低密度脂蛋白对肾小球系膜细胞表型转化作用

低密度脂蛋白对肾小球系膜细胞表型转化作用 低密度脂蛋白对肾小球系膜细胞表型转化 作用 1208中国2007年10月第23卷第10期ChinJPublicHealthOct2007Vo1.23No.】0 文章编号:1001—0580【2007)10—1208—03中图分类号:R692文献标志码:A 低密度脂蛋白对肾小球系膜细胞表型转化作用 姜晓刚,粘洪晓,孔灵玲,曹慧玲,王旭,李永华.,崔文,朱任之 【论着】 摘要:目的通过低密度脂蛋白(LDL)的刺激,观察LDL对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(MCS)表型转化 的诱导作用.方法采用不同浓度的LDL(O,25,50,100,150~g/m1)刺激体外培养的大鼠肾小球系膜细胞,以四甲基 偶氮噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,透射电镜观察系膜细胞的形态学变化,免疫细胞化学染色及蛋白印迹法 (Westernblot)检测a一平滑肌肌动蛋白(a—SMA),结缔组织生长因子(CTGF)的表达.结果在LDL作用下,倒置 显微镜下细胞变为长梭形,透射电镜下细胞表面微绒毛减少.免疫细胞化学染色及Westernblot显示a—SMA,CTGF 表达增强(P<0.05).结论在LDL刺激下,系膜细胞可以发生表型转化并可能与肾小球硬化有关. 关键词:低密度脂蛋白;表型转化;a一平滑肌肌动蛋白;结缔组织生长因子 Effectoflowdensitylipoproteinonphenotypicchangeofculturedglomerularmesangialcell sJIANGXiao-gang,NIAN Hong-xiao,KONGLing-ling,eta1.DepartmentofPathology,MedicalCollegeofJining(Jini ng,272013,China) Abstract:0bjectiveTostudytheinfluenceof1OWdensity1ipoproteinonphenotypechangeo ftheculturedratglomeru— larmesangialceHs(MC.s).MethodsTheratglomerularmesangialceHswereculturedforsev endaysinlowdensitylipopro— tein(0,25,50,100,150/~g/m1).MCSproliferationwasmeasuredunderMTTassay.Morphol ogicalchangeswereobservedby electronicmicrocopy.a— SMA,CTGFwereexaminedbyimmunohistochemistrystainandWesternblot.ResultsGlomerular mesangialcellsculturedinlowdensitylipoproteinshowedobviousmorphlogicchanges,incl udingelongatedshapeandtheap— pearanceofmuscleactin.Theexpressionamountofa— SMA,CTGFenhancedbyusingimmunohistochemistrystainand Westernblot.ConclusionLowdensitylipoproteincanleadtothephenotypicchangeofglome rularmesangialcellsandhave muchsomethingwithfibrosisofthekidney. Keywords:lowdensitylipoprotein;phenotypicchange;a—SMA;CTGF 肾小球硬化是多种肾脏疾病末期的最终结局,导致肾功 能衰竭,对机体造成极大危害.在此病理改变过程中,肾小球 系膜细胞的表型转化发挥着重要作用.自1982年提出脂质 代谢异常的肾毒性学说后【1],近年来有关低密度脂蛋白 (LDL)与肾脏纤维化的关系成为肾脏病学研究中的热点,但 多集中于肾小管上皮细胞与肾间质的关系【2],而对其能否促 进体外培养的系膜细胞(MCS)发生表型转化则缺乏研究.本 实验采用LDL作用于体外培养的MCS,于细胞水平观察其能 否诱导MCS发生表型转化及其对细胞生长和功能的影响. 1材料与方法 1.1材料胎牛血清(杭州四季青生物公司);胰蛋白酶(西 安华美生物公司);小鼠抗大鼠a一平滑肌肌动蛋白(a— SMA)单克隆抗体,兔抗大鼠结缔组织生长因子(CTGF)单克 隆抗体,链酶亲和素一生物素一过氧化物酶复合物(SABC)试 剂盒及蛋白印迹(Westernblot)检测试剂盒(武汉博士德生物 公司);LDL(中国医学科学院基础医学研究所生化室);RP— MI1640培养液(美国GIBCO公司). 1.2实验方法 1.2.1细胞培养大鼠肾小球MCS引自中山大学医学院, 经鉴定后用于本实验.实验中肾小球MCS细胞侏以含1O% 胎牛血清(10%FCS)的RPMI1640培养液,置37?,5%cch 饱和孵箱内培养.每2,3d换液和传代.当细胞长至贴壁 80%,90%且台盼蓝染色活细胞达95%以上时,将含10% FCS的RPMI1640培养液完全吸出,换成由不含胎牛血清的 RPMI1640培养液配制的不同浓度的LDL(0,25,50,100, 作者单位:1.济宁医学院病理学教研室,济宁272013;2.山东省莱 阳市第二人民医院泌尿外科;3.济宁医学院营养学教研 室;4.兰州大学基础医学院病理学教研室 作者简介:姜晓刚(1975一),男,山东莱阳人,硕士,研究方向:组织及 器官纤维化. 150/~g/m1),继续在孵箱内培养,中问换液及传代时继续按上 述条件刺激. 1.2.2细胞毒性实验取消化后的MCS以每孔5×10 个/ml接种于12孔培养板,24h后细胞接近于铺满孔底时换 无血清RPMI1640培养液培养24h,使多数细胞同步于静止 期后分为5组:(1)正常对照组(A组);(2)25~g/mlLDL组 (B组);(3)50/~g/mlLDL组(C组);(4)100/xg/mlLDL组(D 组);(5)150/~g/mlLDL组(E组);于培养后24,36和48h收 集细胞,台盼蓝染色,进行活细胞计数. 1.2.3细胞增殖水平测定实验步骤同上,细胞同步后分为 5组,接种于96孔培养板,于孵箱中培养24,48和72h后,加 入四甲基偶氮噻唑蓝(M1vr)101/孔,37?继续培养4h,终 止培养,吸弃孔内上清液,加入二甲基亚砜(DMSo)901/孔, 振荡10min,充分溶解结晶物,于酶联免疫检测仪上选择490 nm波长,测定各孔吸光度(A)值. 1.2.4细胞形态学观察倒置相差显微镜观察细胞表型转 化过程中的形态变化,透射电镜观察其超微结构改变. 1.2.5免疫细胞化学染色将盖玻片预先置于6孔培养板 内,然后将MCs以5×10个/ml接种于6孔板内,以含10% FCS的RPMI1640培养液培养24h,换无血清培养液使多数 细胞同步后,将其进行同上分组,培养7d后,行SABC法免 疫细胞化学染色.以已知阳性结果为阳性对照,以磷酸盐缓 冲液(PBS)代替一抗为阴性对照.结果以胞浆内出现棕黄色 颗粒为阳性信号,阴性为无着色.高倍镜下(×400倍)观察 200个细胞,计数a—SMA染色阳性的细胞数. 1.2.6Westemblot测定a—SMA,CTGF蛋白表达收集经 不同浓度LDL刺激的生长状态良好,培养7d的MCS,加细 胞裂解液后离心,取上清,测定蛋白浓度.加上样液于10% 十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离,电转移至 中国公共卫生2007年10月第23卷第10期ChinJPublicHealthOct2007Vo1.23No.10 硝酸纤维素膜上,5%脱脂奶粉封闭,加小鼠/兔抗大鼠a— SMA或CTGF一抗孵育,4?过夜,加辣根过氧化物酶标记的 抗小鼠/兔IgG孵育,37?1h,二氨基联苯胺(DAB)显色.结 果采用图形分析软件QuantityOne(美国BioBod公司)对 Westemblot特异性条带进行灰度扫描,以积分吸光度×面积 (mm)代表特异性条带的信号强弱,以此对目的蛋白水平进 行半定量比较. 1.3统计分析应用SPSS10.0软件进行分析,多个样本均 数的比较采用单因素方差分析,直线相关分析. 2结果 2.1LDL对MCS活细胞生长的影响台盼蓝染色结果显 示,各浓度LDL作用24,36和48h后,活细胞计数均在95% 以上,说明该实验中各浓度LDL对MCS增殖,表型转化和 ECM产量的影响,均为对95%以上的活MCS产生作用.实 验证明,25,150g/mlLDL对MCS无毒性作用. 22LDL对MCS增殖的影响(表1)各浓度LDL均能促进 MCS增殖,但25mlLDL与MCS共孵育后与正常对照组 比较,MCS增殖差异无统计学意义(P>0.05).随着LDL浓 度增加和刺激时间的延长,其增殖程度明显增强,差异有统计 学意义(P<0.05),呈时间和浓度依赖性. 表1LDL对MCs增殖的影响(A值,;?s) 注:与A组同一时间点比较,aP<0.05;与前一浓度组比较,bP <0.05;n:6. 2.3MCS形态学观察倒置相差显微镜下,正常MCS呈紧 密单层融合的卵石样或铺路石样贴壁生长.透射电镜下细胞 表面微绒毛密集(图1),长而细,细胞内未见肌动蛋白中间丝 结构.经LDL刺激7d后,MCS呈典型的肌成纤维细胞形态 学改变:细胞呈两端突起的长梭形,体积增大.透射电镜下, 细胞表面微绒毛变短变粗融合,数量减少.粗面内质网明显增 加,部分细胞内出现沿细胞轴分布的呈束状排列的肌动蛋白 样结构(图2),显示这种已转分化成功的MCS呈典型的肌成 纤维细胞形态学特征. 图1透射电镜下细胞表面微绒毛(×6000) 图2细胞内肌动蛋白样结构(×15000) 2.4LDL作用下MCs表型转化(表2)(1)免疫细胞化学染 色经LDL刺激7d后,MCs肌性标记物a—SMA呈现不同程 度的阳性染色结果,a—SMA阳性表达率与LDL浓度有关(r= O82.P<O.O5).正常对照组未见a,SMA明显表达.(2) Westernblot正常MCS未见a—SMA明显表达,经不同浓度 LDL刺激7d后,Q—SMA表达明显增强,且具有浓度依赖性. 表2LDL对Mcs表达a—SMA的影响(a—SMA%,?s) 注:与A组比较,aP<0.05. 2.5LDL作用下CTGF蛋白表达免疫细胞化学染色及 Westemblot结果显示,正常MCs未见CTGF蛋白表达,经 LDL刺激7d后,其蛋白表达增加,以100g/mlLDL为最 强,表达的最高峰为刺激后3d. 3讨论 目前,众多学者认为高脂血症是肾小球硬化的独立危险 因素(引,而高脂血症条件下LDL能否促进MCs发生表型转 化及其能否促进肾脏硬化尚缺乏相关的实验研究. 本实验结果表明,实验所采用的各浓度LDL对MCS均 无细胞毒性作用,并能使MCS大量增殖.透射电镜发现经 LDL诱导的MCs的超微结构发生明显变化并表达a—SMA, 免疫细胞化学染色及Westernblot结果亦与上述发现一致, 表明LDL在5O,150g/ml范围内与许多其他细胞因子一 样可活化基质产生细胞并起调控作用l4],诱导MCs发生表型 转化. 免疫细胞化学染色及Westernblot结果显示,LDL在诱 导MCS分化为肌纤维母细胞的同时,伴有CTGF蛋白表达增 加.TGF—p是目前已明确的最强的前纤维化因子【.它能 破坏ECM代谢的动态平衡,促进纤维化的发展【,而CTGF 是近年新发现的与肾脏纤维化密切相关的一个生长因子,是 TGF—p的下游效应介质及TGF—p致前纤维化的标志【7]. 实验中CTGF表达增加,与文献[7]研究结果一致,表明CT— GF是致肾脏纤维化的关键因子之一.研究结果显示,在肾间 质纤维化中表达的CTGF与TGF一8的细胞来源不完全相 同(,它只发挥TGF一8''双向作用"中的负面效应.目前,对 CTGF的了解尚少【9].已知TGF一8是诱导肾小管上皮细胞 1210中国公共卫生2007年l0月第23卷第l0期 ChinJPublicHealthOct2007Vo1.23No.j0 发生表型转化的中心环节【1,而作为TGF一8下游介质的 CTGF在本实验中的表达明显增多,其与肾小球MCs的表型 转化有无相关性,CTGF自身在实验中是否发挥了中介或放 大作用,LDL能否在转录水平促进系膜细胞表达CTGF,还有 待进一步研究. 实验结果表明,由于脂质代谢紊乱,LDL异常升高可以 诱导MCs发生表型转化.这种转分化的MCs与肾小球纤维 化的发生发展有着密切的关系.因此.若能阻断MCs发生表 型转化及其可能存在的中间介导作用.从而抑制CTGF等细 胞因子的产生.可能对治疗肾脏纤维化有重要意义. 参考文献 [1]MoorheadJF,ChanMK,El—NahasM,etalLipidnephrotoxicity inchronicprogressiveglomerularandtubulointersticialdisease[Jj Lancet,l982,2:l309一l3儿. [2]ChevalierRL.Pathogenesisofrenalinjuryinobstructiveuropathy [J].CurrOpinPediatr,2006,18(2):l53—160. [3]钟文旗,蔡政维,朱正庭,等.中西结合治疗肾病综合征型紫癜 性肾炎54例体会[J].疑难病杂志,2005,4(1):l6一l8. [4]RookM,LelyAT,KramerAB,eta1.Individualdifferencesinre. nalACEactivityinhealthyratspredictsusceptibilitytoadriamycin — inducedrenaldamage[J].NephrolDialTransplant,2005,20 (1):59—64. FofinoM,TorregrossaR,CeoM,eta1.TGF—betalinducesep? ithelial—mesenchymaltransition,butnotmyofibroblasttransdif? ferentiationofhumankidneytubularepithelialcellsinprimarycul? ture[J].IntJExpPatho,2006,87(3):197—208. MaryHB,JefferyBK.TGF一0andfibrosis[J].JMicrobesInfec. tion,1999,l:l349一l365. BlomIE,GoldschmedingR,LeaskA.Generegulationofconnective tissuegrowthfactor:newtargetsforantifibrotictherapy[J].Ma- trixBiol,2002,21(6):473. 赵青,陈楠,王伟铭,等.结缔组织生长因子在肾间质纤维化中 的表达及其意义[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2002,儿:2l一 26. Wahab,NadiaAbdeMason,RogerM,eta1.Connectivetissue growthfactorandrenaldiseases:someanswers,morequestions [J].CurrentOpinioninNephrologyandHypertension,2004,13 (1):53. RobertsAB,TiaraF,ByfieldSD,eta1.Smad3iskeytoTGF—beta mediatedepithelial—to—mesenchymaltransition,fibrosis,tumor suppressionandmetastasis[J].CytokineGrowthFactorRev, 2006,17(1—2):l9—27. 收稿日期:2007.05.08(郭长胜编辑郑新校对) 文章编号:1001.0580(2007)10.1210.02中图分类号:R154文献标志码:A 流感样病例监测系统数据异常波动与预警分析 宁芳.段玮.高培,松凯,周素梅,沈壮 【调查研究与分析】 摘要:目的通过分析流感样病例监测系统监测结果,探讨监测系统中数据异动的修 订与预警预报方法.方 法依据北京市流感监测,重点选择流感样病例监测系统中67家监测哨点医院 2007年1月1日,1月14日监 测数据,对流感样病例占门诊量百分比(ILl%)结果进行调整.结果2007年前2周监 测结果显示:ILl%平均为 6.50%(范围5.08%,9.37%).调整后ILl%平均为10.75%(范围9.46%,11.57%),调 整IL1%指标敏感性和准确 性高于未调整的ILl%.结论流感样病例监测系统监测数据易受政策措施,媒体宣 传,规章等诸多因素影响, 密切关注监测数据出现的异常波动,及时核实分析并进行有效的修订,可有效提高 监测系统的预警预报能力. 关键词:流感样病例;流感样病例占门诊量百分比(ILl%);调整ILl%;预警预报 Analysisondatadeviationofinfluenza.1ikecasesurveillancesystemandforecastingNINGF(zn,DUANWP,GA0, eta1.BeijingCenterforDiseaseControlandPrevention(BeOing100013,C^ina) Abstract:0bjectiveToanalysetheinfluenza— likecasescollectedviasurveillancesystemfromendof2006tobeginning of2007,soastopromotemethodsofadjustingthedatadeviationinsurveillncesystemandanalyzingtheforecasting.Methods Accordingtothe2006, 2007InfluenzaSurveillancePlanofBeijing,thesurveillancedatacoUectedfromJan1,2007toJan 14.2007inthe67samplehospitalsininfluenza.1ikesurveillancesystemwasselected,for1everagetheadjustmenttoIL1%in? dicator.ResultsTheresultsofthefirsttwoweeksof2007showed:originalILl%inaveragewas6.50%(rangefrom 5.08%to9.37%).whileILl%adjustedwas10.75%(rangefrom9.46%to11.57%)inaverage,whichshowedthesensi— tivityandaccuracyofILl%indicatorafteradjustmentwasbetter.ConclasionThesurveillancedatacollectedbythesurvdllance systemwasaffectedbymanyfactorssuchasgovernmentpoHcy,mediumandregulations.Byd~elytrackingandanalyzingthedevia' tionofsurveillancedata,aswellasefficientlyadjusting,theforecastingcapabilityofsurveillancesystemmaybeimproved. Keywords:influenza—likecase;ILl%:ILl%adjusted;forecasting 传统的疾病监测大多为被动监测,依靠病例的临床或实 验室诊断结果,描述疾病分布特征,确定危险因素等,是事件 发生后的分析,通常难以做到早期预测预警.随着疾病监测 *基金项目:北京市外国专家局课题(BA2006—01) 作者单位:北京市疾病预防控制中心应急中心,100013 作者简介:宁芳(1978一),女,北京人,医师,本科,研究方向:预防 医学. 系统实践与经验的积累,症状监测孕育而生.症状监测也称 为症候群(综合征)监测.是指通过连续,系统地收集和分析特 定疾病临床症候发生频率的数据.及时发现疾病的时间和空 间上的异常聚集,以期对疾病(生物恐怖袭击,新发传染病,原 因不明疾病及其他聚集性不良公共健康事件)暴发进行早期 探查,预警和快速反应的监测方法.本文通过对2004年全国 开始启用流感样病例监测系统中2006年底,2007年初的数 ]i]] 56789H [i[[