【doc】大鼠心、脑、骨骼肌毛细血管染色方法比较

【doc】大鼠心、脑、骨骼肌毛细血管染色比较 大鼠心、脑、骨骼肌毛细血管染色方法比较 第23卷第2期 2001年2月 第三军医大学 A(AACADEMIAEMEDlC【NAEMILIT.M~dSTEIiTIAE Vf11.23No2 Feb.200I237 丘章编号:l?0.5404(200t)024Y237.03 大鼠心,脑,骨骼肌毛细血管染色方法比较 技术方法 ComparisonofstaiIljJ瞎methodsforvisualizingcapillaryinheartbrainandskeletal muscleofrats 黄度愿.,史景泉,高钰琪.,刘福玉..孙秉庸.(第三军医大学:-高原军事医学系高原医学研究室,病理生理学教研室 附属西南医院病理学研究所;重庆400038) 提要:目的对大鼠心,瞄,骨骼肌毛细血管染色方法进行比较.方法采用MATPase,碱性磷酸酶,肌球蛋白一ATPa:~等 酶组化法及墨计灌注法和v?.因子相关抗原免疫组化法对毛细血管进行染色.结果心脏和脑组织毛细血管用碱性磷酸酶染色, 而骨骼肌组织毛细血管用肌球蛋白-ATPase染色效果最好;?一因子相关抗原免疫组化法用于脑组织毛细血管显示次之;"-ATPase 法在心脏,脑,骨骼肌定位效果较差;墨汁灌注法只要方法掌握得当.各部位毛细血管显示均较好结论对毛细血管染色.不同器 官和组织应采用不同的方法.在心脏和瞄用碱性磷酸酶组化法显示较好,而在骨骼肌用肌球蛋白一ATPose酶组化法较好. 可用于显示器官组织微血管构筑的方法很多,如: 灌注色剂,x.线造影,血管铸型及针对微血管结构中的 特异成分即微血管标志物进行染色的各种组织化学方 法等.为从这些方法中找出能显示大鼠心脏,脑和骨 骼肌组织毛细血管的快速,简便,准确,可靠的方法,我 们分别用墨汁灌注法,?因子相关抗原免疫组化法, MeATPase,碱性磷酸酶(Alkalinephosphata:,~,ALP), 肌球蛋白.ATPase(Myosin-ATPase,n~_TPase)进行了染色 和比较. 1与方法 ~gristar大鼠(本校实验动物中心提供),体重180 18只健康 , 220g雌雄不拘,分别进行如下实验. 1.1墨汁灌注 5只大鼠用戊巴比妥钠麻醉,剪开胸腔.经心行主动脉插 管,用0.1%肝素生理盐水冲洗后,注^碳素墨水,低分子右旋 糖苷,30%甲醛混台液(--者7:2:1混合过臆).标本放置2h 后,取脑和腓肠肌的外删头A10%甲醛溶液中固定24b.经石 蜡包埋,冠状(脑组织)或横断(腓肠肌)切片,切片厚7舢,脱蜡 透明后DPX封片.另取5只大鼠.经主动脉逆行插管行心脏灌 注,同其它动物一样取材.在心脏中部冠状切片. 1.2组化染色 8只大鼠用3%戊巴比妥钠麻醉.速取完整的心,脑及腓肠 肌外侧头.心脏在左室最宽部位横断;脑在海马部位横断;腓 肠肌外侧头在其红色部分切3,5Iltt/l长.3种组织于液氨预玲 的异戊烷中速冻,,了n?保存做12yra厚连续横断冰冻切片 (一20oc),风扇吹干,进行下列染色. 基金项目:国家自然科学基金重点资助项目(39730190) 作者筒:黄废愿(1967一)男,山东省莱芜市人.博十,讲师.主要从事高塬 缺氧习服适应方面的研究.发表8篇=电话"ff23)68752340 收稿日期:2000~7.15;恬回13期:2001.Ol438 J2.】酶组化染色?ALP染色:采用四唑盐法,蓝色示 酶活性部位:?rrAl'Pase染色,:黑色为阳性反应产物.? M一一ATPase组化染色:采用Waehslein和Meisel法.棕褐色 沉淀示酶活性部位 上述酶组化染色方法均按不同要求作相应的组化方法对 照I: I.22?一目子相关抗原免疫组化染色采用sarItaCnlz公 司兔抗人?_因子相关抗原多抗(使用效价为I:100),S-P法.根 据试剂盒(北京中山生物技术公司)说明进行检测,DAB显色. 棕褐色为阳性反应产物.3%一甲醇封闭内源性过氧化物 酶.PBS代替一抗作阴性对照. 2结果 2.1心脏,骨骼肌毛细血管染色 在光镜下,心脏,骨骼肌用ALP法显示的微血管呈蓝色点 状(tL,肌的内,外层及骨骼肌的横断面)或线状(心肌的中层), 十分清晰,密集.对毛细血管的显示教果良好,见圉1.骨骼肌 rnATPase染色,毛细血管呈黑色点状,清晰,定位效果好,见图 2.一ATPas浩显示的微血管呈棕色,管壁结构完整,但除 了血管着色外.部丹肌膜亦出现着色.故用M.ATPase法显示 的微血管定位效果不及ALP法好,见圉3.?一因子相关抗原免 疫组化染色,在心脏和骨骼肌组织易出现背景着色.墨汁灌注 法在有些部位显示血管较好.但常出现充盈过度,血管破裂或 充盈不足等现象. 2.2脑组织毛细血管染色 ALP法显示海马微血管呈蓝色.结构较完整,清晰,呈点 状,线状或短树枝状,对毛细血管的显示效果良好,见圈4. 一 ATPase法在脑的着色呈棕黑色,但除了部分血管着色外. 明显地有其它非血管物质着色,定位效果不好,管壁结构不清 晰.墨汁灌注法对海马毛细血管显示较好.但常出现充盈过 度,血管破裂或充盈不足等现象.?一园子相关抗原免疫组化 染色海马微血管呈棕色,血管结构完整,呈线状或短树枝状,对 毛细血管的显示较好: 第一军医太学第23卷 图1碱性磷酸酶组化法示心肌微血管呈点状或线状lhi,P~l00) 图2肌球蛋白-ATIXase法示骨骼肌毛细血管呈黑色(nra_TPa~×200 3讨论 图3M-ATlXase法示骨骼肌血管.障血管着色外.部分肌膜亦出现着色c一一^1T× 100 图4碱性磷酸酶组化法示海马区脑组织傲血管呈点状线状或短树枝壮(AI×40) . ALP法是利用酶组织化学方法显示微血管较早就 获得成功的范例,并适用于多种器官,但此酶在 同类动物不同器官或者不同娄动物的相同器官的血管 内皮细胞中酶的活性不同,不是任何组织的毛细血管 都能染上.AIP法也可以显示骨骼肌毛细血管但 HmLsen-Smith等报道在新生儿发育过程时,胸锁乳突 肌的毛细血管ALP表达很弱缺氧时,骨骼肌毛细血 管ALP的表达落后于毛细血管的生长..ALP可能是 成熟毛细血管内皮细胞的标志物,新生的毛细血管可 能并不表达在光镜下,心肌和骨骼肌用ALP法显示 的微血管呈蓝色点状或线状,海马微血管呈短树枝状, 十分清晰,密集,结构较完整,对毛细血管的显示效果 良好 骨骼肌nrATPa,,e法显示的毛细血管呈黑色,定位 效果好,便于图像,是显示骨骼肌毛细血管最常用 的方法.该法不仅可以显示毛细血管,而且通过改 变预孵液的DH值,可以对骨骼肌肌纤维进行分类. 预孵液的pH值是决定毛细m管显色及不同类型肌纤 维染色深浅的主要因素 Mg2.ATPa.~法也可以用来显示微血管,但从我们 所染的大鼠心,脑,骨骼肌毛细血管结果来看,该法对 毛细血管的显示不够理想,定位效果不好.说明Mg-"一 ATPase可能并不是毛细血管内皮细胞所独有. ?一因子相关抗原免疫组化染色虽然被广泛用来 显示人心肌组织毛细血管及多种肿瘤组织的毛细血 管,但在正常大鼠心肌和骨骼肌组织的毛细血管上表 达较弱…,常规免疫组化染色易出现明显的非特异性 着色另外,毛细血管上的?.因子相关抗原可受许多 因素的影响,如在放射损伤后,大鼠心肌组织血管内皮 表达?.因子相关抗原增多--在脑组织.?.因子相 关抗原免疫组化染色海马微血管呈棕色,血管结构完 整,呈线状或短树枝状,对毛细血管的显示较好.但该 法与ALP法相比较,操作较为繁琐. 与上述各种组化方法相比,墨汁灌注法虽然古老, 但只要注意掌握灌注方法和灌注压力,可以获得较好 的效果,但墨汁灌注法也有其不可克服的缺点:向血 管内灌注有色物质,由于受颗粒大小的限制,很可能不 能进八比较微细的毛细血管内,也由于受灌注压力的 影响,会使血管壁产生某些程度的扩张,导致不能准确 测量血管直径. 总之,对毛细血管染色,不同器官和组织应采用不 同的方法.经比较发现,在心脏和脑用碱性磷酸酶组 化法显示较好,而在骨骼肌用肌球蛋白.ATPase酶组化 第23卷第2期 2001年2月 第三军医大学 ACFAACM)EMIAEMEDICINAEMIIrrARTE咖AE VoI23.No2 F200I239 法较好. 关键词:毛细血管;染色方法;大鼠 中图法分类号:R446文献标识码:B 参考文献 ll:杜申民.室用组织学技术:M]第2版北隶:人民_J生出版朴, L998l32一l. 12[JttdA.KemP]DMyoffbrill~Ihist~.hemistblmLske1"… des:A1wo-tensm"quantitativeappm~'h[J:JHis~-heanf ehem.L99139l2):589—597 3JSkcrj~eDJ~etfnski{l肿G,ats哪eml…inapll— larirationandmJ【0chl川口1msin】h州uIcY—stimulatedrabbit ~leLJJ^mJPhysi,1998,274(6Pt?:(2810C8L8. :4:陈啸梅.同文郁,彭惶云.等组织化学[M:北京:人民卫生出 版社,l982117—182 5]王有伟.陈慈碱性磷酸酶染色法(钙铅法)在研究人脑和心脏微 血管方面的应用[J]解剖学杂志,1986.9f2):227228 文章编号:1000-5404(2001)咀.0239~02 体外分离培养正常成人肝细胞的方法 6lXiez,c日0M.BatraSfThecap1]]afityofleftvenlficular【I洲eof ratss~tbjeetedtoco~lar~awcx'clusio~,[JCardiov~R,L997,33(2): 67L一676. 【JImMannnJC.VendelLM,lRM.Brainadaptati~tochtotdehTpo- 2243 bari~.]b,poxiain~L-[JJAPPl脚s.1,72(6):2238— l8H…一SrfithFM,Watslml,J【akGR?Ichangesinallary (1ensilyofratem,ntusele[J]AmJf?ol,1989,237(IP【2): H344? l9Hansen—SmithFM,BlaukwellLH,J【akGR.h晰lof?me c~)illaryalkalinephesphat~isaff~tedhypoxia[J, JApplPhysio1. 1992.73(2J:776一 【L0K~amaT.Xiez.c舯M.adaotivechange~inthecapillary"net一 in【he】n[nheartlJ].JpnJPhysid,1998.48(2):229— 241 11JKasperM,schobelR.Har~keG,da/.Disthbuti~啪Willebrand factorincap】laendolhelial【d【sofIlungswithpu】mfibrosis[J Ex[jTo.'dcalPathol,1996,48(1):283—288 (编辑薛国文) Studyonisolationandcultureofadulthepatocytesinvitro 技术方法 马巧玉,王宇明,郝飞,刘国栋(第三军医大学附属西南医院全军感染病研究所.重庆400038) 提要:目的探讨体外分离培养成人肝细胞的方法.方法用体外二步灌流法分离正常成』,肝细胞,用PRM[一16,10细胞培 养液维持培养1月以上.结果成人肝细胞可在体外被分离并存活1月卜.结论正常成人肝细胞可在体外分离培养以供各 种肝病基础和临床研究. 各种肝脏疾病(特别是病毒性肝炎,原发性肝癌) 在我国发病率高,无可靠治疗方法,因此,迫切需要在 肝脏疾病的发病机制及治疗方面有所突破.近年来. 国内外有许多关于用动物肝细胞,肿瘤细胞甚至胎儿 肝细胞进行肝脏疾病研究的报道,但这些细胞与自然 状态的成人肝细胞有较大差别,我们在体外分离培养 正常成人肝细胞,以期寻找与自然状态最为接近的,更 适宜于进行肝脏疾病的发病机制和防治研究的细胞 模型. 1材料和方法 ll主要材料 I11正常成人肝组织标本取意卦死亡之3例成年男性 (19,24,35岁),1例成年女性【27岁j肝脏.均无肝病史,临床生 化和病理检查无异常,各种肝炎病毒标志物,MH检测均阴性: 1I.2试剂小牛血清由本校试剂中心提供.用前56?x . 30min灭活补体.PKMI.1640培养基购自美国GIBO0公司:胶 基金项目国家自然科学基台资助I面目f39771)682) 作者简乌巧(L963J生,浙江省义乌市人.碗士.主治帅,讲帅,主要 从事H接心区多肚坩m抑制作用方面的研究.发表论文6 篇电话:(OZ3)68752679 收稿日期:20304)4-15;惨回日期:2DCe4~.2】 原酶,胰蛋白酶抑制剂由美国SIGMA公司提供.分散酶购自德 国宝灵曼公司 1.2买验方法 1.2.I正常成』,肝细胞分离采用体外二步灌流法分离正 常成人肝细胞:取肝脏100g,将肝组织置于培养皿中.用 37含Ca2一,Maz'前灌流液自残存血管中反复灌注.至大部分 肝脏呈现灰白色,用37?,0.05%的胶原酶(台0I%分散酶) 反复注人残存血管,剪碎肝组织,37震荡,消化30min,3层无 菌沙布过滤,450r/rainx4min离心,弃上清,反复3次,最后用 古10%4x牛血清RPM].1640培养液(完全培养液)按细胞密度 1x1/ml稀释后按5瓶,10n们筑分别接种至25mI,50mJ 培养瓶,置于37,5%c02培养箱孵育. 1.22正常成人肝细胞培养24h后换液,弃去含漂浮细 胞的培养液,按上述比例,加人RPMI-1640完全培养液,此后每 2—3d更换完全培养液1次,维持培养1月以上.于培养第 10,加,30天分别计数肝细胞数,台盼蓝染色确定肝细胞存 活率. 2结果 2.1细胞分离 由于肝组织为非全小叶标本,前灌液和胶原酶灌注仅可到 达部分肝组织,分离效果稍差,分离后用台盼蓝染色,肝细胞存