效免疫抑制剂的发现及其联合应用使临床器官移植的急性排斥反应大大降低，移植物的存活时间明显延长;器官移植成为挽救终末期器官功能衰竭患者生命的重要有效途径。但是免疫抑制剂具有明显的毒副作用(如对重要脏器的损伤、降低抗肿瘤及抗感染免疫力等)及对治疗慢性排斥反应效果较差等问题，均限制了免疫抑制剂的长期应用。因此，相关生命科学工作者尝试通过诱导移植免疫耐受途径来避免免疫抑制剂的长期应用及克服移植免疫排斥反应。 在上个世纪九十年代中期，由Sakaguchi等首先证实了天然CD4 CD25 调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)为一类具有免疫抑制作用的T细胞，约占外周CD4+T细胞的5,10%。该类细胞以“主动”的方式参与免疫应答,免疫耐受的调控，不仅参与自身免疫耐受调节，而且在肿瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。 2、Treg细胞的来源 研究证实，天然的CD4 +CD25+Treg细胞来源于胸腺，小鼠出生后第3天切除胸腺，外周缺乏CD4+ CD25+Treg细胞，产生抗自身抗体并出现自身免疫性胃炎等自身免疫性疾病。而在第0天和第7天切除胸腺，并不表现自身免疫性疾病。这说明出生3d内 是胸腺产生CD4+CD25+Treg细胞的关键时期，这时切除胸腺引起自身反应性CD4+T细胞的过度增殖。但是，出生第0天胸腺产生的自身反应性 CD4+T细胞不足，出生第7天胸腺已经产生了足够的CD4+CD25+Treg细胞，所以这时切除胸腺， 小鼠不出现自身免疫性疾病。Papiernik等证实，CD4+CD25+Treg细胞产生于胸腺，然后迁移到外周发挥作用，CD4+CD25 胸腺细胞与外周的CD4+CD25+Treg细胞一样，表现对经由TCR的抗原刺激呈低反应性，并且显 示抑制其他T 细胞增殖的能力。CD4+CD25+ Treg细胞的产生需要TCR与胸腺皮质上皮细胞的MHC II类分子间的高亲和力作用，MHC II类分子缺陷的小鼠缺乏CD4+CD25+Treg细胞。CD4+CD25+T细胞除了在胸腺产生以外，还可以在未成熟的树突状细胞、IL-10、IF TGF-beta或者低剂量抗原诱导下由外周CD4+CD25-细胞转变而来，该类细胞称为诱N-a、 导的CD4+CD25+Treg细胞。 3、Treg细胞的常用的分子标记 ?CD25:Treg细胞调节机体免疫系统平衡，增加免疫耐受。研究表明，多种T细胞分子抗原参与Treg细胞的特异性功能效应。传统鉴定Treg细胞主要是通过CD4和CD25来标记。但随着研究的进一步深入，发觉只通过CD4+CD25+双阳性来定义的Treg细胞并不完全准确 ?FOXP3: FOX(forkhead box)是脊椎动物叉头样转录因子的总称，是一个具有多种功能的转录因子大家族，通常和细胞生长发育的调控有关。FOX 家族成员都有一个叉头样结构域，能与DNA结合。FOXP3是叉头样转录因子家族中的成员，2001年由Brunkow等首次报道。研究发现，它的表达及 功能与调节性T细胞(regulatory T cells，TR细胞)密切相关。如果FOXP3基因发生突变，将影响TR细胞的发育成熟，导致IPEX综合征(immune dysregulati on，polyendocrinop -athy，enteropathy，X linked syndrome)。 FOXP3主要表达于胸腺、脾脏和淋巴结等淋巴器官和组织。在小鼠特异性表达于CD4+CD25+T细胞，而不表达于CD8+T细胞。在人类FOXP3不仅可表达于CD4+CD25+T细胞，还可表达于CD8+CD28-T细胞。但在CD4+T细胞中的表达明显高于CD8+T细胞。目前，Foxp3(forkhead box P3，Scurfin)是目前公认的Treg细胞的最敏感的。 ?CD127:最近发现通过表达CD4， CD25和传导信号FoxP3来定义调节性T细胞时，在一类特殊的细胞群体时会出现问题。我们发现IL-7受体(CD127)在外周血CD4+T的一个亚群中会下调表达。我们证实这些细胞FoxP3阳性，且这群细胞包括那些CD25弱阳性或阴性群体。联合使用CD4，CD25和CD127可得到高纯度的调节性T细胞，比以前的通过其他标志物来区分方法显著提高。这些细胞在功能抑制实验中可发挥高度抑制功能。实际上， 通过CD4和CD127表达来区分的细胞 数量(包括CD25+CD4+和CD25-CD4+)三倍于通过CD4+CD25hi区分的调节性T细胞亚群。最后，我们使用CD127定量检测I型糖尿 病病人调节性T细胞，发现CD127可作为人调节性T细胞的标志物。 4、FOXP3流式检测方法 美国eBioscience公司是最早拥有FOXP3流式检测抗体的公司之一，公司通过不断改进和优化，建立了一套完美的针对FOXP3流式检测特殊的试剂和。 (1) 实验 实验设备 1) 流式上样管 2) 混匀振荡器 3) 离心机 4) 移液器、Tips 5) 流式细胞仪 所需试剂 1) 细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂(CD4、CD25或CD8等) 2) FOXP3荧光标记抗体 3) 溶血素:(eBioscience目录号00-4333)用于裂解红细胞 淋巴细胞分离液:若样品为人的全血，建议先用分离液分离出单个核细胞后再做后续检测 5) 固定剂和破膜剂:(eBioscience FOXP3检测专用试剂，目录号为00-5521或00-5523;在FOXP3染色前，将其中的Fixation/Perme -abilization Concentrate和Fixation/Permeabiliza tion Diluent以1:3的比例混合，配制好的溶液保存时间不要超过一天) 6) 其他试剂:Flow Cytometry Staining Buffer(00-4222)或PBS，Permeabil -ization Buff er(Cat.No 00-8333)等 (2) 实验操作步骤 注:对于不同的FOXP3克隆号抗体，在操作上可能存在着一些细微的差别。具体实验时， Foxp3 (clone PCH101, cat. XX-4776).请参考相应的抗体说明书上的操作步骤。此操作以人 为例。 61) 在每个流式上样管中加入100ul准备好的细胞悬液，细胞数约为1x10个。 2) 按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原(如CD4、CD8、CD25等)。 3) 用预冷的Flow Cytometry Staining Buffer或预冷的PBS洗涤细胞。 4) 旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)，并再次旋涡混匀。 5) 避光4?孵育30-60分钟。 6) 加入2ml Permeabilization Buffer(Cat.No 00-8333)工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。 7) 重复第5步操作洗涤细胞。 8) [可选]加入稀释好的2%(2ul)的正常大鼠血清(用Permeabilization Buffer工作液进行稀释)100ul，在避光4?孵育15分钟 9) 封闭液无需洗去，直接加入稀释好的荧光标记FOXP3抗体(用Permeabilization Buffer 工作液进行稀释)20ul，避光4?孵育至少30分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。 Cat.No 00-8333)工作液离心洗涤细胞并弃去上清10) 加入2ml Permeabilization Buffer( 液。 11) 重复上一步洗涤细胞。 12) 用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，并上机检测并分析。注:由 FSC/SS于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此C图中圈门时需要做一定调整。 调节性T细胞(Treg) 是近年来免疫学领域研究的热点，其具有免疫应答低下和免疫抑止两大特征，通过“主动”的方式抑止免疫系统——发挥免疫负调作用。现已证实，除CD4Treg外，部分CD8 T细胞也为Treg。根据来源及作用 机制，Treg可分为天然产生的CD4+CD25+Treg(自然调节性T细胞，nTreg)和诱导产生的适应性调节T细胞(aTreg或iTreg)，如Th3、Trl细胞，另外尚有CD8Treg细胞等，现简述如下。 (1)CD4+CD25+Treg:CD4+CD25+Treg除表达CD4分子和CD25分子外，其特征性标志为Foxp3+。Foxp3又称叉头状,翅膀状螺旋转录因子，在调控调节性T细胞的发育中起重要作用，且对其发育和功能是必要的。Scurfy小鼠的淋巴细胞增殖病和Foxp3基因敲除小鼠引起的疾病与人类的X染色体连锁的自身免疫性变态反应失调综合征(XLAAD)疾病非常相似，且Foxp3-,-小鼠不显示CD4+CD25+Treg活性。因此，FoxA:是CD4+CD25+Treg发育的一个重要调控元件。 CD4+CD25+Treg可抑止免疫系统及相关免疫细胞的功能和活性，从而发挥免疫负调节作用。同时，TGF-p也可诱导CD4+CD25+Treg的增生。已有研究表明，CD4-CD25+Treg能以细胞因子依赖(1L-10和TGF- p)和非细胞因子依赖——细胞接触(机制不详)两种机制发挥免疫负调作用。 CD4+CD25+Foxp3+Treg的分化 F。xp3+Treg可以从胸腺直接分化～ 也可在TGF-9作用下从F。xP3—T细胞分化。 (2)αTreg:由多种成分在外周诱导产生，包括Trl、Th3等细胞，主要以细胞因子依赖(1L-10和TGF-p)发挥免疫负调作用。 调节性T细胞 免疫负调(免疫抑制)是免疫系统重要的调节机制，在维持自身耐受、自身稳定中起了极其重要的作用。以上讨论的调节性T细胞就是这种负反馈调节机制最好的证据。 肝癌微环境中CD4+CD25+Treg细胞与肿瘤免疫细 胞的关系 发布时间:2008-03-10 来源:安徽省医学协会信息中心 作者:陈中 晏建军，倪家连，刘鲁岳，黄亮，严以群 【摘要】 ,目的, 探讨肝癌微环境中Treg细胞的数量增多与HCC临床分期晚的可能原因。,方法, 双 CD4+T)细胞重酶标免疫组织化学方法检测52例HCC组织中CD4+CD25+Treg细胞以及CD4+CD25-T( 分布，免疫组化EnVision法检测20例HCC组织中CD8+T细胞分布。,结果, 正常肝脏组织中未发现 Treg细胞，HCC组织中Treg细胞数量较癌旁组织明显增多(P=0.000)，且肝癌组织中Treg细胞的数量与 其浸润性CD4+T淋巴细胞的数量以及CD4+T/CD8+T比值呈显著负相关(r,-0.539，P,0.014;r,-0.545， P,0.000)，而与浸润性CD8+T淋巴细胞的数量无明显相关性(r=-0.403，P=0.078)。,结论, Treg细 胞在体内可能通过细胞接触的方式抑制CD4+T 淋巴细胞的增殖来抑制肿瘤局部的免疫，去除或减少HCC 微环境中浸润性Treg细胞数量可能提高肿瘤局部免疫治疗效果。 【关键词】 CD4+CD25+调节性T细胞 癌 肝细胞性 肿瘤浸润 淋巴细胞 Correlation between the Distribution of CD4+CD25+ Regulartory T(Treg) Cells and T-cell Infiltration in Microenvironment of Hepatocellular Carcinoma Abstract: ,Purpose, To explore the causes of an increased prevalence of regulartory T(Treg) cells in microenvironment of hepatocellular carcinoma(HCC) which involved in TNM stage according to disease progression. ,Methods, The CD4+CD25+ Treg and CD4+CD25-T (CD4+T) cells in the slides tissues of 52 cases with HCC were marked by Double-immunohistochemical, and CD8+T cells in the slides tissues of 20 cases with HCC by EnVision. ,Results, There was no Treg cell in normal liver tissues. The number of Treg cells in the tissue of HCC was significantly more than that in the tissue of peri-cancer(P=0.000). The number of Treg cells in HCC tissue was negatively correlated to the ratio of CD4+T/CD8+T and CD4+T cells infiltration (r,-0.539，P, 0.014;r,-0.545，P,0.000), however, with no correlation to CD8+T cells infiltration(r=-0.403,P=0.078). ,Conclusions, Treg cells possibly suppress proliferation of CD4+T cells in a contact-dependent manner so that tumor cells can escape immune surveillance and result in invasion and progression. Functional deletion of tumor-infiltrating Treg cells in microenvironment of HCC can enhance tumor-specific immunotherapy. Key words: CD4+CD25+ regulartory T cell; hepatocellular carcinoma; tumor infiltrating;lymphocytes 肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是指位于原发和继发肿瘤细胞周围的淋巴细胞，主要由T 细胞组成。TIL具有杀 伤肿瘤细胞、降低转移潜能的作用，因其与肿瘤细胞密切接触而被认为是机体对肿瘤识别的直接而特异的 表现，肿瘤组织中浸润免疫细胞数量和功能的变化在一定程度上反映了机体抗肿瘤反应的强度和总体水平。 本研究用双重酶标免疫组织化学的方法检测肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)微环境中CD4+CD25+ (regulatory T，Treg)细胞、CD4+CD25-T(CD4+T)细胞的数量分布以及两者真实浸润状态，用免疫组 化方法检测HCC组织中浸润免疫活性细胞分布，探讨HCC微环境中Treg细胞的分布与肿瘤微环境浸润免 疫活性细胞的关系，研究肿瘤发生的可能机制，为肿瘤的局部免疫治疗提供新的治疗思路。 1 材料与方法 1.1 研究对象 东方肝胆外科医院2004年12月至2005年5月手术患者经病理学检查证实HCC标本52例(均包括肝 癌组织以及癌旁组织)，取材时癌旁组织为距癌结节2cm以内的肝组织;避开坏死区，术前均未接受包括 经肝动脉栓塞化疗在内的任何其它治疗。男性42例，女性10例，年龄29岁~71岁(平均49.2岁)。正常 肝组织8例，取自肝血管瘤、肝囊肿的周围正常肝组织，男性3例，女性5例，年龄27岁~57岁(平均42.4 岁)。所有研究对象均无糖尿病、类风湿、甲状腺功能亢进等自身免疫性疾病史以及免疫治疗史。 1.2 主要试剂 小鼠抗人CD4单克隆抗体(DAKO公司生产)，使用时用抗体稀释液稀释为1?100;小鼠抗人CD25单克隆抗体(DAKO公司生产)，使用时用抗体稀释液稀释为1?200;即用型羊抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP)标记的EnVision二抗(DAKO公司生产);生物素化羊抗兔IgG和链酶亲合素标记的碱性磷酸酶，使用时均稀释液稀释为1?200( Zymed公司生产);小鼠抗人CD8单克隆抗体(DAKO公司生产)，使用时用抗体稀释液稀释为1?100。 1.3 实验方法 采用双重酶标免疫组织化学。苏木素衬染色，热水蓝化;吹干后，树脂封片;将切片置于显微镜下采用盲法进行观察，先在低倍镜下观察整张切片，随机选择5个高倍视野(×400)计数阳性细胞，并求平均值。 1.4 统计学处理 对各种组织中的Treg细胞的分组计数结果以均数?差(x?s)表示，应用SPSS 11.0统计软件采用非参数检验方法Mann-Whitney T法对数据进行检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 8例良性肝病周围正常肝组织中未发现Treg细胞，52例HCC组织以及癌旁组织Treg细胞单个高倍视野平均数分别为7.6308?2.8368、5.1654?1.6718;两组比较存在显著性差异(P,0.000);而且在HCC组织中Treg细胞数量随着临床病理分期的进展而增多，18例?期、22例?期、12例?期各组Treg细胞单个高倍视野平均数分别为6.7333?1.5980、7.8818?2.4171、8.5167?2.2480，统计学上有显著性差异(P=0.000);癌旁组织中Treg细胞多数以散在方式分布，而在癌组织中以簇丛状方式聚集分布于肿瘤间质内与CD4+T细胞伴行，并与之紧密接触。20例HCC组织、癌旁组织中CD4+T/CD8+T比值分别为0.3687?0.0805、0.5301?0.0919，肝癌组织较癌旁组织明显降低，差异有统计学意义(P,0.022);20例肝癌组织中Treg细胞的数量与其浸润性CD4+T淋巴细胞的数量，以及CD4+T/CD8+T比值呈显著性负相关(r,-0.539，P,0.014;r,-0.545，P,0.000)见图1、2，而与浸润性CD8+T淋巴细胞的数量分布无明显相关性(r=-0.403，P=0.078)。 3 讨 论 在控制具有免疫原性的肿瘤细胞生长过程中，T细胞介导的免疫应答起着重要的作用。对于许多恶性肿瘤尤其是早期病例，在局部出现免疫抑制的状态下而全身免疫并无缺陷，因此通过检测患者外周血的免疫细胞分布来判断宿主的免疫反应并不完全。在局部抗肿瘤免疫中，TIL起着重要的作用。它在患者体内处于机体免疫系统与肿瘤相互作用的最前沿，其组成和功能等在一定程度上反映了机体抗肿瘤反应的性质、强度和总体水平。T 淋巴细胞亚群之间的细胞平衡是维持免疫系统内部环境稳定的中心环节。CD4+T/ CD8+T比值保持动态平衡，以维持机体细胞免疫功能的稳定，当其比值降低，则患者细胞免疫功能低下，从而有利于肿瘤增殖[1]。本实验结果发现，癌旁组织中CD4+T细胞数量较癌组织明显增多，差异有显著性意义，而癌旁组织CD8+T细胞数量较癌组织少，差异无统计学意义，且癌旁组织CD4+T/CD8+T比值较癌组织升高，差异有显著性意义(P<0.05)。该结果提示HCC组织局部CD4+T细胞数量和CD4+T/CD8+T比值的降低，造成了 T 淋巴细胞数量异常，改变了组织局部免疫微环境，免疫抑制逐渐加重，免疫监视功能减弱，有利于肿瘤细胞增殖，从而有利于肿瘤的进展、侵袭或转移。 体外肿瘤浸润淋巴细胞具有一定的抗瘤活性，过继免疫治疗是将免疫细胞经体外分选激活，然后回输体内的治疗方法，尽管用各种方式激活TIL进行过继免疫治疗，但至今未表现出理想效果。研究显示恶性肿瘤患者的免疫系统在肿瘤局部和全身都处于耐受或缺陷状态。研究表明在诱发阶段调节性T细胞诱导TIL发生免疫偏倚，有的则因Treg数量显著增多使TIL几无功能，使TIL的抗瘤免疫陷入困境[2]。在以细胞免疫为主的肿瘤免疫过程中，Treg处于关键环节，它在肿瘤组织中的浸润程度代表了机体肿瘤免疫抑制反应的一个方面，在机体免疫调节中起重要作用，决定免疫反应的最终走向是激活免疫还是诱导耐受。本实验研究了肝癌组织中Treg细胞数量与CD4+T以及CD8+T、CD4+T/ CD8+T比值之间的关系，发现肝癌组织中Treg细胞数量与CD4+T细胞数量以及CD4+T/CD8+T比值呈显著性负相关，而与CD8+T细胞数量无明显相关性，提示HCC组织中Treg细胞可能通过抑制CD4+T细胞的增殖，导致T 淋巴细胞亚群之间的 平衡被破坏。众所周知，CD4+T/CD8+T比值在机体免疫反应及免疫调节中具有重要作用，其变化反映出 机体免疫状态的变化，肿瘤组织和癌旁组织的TIL中该比值的下降表明愈接近肿瘤部位细胞免疫受抑制愈 明显。因此我们认为HCC局部TIL的这种分布特征改变了组织局部免疫微环境，免疫抑制逐渐加重，免疫 监视功能减弱，有利于肿瘤细胞增殖。 目前对Treg细胞的效应机制还不明确，实验结果也存在矛盾。有些实验支持Treg细胞是通过与细胞接 触发挥抑制作用;另一些研究表明Treg通过分泌细胞因子(IL-10、TGF-β)而介导抑制效应。我们研究发 现HCC微环境中Treg的分布具有异质性，癌旁组织中Treg大部分以散在方式分布，而在肿瘤组织中大多 Treg呈簇丛状分布，与效应性T淋巴细胞相伴，这些分布在肿瘤组织中的Treg由于与效应性T淋巴细胞 的紧密接触，抑制效应性细胞的功能，从而发挥抗肿瘤免疫作用。提示Treg可能是通过细胞与细胞之间的 紧密接触发挥其抑制作用。 近年来，肿瘤的免疫治疗包括肿瘤疫苗以及TIL细胞过继免疫治疗已经过大量的试验，但其抗肿瘤作用 是有限的[3，4]。Treg细胞尤其是肿瘤微环境中数目增多是肿瘤免疫治疗亟待解决的问题之一。研究表明， 通过去除机体Treg细胞可以提高肿瘤疫苗的抗瘤效应[5]，进一步了解Treg细胞调节机制或控制Treg细胞 增殖的方法可以设计更有效的抗肿瘤免疫疗法。 【参考文献】 [1] Ohwada S, Iino Y, Nakamura S, et al. Peripheral blood T cell subset as a prognostic factor in gastric cancer[J]. Jpn J Clin Oncol,1994, 24(1):7-11. [2] 傅志旋,陈晓耕, 刘振华. 肿瘤浸润淋巴细胞的抗肿瘤免疫困境[J]. 国外医学?肿瘤学分册, 2004,31 (3):183-186. [3] Kono K, Takahashi A, Ichihara F, et al. Prognostic significance of adoptive immunotherapy with tumor-associated lymphocytes in patients with advanced gastric cancer: A randomized trial[J].Clin Cancer Res,2002,8(6):1767-1771. [4] Kono K,Takahashi A,Sugai H, et al. Dendritic cells pulsed with HER-2/neu-derived peptides can induce specific T-cell responses in patients with gastric cancer[J]. Clin Cancer Res, 2002, 8(11):3394-3400. [5] Yu P,Lee Y,Liu W,et al. Intratumor depletion of CD4+ cells unmasks tumor immunogenicity leading to the rejection of late-stage tumors[J]. J Exp Med, 2005, 201(5):779-791.