反义寡脱氧核苷酸对内皮细胞缺氧再复氧损伤组织因子表达的影响

反义寡脱氧核苷酸对内皮细胞缺氧再复氧损伤组织因子达的影响 反义寡脱氧核苷酸对内皮细胞缺氧再复氧 损伤组织因子表达的影响 血栓与止血学2005年第l1卷第3期?101? ? 论着? 反义寡脱氧核苷酸对内皮细胞缺氧再复氧损伤 组织因子表达的影响 尹俊.郑庆棠.谢舜峰.刘幸平 (.汕头大学医学院药理学教研室.汕头 (汕头大学医学院第二附属医院血液科.汕头 (汕头大学医学院第一附属医院普外科,汕头 (汕头大学医学院机能学实验室.汕头 5O4 5O4 504 5O4 摘要:目的研究反义寡脱氧核苷酸对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧再复氧损伤后组织因子(Tr)基因转 录和表达的影响.方法培养的HUVEC随机等分成为正常对照组,缺氧再复氧组,反义寡脱氧核苷酸转染组(AS/TF 组),正义寡脱氧核苷酸转染组(s/TF组)和错配寡脱氧核苷酸转染组(Se/TF组).设计合成针对人TF的反义寡脱氧 核苷酸(AS/TF),同时设计TF的正义寡脱氧核苷酸(S/TF)的错配寡脱氧核苷酸(Sc/TF)作为对照.用SuperFect TransfectionReagent(SF)作载体,将AS/TF,s/TF和Sc/TF分别转染AS/TF组,S/TF组和Se/TF组HUVEC,正常对照组 和缺氧再复氧组HUVEC只加sF,不转染任何寡核苷酸.将缺氧再复氧组,AS/TF组,S/TF组和Se/TF组HUVEC培 养24h后,充人氮气,缺氧条件下培养2h,正常条件下培养1h,完成缺氧再复氧模型的制作.收集各组HUVEC,用发 色底物法检测HUVEC表面TF的活性,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测HUVEC中的TF抗原(TF:AS).并用膨胀裂 解法分离细胞核,进行细胞核连缀反应(Run.onreaction)后,Bio.dot狭线印迹杂交检测HUVEC中的TFmRNA.结果 与未经缺氧再复氧的正常对照组HUVEC相比,经过缺氧再复氧的HUVEC表面TF活性明显增强(P<0.001),细胞 裂解液中的TF:As也显着增多(P<0.001),AS/TF组HUVEC的TF活性和TF:Ag的增加幅度低于缺氧再复氧组,s/ TF组以及Se/TF组(P<0.05,0.01).体外细胞核连缀反应后,Bio.dot狭线印迹杂交显示,HUVEC缺氧再复氧后TF 基因的转录增强,AS/TF组HUVECTFmRNA的转录弱于缺氧再复氧组,S/TF组和Sc/TF组.结论HUVEC缺氧再 复氧后,TF基因的转录和表达均显着增强,针对TF的反义寡脱氧核 苷酸能够明显抑制HUVEC缺氧再复氧损伤后TF 基因的转录和表达.提示TF反义寡脱氧核苷酸对于因TF水平升高 所致的血栓性疾病可能有潜在的治疗作用. 关键词组织因子;反义寡脱氧核苷酸;人脐静脉内皮细胞;缺氧再复氧 损伤 [中图分类号]R364.1[文献标志码]A[文章编 号]1009-6213(2005)03-101-05 EffectsofAntisenseOligonucleotideonExpressionofTissueFactorinCulturecHuman UmbilicalVeinEndothelialCellsInjuredbyAnoxia-reoxygention YINJun,ZHENGQins.tang2,XIEShun-feng3,LIUXing.ping4 (DepartmentofPharmacology,ShantouUniversityMeScalCollege,Shantou,515041,China) (DepartmantofHematology,theSecondHospitalAffiliatedtoShantouUniversityMeScalCollege,Shantou,515041,China) (DepartmentofGeneralSurgery,theFirstHospitalAffiliatedtoShantouUniversityMedicalCollege,Shantou,515041,China) (LabomtouyogExperimentalPhysiologicalSeiren~,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou,515041,China) Abstract:ObjectiveTissuefactor(TF)isacellularreceptorandeofaetorforthispaperhaveutilized an811tisenseoligodeoxynueleotide,directedagainsthumanTFmRNA,toinvestigatethefeasibilityofinhibiting thesynthesisofTFinculturedhumanumbilicalveinendothelialcells(HUVEC)injuredbyanoxia?reoxygen? ation.MethodsAntisenseoligodeoxynueleotide(AS/TF),senseoligodeoxynucleotide(S/TF)andscrambled oligodeoxynucleotide(Sc/TF)againsthumanTFweredesigned.CulturedHUVECwererandomlydividedinto normalcontrolgroup,anoxia?reoxygenationgroup,antisenseoligodeoxynucleotidetransfeetiongroup(AS/TF group),senseoligedeoxynueleotidetransfeetiongroup(S/TFgroup)andscrambledoligodeoxynueletidetrans? feetiongroup(Se/TFgroup).HUVECinAS/TFgroup,s/TFgroupandSe/TFgroupweretransfeetedwith AS/TF,S/TFandSc/TFrespectivelybyusingsuperfeettransfectionReagent(SF),andthoseinnormalcon? trolgroupandanoxia?reoxygenationgroupwereonlyincubatedwithSF,nottransfeetedwithanyoligedeoxynu? cleotide.24hourslair,HUVECinanoxia—reoxygenationgroup,AS/TFgro up,S/TFgroupandSc/TFgroup sufferedfrom2hoursofanoxia(37?,95%N,,5%CO,andculturemediumwa sfilledwithN,)flo?owedbyl hourofreoxygenation(normalculturecondition).Finally,HUVECin5groupswereeolleeteefordetectingthe ? 102?ChineseJournalofThrondaosisandHemostasis2005Vol11No3 TFactivityonthesurfacebyusingachromogenicassay,andtheantigenofTF(TF:Ag)bymeansofenzyme- linkedimmunsorbentassay(ELISA).NucleoliwereisolatedbylysingHUVECandunderwentrun-onreaction invitro,TFmRNAwasanalyzedbyusingBio-dotslotformatblotting.ResultsAfteranoxia-reoxygenation, theTFactivityonthesurfaceofHUVECandTF:Agincreasedsignificandy(P<0.001,comparedwiththe normalcontrolgroup).InNUVECofAS/TFgroup,however,TFactivityandTF:Agwerelowerthanthoseof S/TFgroupandSc/TFgroup(P<0.05, 0.01).Run-onassayshowedthatTFmRNAenhancedinHUVEC afteranoxia-reoxygenafion,whileinHUVECofAS/TFgroup,thetranscriptionofTFmRNAwasinferiorto thatofS/TFgroupandSc/TFgroup.ConclusionThetranscriptionandexpressionofTFgeneinHUVEC enhancemarkedlyafteranoxia-reoxygenation,andsenseoligodeoxynucleo tideagainsthumanTFinhibitsthe up-regulatedTFmRNAandTFantigenexpressioninculturedHUVECinjure dbyanoxia-reoxygenation.Itis indicatedthatantisenseoligldeoxynucleotideagainstTFmightbeapotential newstrategyforpreventionand treatmentofTF.inducedthromboticdiseases. Keywords:Tissuefactor;Antisenseoligodeoxynucleotide;Humanumbilic alveinendothelial ceUs:Anoxia-reoxygenationinjury 冠心病,糖尿病等血栓性疾病是目前常见的多发 病,其发生机制与凝血系统的激活密切相关.新近的 研究表明,血管内皮细胞受损后,合成和释放组织因 子(TF),导致凝血系统的激活在该类疾病的发生发展 中起重要作用…,因而如何抑制内皮细胞TF基因表 达是近年来该领域研究的热点.本研究将针对TF的 反义寡脱氧核苷酸(AODN)导人人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)内,观察AODN对HUVEC在缺氧再复氧损 伤过程中TF基因转录和表达的影响. 1与方法 1.1人脐脉内皮细胞的分离与培养无菌条件下取 健康产妇足月分娩儿的脐带20cm,用胶原酶消化 法【2分离收集HUVEC,种于明胶包被的75ml培养瓶 内,置37~C,5%CO培养箱内静置培养.培养基为含 20%胎牛血清(FBS),50ng/ml内皮细胞生长添加剂 (ECGS),100u/ml青霉素,100g/ml链霉素的RPMI 1640培养基.待HUVEC融合后,以1:3的比例传 代培养.细胞呈典型单层铺路石样形态,并经因子? 相关抗原鉴定呈阳性.所有实验均用第2代细胞进 行. 1.2寡核苷酸制备分别设计3种针对人TFmRNA 的寡脱氧核苷酸(ODN),ODN两端各一个碱基进行 硫代磷酸化修饰,由TaKaRa宝生物(大连)有限 公司合成.序列如下:反义寡脱氧核苷酸(AS/TF, AODN):5’-AAAGCArI,】[1’GCTrI,】[1’CCAATCTCC TGACTY-3’.正义寡脱氧核苷酸(S/TF,SODN)作为 对照:5’.AAGTCAGGAGATTGGAAAAGCAAA TGCrI,I1’-3’.错配寡脱氧核苷酸(Sc/TF)作为无关 对照:5’.TGT,I,兀’AACCATACCTCATI’GGATCAC TCT.3’ 1.3细胞分组将培养的HUVEC接种于96孔板中 (2.0×10孔),随机等分为正常对照组,缺氧再复氧 组,反义寡脱氧核苷酸转染组(AS/TF组),正义寡脱 氧核苷酸转染组(S/TF组)和错配寡脱氧核苷酸转染 组(Se/TF组),置37~C,5%CO培养箱内培养.待细 胞完全贴壁,生长至70%,90%融合时,弃培养液,磷 酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次. 1.4细胞转染取5支1.5mlEppendorff离心管,每 支离心管各中加人60不含血清和抗生素的RPMI 1640培养基,再将AS/TF,S/TF和Sc/TF等3种寡核 苷酸各10wmo1分别溶于其中3支Eppendorff离心管 内的RPMI1640培养基中,轻柔混匀,各加人2.5 Superfecttransfectionreagent(SF)后,轻柔混匀,室温 作用15min,使sF与寡核苷酸充分混合形成复合物. 另外2支Eppendorff离心管中也分别加人2.5SF ,但不加任何寡核苷酸,轻柔混匀后,室温放置15min .往这5种溶液中各加人150含有FBS和抗生素 的细胞培养基,轻柔混匀后迅速加人到上述洗涤过的 细胞培养孔内,其中含有AS/TF,S/TF和Sc/TF寡核 苷酸的转染复合物分别加入到洗涤过的AS/TF组,s/ TF组和Sc/TF组HUVEC中,正常对照组和缺氧再复 氧组的HUVEC中加人不含寡核苷酸的sF溶液.将 5组细胞置于37?,5%CO培养箱内培养3h后,弃 培养基,PSB洗涤3次,加人含20%FBS,50ng/ml ECGS,100u/ml青霉素,100g/ml链霉素的RPMI 1640培养基,37oC,5%CO培养箱内培养24h. 1.5细胞缺氧再复氧模型将上述培养24h后的缺 氧再复氧组,As/TF组,s/TF组和Sc/TF组HUVEC 血栓与止血学20o5年第ll卷第3期 去除原培养液,换氮气饱和的培养基,同时置于密闭 容器内,95%N2,5%CO2充气5L/min,4—5min后, 测容器内0:浓度为l%左右,置37?培养箱缺氧2 h.取出培养板,换正常培养基,正常条件下培养1h, 完成缺氧模型的制作. 1.6HUVEC表面TF活性的检测根据FXa对发 色原显色的深浅反映HUVEC表面TF的活性,而采 用发色底物法来检测HUVEC表面TF的活性.将上 述经过缺氧再复氧的HUVEC和正常对照组HUVEC 弃去培养液,用PBS缓冲液清洗后加人含5mmol/L CaC1,0.5lae./mlFVIa,10IlllFX的反应缓冲液, 37~C孵育15min后,加人含6mmol/L乙二胺四乙酸 (EDTA)的终止缓冲液终止反应,然后加人发色原 chromozymX,显色3rain后用酶标仪测定410n131下 的光密度值(A),从标准曲线上查得FXa.标准曲线 用已知量的FXa绘制. 1.7HUVECTF抗原(TF:Ag)的检测HUVEC经 过缺氧再复氧后,将培养板置于冰上,弃去培养液,以 冰预冷的PBS洗涤细胞3次,每~1.JJI1人250体积 分数为1%的TritonX.IO0/TBS[100mmolTris.C1 (pH7.5),150mmol/LNaC1],在4~C冰箱放置2h后, 收集细胞裂解液以12000r/min,4~C离心20min,取 其上清,用紫外分光光度计定量细胞裂解液内的细胞 总蛋白量.使用TF?ELISA试剂盒(AmericaDiagnostic 产品)检测TF:Ag,根据细胞总蛋白量换算出每毫克 细胞蛋白中TF:Ag的量. 1.8体外细胞核转录检测TFmRNA 1.8.1膨胀裂解法分离细胞核用乳胶刮匙将上述 5组HUVEC分别刮人冰冷的PBS.经PBS两次悬浮 后,1000r/rain离心5min洗涤细胞.往细胞沉淀中 加4mlPBS液(10mmol/LNaC1,10mmol/LTris?HC1, pH7.4,35mmol/LMgcl2),置于冰上5min,使之在低 渗缓冲液中膨胀裂解.加体积分数为10%的Triton X.100至终浓度0.1%,混匀后再加4mol/LKC1至浓 度140mmol/L.在Dounce手动匀浆器中匀浆l0一l5 冲程,显微镜下观察细胞裂解,细胞核释出.1000r/ min离心5min收集细胞核,用冷PBS洗涤后,用NSB 液(5Ommol/LHEPES,pH8.0,5mmol/LlgC12,0.5 mmol/LDTr,1mg/r,laBSA,体积分数为25%的甘油) 重悬沉淀,放人液氮中冻存. 1.8.2体外细胞核连缀反应融解冻存于NSB液中 的细胞核,1000r/rain离心5min,弃上清,用200l HRB缓冲液[20mmol/LTris?HC1,pH7.9,140 mmol/LKC1,5mmol/LMgcl2,1mmol/LDTr,40U ? 103? RNAinhibitor,1mmol/LATP,1mmol/LCTP,1mmol/L GTP,1mCi0/.32P.U11P(购自北京亚辉生物医学工程公 司)]轻轻吹打重悬.将悬液转移至1.5mlEppendorff 管中,37~C水浴30min进行细胞核转录反应.孵育结 束后,加人1mlTRIzol(GIBCO/BRL),抽提细胞核转 录的P.RNA. 1.8.3Bio?dot狭线印迹杂交利用计算机软件 PCRDESNA设计人TF引物,TF上游引物5’.GGA TGTGAAGCAGACGTACT-3’,下游引物5’.GTG TAGAGATATAGCCAGGA-3’,RT—PCR扩增得到人 TFeDNA片段的长度为535bp.以452bp人GAPDH eDNA片段(本实验室备存)作为内参照.往含有人 TFeDNA片段和GAPDHeDNA片段各5g的两种 DNA溶液中加人NaOH至终浓度0.1mol/L,混匀后 室温放置30min使用DNA片段变性.加等体积3 mmol/L的乙酸铵置于冰上中和.将硝酸纤维素膜 (NC膜)装人Bio.dot狭线印迹装置(BIO.RAD公司产 品),分为5列加样孔,每列分为2列,分别加人已中 和变性的人TFeDNA片段和GAPDHeDNA片段,真 空抽干加样孔.再以0.5ml6×SSC(1mol/LNaC1, 0.1mol枸椽酸三钠,pH7.O)洗涤加样孔两次.取出 NC膜在真空干燥仪(BIO?RAD公司产品)内烘干,使 两种DNA片段交联于NC膜上.将NC膜按加样孔的 排列剪为5条,分别以标记有弛P的正常对照组,缺氧 再复氧组,As/TF组,s/TF组和Sc/TF组HUVEC细 胞核转录的RNA各l5g作为探针与NC膜上的人 TFeDNA片段和GAPDHeDNA片段杂交.经P增感 屏放射自显影后,MolecularImagerFXsystem(BIO? RAD公司产品)观察结果.经Syngene图像系统 进行图像扫描分析以确定各条带转录的强弱. 1.9统计学处理计量资料的数据以x?s表示.采 用SAS软件包进行完全随机化设计资料的ANOVA方 差分析. 2结果 2.1HUVEC缺氧再复氧后表面TF活性和TF:Ag 的变化与未经缺氧再复氧的正常对照组HUVEC相 比,经过缺氧再复氧的HUVEC表面TF活性明显增强 (P<0.001),细胞裂解液中的TF:Ag也显着增多(P <0.001),AS/TF组HUVEC表面TF活性和TF:Ag 的增加幅度低于缺氧再复氧组,S/TF组和Sc/TF组 (P<0.05—0.O1).见表1. ? 104?ChineseJournalofThrombosisandHemostasis2005VolIINo3 表1ln?EC缺氧再复氧后表面TF活性和TF:Ag的变化(?s) 注:1)与正常对照组相比,P<0.01;2)与AS/TF组相比,P<0.01;3)与AS/TF组相比,P<0.05 2.2HUVEC缺氧再复氧后TF的转录Syngene图 像分析系统扫描后显示,HUVEC缺氧再复氧后TF基 因的转录强于未经缺氧再复氧的正常对照组HU— VEC,AS/TF组HUVECTFmRNA的转录弱于缺氧再 复氧组,S/TF组和Sc/TF组(图1). :二囊黧图1人脐静脉内皮细胞TF基因转录(Run?onassay) 1.正常对照组HUVEC;?2.缺氧再复氧组HUVEC;3.AS/TF 组HUVEC;4.S/TF组HUVEC;5.Sc/TF组HUVEC 3讨论 内皮细胞覆盖血管内膜表面,不仅是血液与间质 组织间的一层半透性的屏障,而且还具有多种重要的 生理功能,参与机体的凝血,免疫,物质转运和生物活 性物质释放等过程.4J.组织在缺血再灌注过程中. 相应组织内的血管内皮细胞也经历着缺氧再复氧的 损伤.血管内皮细胞经过缺氧再复氧后,产生的活性 氧可以透过细胞膜,在膜外与Fen或Cun生成羟自 由基,从而引发脂质过氧化(LPO)而导致内皮细胞损 伤J.近年来众多文献报道,羟自由基在缺氧再复氧 损伤中起核心作用J.内皮细胞缺氧再复氧损伤后, 释放一系列生物活性物质,引起炎症反应,并激活凝 血,补体等系统,进一步加重内皮细胞及其所在组织 的损伤,因而血管内皮细胞损伤在很多病理过程的发 生发展中起着重要作用. TF(组织因子),是一种分子质量为47ku的膜结 合糖蛋白.TF是机体生理和病理凝血反应的主要始 动者J,它通过与活化的凝血因子?(F?a)结合形成 TF.F?a复合物启动凝血瀑布反应.TF—F?a复合物 具有水解活性,可以将因子?(FIX)和因子x(FX)转 化为活化的因子IX(FIXa)和X(FXa),从而生成凝血 酶和纤维蛋白,最终形成血栓?...体外培养的内皮细 胞在基础条件下能表达微量的TF,在受损伤的情况 下,内皮细胞TF的合成和释放增加…J.近年来的研 究也提示,缺血性心脑血管和糖尿病患者的体内F?a 水平升高,并证实F?a活性升高与血管内皮细胞异常 表达密切相关?引,而且越来越多的证据也表明,TF过 度表达不仅在多种心脑血管疾病和糖尿病等血栓性 疾病的发病过程中起着非常重要的作用?引,而且还是 感染,免疫性疾病和某些肿瘤性疾病的一种重要发病 机制?’J.由于TF具有促凝活性,TF表达和释放增 多激活凝血系统,导致血液促凝活性增加,血小板易 黏附,聚集而形成血栓?.因而抑制内皮细胞TF基 因的表达是治疗此类疾病的重要措施. 反义寡脱氧核苷酸能够从基因转录和蛋白翻译 水平抑制靶基因的表达,而且具有安全性好,操作简 单,所需剂量小的优点J.我们在本实验中设计合成 了针对TF的反义寡脱氧核苷酸,并以正义寡脱氧核 苷酸和错配寡脱氧核苷酸作为对照.实验结果表明, 在As/TF,s/TF和Sc/TF等3者中,只有As/TF能够 抑制HUVEC缺氧再复氧后TF基因的转录和表达,而 s/TF和Sc/TF都有没有抑制TF的效果,说明应用反 义寡脱氧核苷酸抑制靶基因的转录和表达具有高度 特异性?.我们在实验中所合成的TF反义寡脱氧 核苷酸针对人TF基因外显子3的起始区域,囊括了 Trp.Lys.Ser(WES)三肽的基因序列,Trp—Lys—Ser是TF 的重要功能区域,是丝氨酸蛋白酶的作用位点?引, Trp.Lys.Ser三肽基因序列也是TFmRNA转录本所特 有的,因而实验中所应用的AS/TF只能够特异地抑制 靶基因TF的转录和表达,而不会影响其它基因. 实验中,寡脱氧核苷酸合成之后,我们将其进行 硫代磷酸化修饰,目的是为了使之抵抗核酸酶的破 坏,而且经硫代磷酸化修饰后,可以显着提高寡脱氧 核苷酸与靶基因的亲和力?.我们用SuperFect TransfectionReagent作载体成功地将TF寡脱氧核苷 酸转染人HUVECoSuperFectTransfectionReagent的 颗粒呈树枝状,具有较大的表面积,与寡脱氧核苷酸 血栓与止血学20D5年第l1卷第3期 形成复合物后,能够高效地将寡脱氧核苷酸转染人细 胞内,并保护外源DNA,减少其丢失与破坏,有利于寡 脱氧核苷酸发挥其生物效应】.实验结果表明,针对 TF的反义寡脱氧核苷酸能够显着抑制内皮细胞缺氧 再复氧损伤后TF的表达和细胞内TF基因的转录,且 此两种抑制作用呈高度的一致性,提示反义寡脱氧核 苷酸是通过抑制HUVEC”IFmRNA的合成而抑制细 胞TF表达的. 新近的研究表明,TF不仅是一个凝血因子,而且 是一个炎症因子?,可导致很多炎症介质的释放,并 诱导血管平滑肌细胞的迁移口,因而TF在包括血 栓,炎症等病理过程的多种疾病的发病机制中都起着 极为关键的作用】.同时本实验的结果也表明,针对 TF的反义寡脱氧核苷酸除了作为体内和体外基因调 控研究的有力工具外,对于因TF水平升高所致的血 栓性疾病和炎症性疾病可能有潜在治疗作用. 参考文献 [1]LutherT,MackmanN.Tissuefactorintheheart.Multiplerolesin hemnstasis,thrombosis,andinflammation[j].TrendsCardiovasc Med,2001,11(8):307—312. 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