浅论n-乙酰-d-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆、表达及产物纯化

浅论n-乙酰-d-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆、达及产物纯化 浅论N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆、表达及产物纯 化 浅论N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆、表达及产物纯 化 作者:余云彦，张卫星，闫欣欣，唐琴琴，刘乃华，晏永波，李校， 林绍强【摘要】 目的 :从猪肾中提取RNA，从中克隆出N-乙酰-D- 葡萄糖胺-2-差向异构酶(GNE)基因，并在大肠杆 菌E.coli BL21(DE3)中表达。:从猪肾中提取总RNA，通过RT-PCR克隆出 GNE基因，经测序，感受态大肠杆菌E.coli DH5a转化，质粒抽提， 鉴定以及大肠杆菌BL21(DE3)转化表达，通过His-tag亲和纯化 (NiSepharose 6 Fast Flow)，G-25柱脱盐，SDS-PAGE电泳检测。结 果:RNA提取物经紫外分光光度计检测OD260/OD280=1.77，无明 显的蛋白质和酚污染。RT-PCR扩增目的片段，测序证明该基因的ORF 为1 206 bp， 编码402个氨基酸组成的酶蛋白(GNE)。SDS-PAGE 显示，纯化蛋白为45 kD的单一条带，与基因序列推测值一致。结论: GNE基因已被成功地克隆和表达。 【关键词】 N-乙酰-D-萄糖胺-2- 差向异构酶;基因;克隆;纯化;猪 Abstract: Objective: To clone the gene of N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerase according to RNAextracted from pig kidney and express it in E.coli BL21 (DE3) and then purify the product. Methods:RNA was extracted from porcine kidney to clone the gene of N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerase withRT-PCR followed by sequencing. Recombinant plasmid was converted into E.coli DH5a and to identifyit followed by the conversion of the recombinant plasmid in E.coli BL21 (DE3) and expression. Theprotein was purified by His-tag (Ni Sepharose 6 Fast Flow)，desalted by G-25 column and identifiedby SDS-PAGE. Result: RNA was extracted from porcine kidney and identified with ultravioletspectrophotometer:OD260=0.0346，OD280=0.0195， OD260/OD280=1.77 (between1.7 and 2.2)， it showedthat there was no protein and phenol contamination. Amplification of GNE with RT-PCR，the sequencelength of GNE was 1 206 bp encode for 402 amino acids. The molecular weight of purified proteinwas 45 kD revealed by SDS-PAGE， which was consistent to the analysis based on gene sequence.Conclusion: N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerase gene is successfully cloned and expressed in E.coliBL21(DE3). Key words: N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerase;gene;cloning;purification;pig N-乙酰-D-神经氨酸(N-Acetylneuraminic acid，Neu5Ac) 的酶法合成主要以N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)与丙酮酸为底物，在 Neu5Ac醛缩酶(Neu5Ac aldolase)的催化下生成Neu5Ac[1]。为克服 ManNAc价格昂贵的问题，通过碱性条件或使用N-乙酰-D-葡萄糖胺 -2-差向异构酶(GNE)使廉价的N-乙酰-D-葡萄糖胺转化为ManNAc。用 Neu5Ac醛缩酶，以ManNAc和丙酮酸为底物进行Neu5Ac酶法合成， 已有多篇报道[4-6]。酶法合成具有转化率高、提取简单、产品 纯度高、环保等优点，鉴于醛缩酶可以从重组微生物中获得，人们倾 向于以此方法来生产Neu5Ac。1996年，Maru等人从猪肾中成功克隆 出了GNE，该酶的克隆对两步酶法生产Neu5Ac带来了希望，而GNE 是酶法合成Neu5Ac最为关键的限速酶[10-11]。本研究从猪肾中克隆 出GNE基因，将该基因克隆至表达载体pET28(b)并转入至大肠杆 菌 E.coli BL21(DE3)中表达，并对其表达产物进行了纯化[]。 1 材 料和方法 1.1 材料 质粒、菌株及工具酶:质粒 pBluescri-ptIIKS(+)、pET28(b)(中国科学院上海生命科学研究院杨 晟教授惠赠);菌株E.coli DH5a、E.coli BL21(DE3)、限制性内切酶 EcoRV、NdeI、EcoR I、T4DNA连接酶和碱性磷酸酶(CIAP)为Takara 公司产品，引物由Takara公司合成。试剂及动物材料:RT-PCR试剂 盒、质粒抽提试剂为Takara公司产品;Ni Sepharose 6 Fast Flow 购自GE Healthcare;咪唑、尿素为Sigma产品;EDTA、Disodium Salt、 0.5 MEDTA(pH .0)、NaCl、Triton X-100、Tris-Hydrochloride、 Ammonium persulfate均购自Promega公司;氯霉素购自Amresco，LB 培养基、其他试剂为进口分装或国产;新鲜猪肾购自农贸市场。 1.2 实验方法 1.2.1 Trizol法提取总RNA:取适量组织置1.5 mL离心管中，加入Trizol匀浆，室温静置5 min;加入0.2 mL氯仿，静置，4 ?离心，取上清;加入0.5 mL异丙醇，静置，4 ?离心，弃上清;加入1 mL 75%乙醇，洗涤沉淀，4 ?离心，弃上清，重复一次;晾干，加入DEPC H2O溶解(65?促溶)。 1.2.2 总RNA定量:RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260 nm波长处有最大吸收峰。用分光光度计测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/mL的单链RNA。根据OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:RNA(mg/mL)= 40×OD260 读数×稀释倍数(n)/1 000 1.2.3 RT-PCR与RT-PCR产物的测序及分子量鉴定:根据相关报道设计以下一对PCR引物:正义链:catatggagaaggagcgcgaa反义链:gatatctaggcgaggcggctcagca下划线部分为NdeI和EcoRV的酶切位点。反转录聚合链式反应(RT-PCR)扩增得到两端分别为NdeI和EcoRV的E酶基因片段。进行RT-PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳回收，测序结果在NCBI网站进行blast分析。50 ng左右的回收DNA进行电泳，参照分子量，估计DNA样品的分子量。 1.2.4 携带epi基因重组质粒PRYepi的构建:将扩增得到的epi基因片段以平端连接进入 EcoRV酶切 pBluescriptIIKS(+)载体，再将该中间载体用NdeI和EcoR I双酶切，凝胶电泳后，胶上回收目的片段，与同样酶切的载体PET28(b)片段混合T4连接酶16 ?连接过夜，得到表达载体PRYepi。