长期酒精摄入对高脂喂养大鼠胰岛素敏感性及肝脏胰岛素信号传导关键分子的影响（可编辑）

长期酒精摄入对高脂喂养大鼠胰岛素敏感性及肝脏胰岛素信号传导关键分子的影响（可编辑） 长期酒精摄入对高脂喂养大鼠胰岛素敏感性及肝脏胰 岛素信号传导关键分子的影响 华中科技大学 硕士学位论文 长期酒精摄入对高脂喂养大鼠胰岛素敏感性及肝脏胰岛素信号 传导关键分子的影响 姓名:田利钺 申请学位级别:硕士 专业:营养与食品卫生学 指导教师:郝丽萍;刘烈刚 20090501 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文长期酒精摄入对高脂喂养大鼠胰岛 素敏感性及 肝脏胰岛素信号传导关键分子的影响 硕士研究生:田利钺 导师:郝丽萍 副教授 刘烈刚 教 授摘要 糖尿病是由于遗传和环境因素相互作用而引起的以血中葡萄糖水平长期增 高为 基本特征的代谢性疾病。以 2型糖尿病发病广泛,对人类危害严重,常引起 碳水化合 物、蛋白质和脂肪代谢异常,出现血管、神经、心脏、肾脏等组织器官的严 重并发症。 胰岛素抵抗是 2型糖尿病发病机制的重要环节并且是启动因素,贯穿于 2型糖尿 病的整个发生和发展过程中。胰岛素抵抗的机理已成为研究的热点,胰岛素信号传导 被认为与此有关,但是其中的详细机理目前还不清楚。胰岛素与靶细胞膜面受体结 合后发生一系列级联反应,产生生物效应,这一过程中胰岛素信号的有效传导是先决 条件,因此胰岛素信号传导途径中关键分子的数量、功能异常已经成为研究的重点。 近年来,越来越多的流行病学研究结果提示长期不同剂量饮酒对胰岛素敏感性有 着不同的影响:适量饮酒与胰岛素敏感性增强及 2型糖尿病发病危险降低有关,而长 期过量饮酒与胰岛素抵抗及 2型糖尿病发病危险增加有关。 我国是酒类生产消费大国,我国常年饮酒者的酒精摄入量占总能量的 10%左右。 并且随着人们生活水平逐年提高,我国居民膳食模式逐渐向西方发达国家模式转变, 长期高脂饮食伴随着长期酒精摄入的现象屡见不鲜,因此,高脂饮食和酒精摄入对胰 1 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 岛素敏感性影响及与 2型糖尿病的相关研究具有现实的重要意义。 肝脏是人体最大的内分泌器官,对胰岛素的信号传导、酒精和脂类的代谢起到重 要的作用。本研究从探讨在长期高脂饮食状态下不同剂量酒精摄入对胰岛素敏感性影 响入手,通过对肝脏胰岛素信号传导途径关键分子影响的探索来揭示其作用机制。目 前关于长期高脂饮食状态下不同剂量酒精摄入对肝脏中胰岛素信号传导分子的表达 或功能影响未见报道。目的:本实验借鉴 2型糖尿病病因学的研究进展,通过整体动物实验,研究长期高脂 饮食状态下不同剂量酒精摄入对大鼠胰岛素敏感性及肝脏组织胰岛素信号传导途径 关键分子的影响,在肝脏的分子生物学水平揭示长期高脂饲料喂养下不同酒精摄入影 响胰岛素敏感性的分子机制,为有效预防 2型糖尿病提供科学依据。 :清洁级雄性 Wistar大鼠,随机分为七组:正常对照组、高脂对照组、高脂+5% 酒精组、高脂+10%酒精组、高脂+20%酒精组、高脂+30%酒精组、高脂+40%酒精组。 每日一次灌胃,每周测体重,13周后,断头处死大鼠,检测血清总胆固醇(TC)、甘 油三脂(TG)及高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)水平;测定空腹血糖(FPG)及血 胰岛素(FINS)浓度,计算胰岛素抵抗指数(Homeostasis Model Assessment HOMA-IR) 及 HOMA- β功能指数(HOMA β-cell index,HBCI)。提取肝脏总 RNA,通过 RT-PCR 方法,测定肝脏胰岛素受体底物-1(IRS-1),磷脂酰肌醇 3激酶(PI-3K)、葡萄糖转 运体-2(GLUT-2)的 mRNA表达水平。提取肝脏蛋白,通过 western blotting 的方法, 测定 PI-3K(p85α)、GLUT-2的蛋白表达水平。 结果: 1. 生长情况: (1)实验期间,各组大鼠体重呈上升趋势。 (2)高脂对照组与正常对照组相比体重明显增加(P 0.01); (3)高脂+5%、10%、20%、30%酒精组与正常对照组相比体重明显增加(P 0.01)。 (4)高脂+40%酒精组与高脂对照组相比明显降低(P 0.01)。 2. 血脂情况: (1)高脂对照组与正常对照组比,TC、TG有所升高,HDL-C有所下降,但无统计 2 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 学意义。 (2)高脂+5%、10%酒精剂量组与正常对照组相比,TC明显升高(P 0.05),但 TG 和 HDL-C变化不明显;与高脂对照组相比,TC、TG、HDL-C变化均不明显。 (3)高脂+20%酒精剂量组与正常对照组相比,TC明显升高(P 0.05),但 TG和 HDL-C变化不明显;与高脂对照组相比 TC明显升高(P 0.05),但 TG和 HDL-C变 化不明显。 (4)高脂+30%、40%酒精剂量组与正常对照组相比,TC、TG明显升高(P 0.05), HDL-C明显降低(P 0.05);与高脂对照组相比, TC、 TG明显升高(P 0.05), HDL-C 明显降低(P 0.05)。 3. 血糖浓度、血胰岛素浓度、胰岛素抵抗指数、胰岛 β细胞功能指数改变: (1)血糖浓度:高脂对照组与正常对照组相比无统计学差异。高脂+各酒精剂量组与 正常对照组相比,均升高(P 0.05)。高脂+20%、30%、40%酒精剂量组与高脂对照 组相比,均明显升高(P 0.05)。 (2)血胰岛素浓度:高脂对照组与正常对照组相比明显升高(P 0.05)。高脂+5%、 10%、20%酒精剂量组与正常对照组相比,均升高(P 0.05)。高脂+30%、40%酒精 剂量组与高脂对照组相比降低(P 0.05)。 (3)胰岛素抵抗指数:高脂对照组与正常对照组相比明显升高(P 0.05)。高脂+各 酒精剂量组与正常对照组相比,均升高(P 0.05)。 (4) 胰岛β细胞功能指数:高脂对照组与正常对照组相比明显升高(P 0.05)。高脂 +各酒精剂量组与正常对照组相比,先升高后降低(P 0.05)。高脂+各酒精剂量组与 高脂对照组相比,随酒精剂量增加而降低(P 0.05),在30%、40%酒精组尤其明显。 4. 肝脏胰岛素信号传导关键分子 mRNA及蛋白表达情况: (1)IRS-1 mRNA表达:高脂+各酒精剂量组与正常对照组、高脂对照组相比,都下 降(P 0.05),在高脂+30%、40%酒精组降低明显。 (2)PI-3K mRNA表达:高脂+各酒精剂量组与正常对照组、高脂对照组相比,都下 降(P 0.05),在高脂+30%、40%酒精组降低明显。 (3)GLUT-2 mRNA表达:高脂对照组与正常对照组相比,降低(P 0.05)。高脂+ 3 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 各酒精剂量组与正常对照组相比,都下降(P 0.05)。与高脂对照组相比,除高脂+20% 酒精剂量组没有统计学差异外,其余各剂量组均降低(P 0.05),在高脂+30%、 40% 酒精组降低明显。 (4)PI-3K(p85α)蛋白表达:高脂+各酒精剂量组与正常对照组、高脂对照组相比, 均下降(P 0.05),在高脂+30%、40%酒精组降低明显。 (5)GLUT-2蛋白表达:高脂对照组与正常对照组相比,降低(P 0.05)。高脂+各酒 精剂量组与高脂对照组相比,降低(P 0.05),在高脂+30%、40%酒精组降低明显。 结论:长期高脂喂养的大鼠体重明显升高,长期高脂饮食+40%酒精剂量对机体影响 较大,导致体重明显降低。高脂+酒精剂量组与正常对照组相比随着酒精剂量的增加, 胰岛 β细胞功能指数先升高再下降(P 0.05);与高脂对照组相比,血糖、血胰岛素 浓度、胰岛素抵抗指数明显升高,胰岛 β细胞功能指数随酒精剂量的增加明显下降(P 0.05),这表明长期高脂饮食和酒精摄入联合作用加重机体胰岛素抵抗,同时损伤胰岛 β细胞功能,在 30%、40%酒精剂量组尤其明显。此外,长期高脂饮食和酒精摄入联 合作用还抑制大鼠肝脏 IRS-1、PI-3K、GLUT-2的 mRNA及 PI-3K(p85α)、 GLUT-2 蛋白表达,在 30%、40%酒精剂量组降低更明显,这可能是长期高脂饮食及酒精摄入 导致胰岛素抵抗的分子机制之一,也说明长期高脂饮食和高剂量饮酒加重胰岛素抵 抗,2型糖尿病发病增加。 关键词: 酒精;高脂;胰岛素抵抗;胰岛素受体底物-1;磷脂酰肌醇 3激酶; 葡萄 糖转运体-2 4 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 创新点: 本课题研究长期高脂饮食状态下饮酒对大鼠胰岛素敏感性的影响,充分拟合我国 目前的膳食模式,有很强的实际意义。同时,结合 2型糖尿病病因学进展,首次通过 动物实验研究,探讨在高脂饮食状态下不同浓度酒精长期对大鼠胰岛素敏感性的影响 以及可能存在的分子机制。结果显示长期高脂饮食及酒精摄入会导致胰岛素抵抗。在 分子水平研究高脂饮食下不同剂量酒精摄入对肝脏胰岛素信号传导途径关键分子的 影响,提出长期高脂饮食及不同剂量酒精摄入能降低肝脏 IRS-1、PI-3K、 GLUT-2 mRNA和PI-3K(p85α)、GLUT-2蛋白表达是其导致胰岛素抵抗的可能机制。 5 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Influence of chronic alcohol intake and high fat diet on insulin sensitivity and the key molecules of insulin signal transduction in liver of rats Master Candidate: Tian Liyue Tutor: Asso. Hao Liping Prof. Liu LiegangAbstract Background: Diabetes is a metabolic disease which with the character of increasing glucose levels in blood chronically, and it is caused by the interaction of genetic and environmental factorsType 2 diabetes mellitus causes serious harm to human, often leading to the disorder metabolic of carbohydrates, protein and fat. It can result in serious complications of blood vessels, nerves, heart, kidneys and other organsInsulin resistance plays an important role and has been proved to be an original factor in pathogenesis of the type 2 diabetes mellitus. The functions of insulin depend on whether insulin signal can be successfully transducted. So the number and functions of insulin transduction molecules have been the point of this research In recent years, more and more epidemiology studies have shown that different doses of chronic alcohol intake have different effects on insulin sensitivity. Moderate alcohol intake can promote the insulin sensitivity and decrease the risk of type 2 diabetes mellitus, while chronic heavy alcohol intake has the opposite effects 6 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 China is a big country about the production and consumption of alcohol. The average alcohol intake in long-term alcohol drinkers is 10% of the total daily energy intake. Along with the economic development in China, the dietary pattern is shifting to the high-fat Western diet. The traditional alchol intake style in Chian is with the meals, therefore the high-fat diet and alcohol intake is getting more and more popular. But the effect of high-fat diet and chronic alcohol intake on the insulin sensitivity and type 2 diabetes mellitus is little knownLiver is one of the most important target organs of insulin, and it is the major organ of ethanol and lipid metabolism. Insulin resistance of hepatic tissue partly attributes to the cause of type 2 diabetes mellitus. At present, there is still little report on how insulin signal transduction and function effected by different doses of alcohol and high-fat dietObject:This study was performed to investigate the effect of a high-fat diet and alcohol high-fat, alcohol intake on insulin sensitivity in rats. To explore the molecule mechanisms of insulin sensitivity of long-term alcohol intake and high fat diet, the mRNA and protein expression of the key molecules of insulin signal transduction in liver were examinedMethod: Wistar rats were housed at 17?27?, 40?60% relative humidity with at 12:12 h dark?light schedule. To initiate the study, the animals were weighed and randomly assigned to two control group-normal diet and high fat diet and five test groups .The test groups were maintained on high fat diet and subjected to daily intragastric injections 10ml/kg body weight per day containing different levels 5, 10, 20, 30, 40%v/v of alcohol. Weight was measured once a week. 13 weeks later, the rats were sacrificed by decapitation to test the serum total cholesterol TC, triglyceride TG, high density lipoprotein HDL, fasting blood glucose concentration FPG, blood insulin concentration FINS, then insulin resistance index Homeostasis Model Assessment HOMA-IR and HOMA- β function index HOMA β-cell index were calculated. Total RNA from liver was isolated to test the mRNA7 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 expression of insulin receptor substrate-1 IRS-1, phosphatidylinositol 3 kinase PI-3K and glucose transporter-2 GLUT-2 by RT-PCR. Liver protein was isolated to test the protein expression of PI-3K p85 α and GLUT-2 by western blottingResults: 1. Weight change 1 The body weight of each group increased during the experiment2 Body weight of high-fat diet control group significantly increased compared with normal control group P 0.053 Body weight of high-fat diet with the does of 5%, 10%, 20%, 30% alcohol groups significantly increased compared with normal control groupP 0.054 Body weight of high-fat diet with the does of 40% alcohol group significantly decreased compared with high-fat diet control group P 0.052. Parameters of TC, TG and HDL-C1 TC, TG, HDL-C of normal control group have no significance compared with high-fat diet control group2 TC of high-fat diet with the does of 5%, 10% groups significantly increased P 0.05 compared with normal control group, but there is no significance about TC, TG and HDL-C3 TC of high-fat diet with the does of 20% alcohol significantly increased P 0.05 compared with each control group, but there is no significance about TG and HDL-C4 TC and TG of high-fat diet with the does of 30%, 40% significantly increased, at the same time HDL-C significantly decreased P 0.05 compared with each control group3. FPG, FINS, HOMA-IR and HOMA- β function index HBCI 1 FPG: High-fat diet control group have no significance compared with normal control group. High-fat diet with each dose of alcohol groups significantly increased compared with normal control group P 0.05. High-fat diet with dose of 20%, 30%, 40% alcohol groups significantly increased compared with high fat control group P 0.05 8 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 FINS: High-fat diet control group significantly increased compared with normal control group P 0.05. High-fat diet with the does of 5%, 10%, 20% alcohol groups significantly increased compared with normal control group P 0.05. But high-fat diet with the does of 30%, 40% alcohol groups significantly decreased compared with high-fat diet control group P 0.053 HOMA-IR: High-fat diet control group significantly increased compared with normal control group P 0.05. High-fat diet with each dose of alcohol groups significantly increased compared with normal control group P 0.054 HBCI: High-fat diet control group significantly increased compared with normal control group P 0.05. High-fat diet with alcohol groups decreased with the increasing of alcohol compared with high-fat diet control group P 0.05. It is obviously at the dose of 30% and 40%4. The expression of mRNA and protein1 The expression of IRS-1 mRNA: High-fat diet with each dose of alcohol groups significantly decreased compared with each control group P 0.05. It is obviously at the dose of 30% and 40%2 The expression of PI-3K(p85α)mRNA: High-fat diet with each dose of alcohol groups significantly decreased compared with each control group P 0.05. It is obviously at the dose of 30% and 40%3 The expression of GLUT-2 mRNA: High-fat diet control group significantly decreased compared with normal control group P 0.05. High-fat diet with each dose of alcohol groups significantly decreased compared with normal control group P 0.05. It is obviously at the dose of 30% and 40%4 The expression of PI-3K(p85α)protein: High-fat diet with each dose of alcohol groups significantly decreased compared with each control group P 0.05. It is obviously at the dose of 30% and 40%5 The expression of GLUT-2 protein: High-fat diet control group significantly decreased9 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 compared with normal control group P 0.05. High-fat diet with each dose of alcohol groups significantly decreased compared with high-fat control group P 0.05. It is obviously at the dose of 30% and 40%Conclusion: This study showed that chronic high fat diet and alcohol intake Increased in body weight. It is obviously in the high fat diet with dose of 40% alcohol group. HCBI in high fat diet with alcohol group increased first and then decreased with alcohol dose increasing compared with normal control group. FPG, FINS and HOMA-IR significantly increased compared with high fat control group P 0.05. It decreased the insulin sensitivity and impaired the function of β cells especially in the the high fat diet with dose of 30%, and 40% alcohol group. At the same time, chronic high fat diet and alcohol intake inhibited the mRNA and protein expression of IRS-1, PI-3K, GLUT-2 in the liver, especially in the the high fat diet with dose of 30%, and 40% alcohol groupIt is probably the mechanism of high fat diet with dose of alcohol descreasing insulin sensitivity. Chronic high fat diet and high dose of alcohol intake decreased the insulin sensitivity more seriously Key words: alcohol, hyperlipidemia, insulin resistance, insulin receptor substrate -1, phosphatidylinositol 3 kinase, glucose transporter -2Innovation: Based on the effect of long-time high fat diet and different dose of alcohol to the sensitivity of rats’ insulin, the study fit our diet pattern sufficiently, which has practical significance. At the same time, the study based on the progress of the etiology of type 2 diabetes mellitus, we systematically studied the influence of different dose of alcohol and high fat diet on insulin sensitivity and the mechanism by animal experiments. We get the results that chronic high fat diet with alcohol intake decreased insulin sensitivity and get the mechanism that chronic high fat diet with alcohol intake can decrease the mRNA expression of IRS-1、 PI-3K、 GLUT-2 and the protein expression of PI-3K(p85α)、 GLUT-2 in liver 10 独创性声明 本人郑重声明,本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果的。尽我所知,除文中已经标明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体,均已在文 中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。 学位论文作者签名: 日期: 年 月 日学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科 技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以 采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密? ,在_____年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密?。 (请在以上方框内打“?” ) 学位论文作者签名: 指导教师签名:日期: 年 月 日 日期: 年 月 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 前言 近年来,随着世界各国经济不断发展和生活水平的提高,糖尿病的发病逐年升高, [1] 现已成为危害人类健康的第三大疾病 。据国际糖尿病联盟International Diabetes Federation IDF统计,20世纪 90年代,全球糖尿病患者约为 1亿人。到 2007年,该 [2] 数字已经迅速增长到 2.46亿人。预计到 2025年,全球将有 3.8亿人受到糖尿病困扰 。 [3] WHO显示,糖尿病为全球死因顺位的第六位 。根据伤残调整寿命年(DALYs) 估计,全球糖尿病引起的疾病负担占总疾病负担的 1.0%。目前,糖尿病直接医疗成本 [4] 在美国和欧共体国家所占比例分别为 10.61%和 7.20% 。糖尿病已成为威胁人类健康 的重大社会问题,引起各国政府、卫生部门、广大医务工作者的关注和重视。目前, [5] 我国已经成为第二大糖尿病国家 。据国家卫生部调查显示,我国每天约新增 3000 [6] 例。每年约增加 l20万糖尿病患者,其中,约 95%为 2型糖尿病患者 。目前,中国 [7] 的糖尿病患者达 2.08千万,到 2030将达到 4.23千万,将增长近一倍 。 世界酒类产量和消费逐年升高。据世界卫生组织统计,1965~2000年全世界酒类 产量增加 50%,近 30年,酒精的消费也有了飞速的增长,全世界酒精的消费从 1970 [8] 年至今翻了 3倍。近年来,我国逐渐成为酒饮料生产消费的大国 ,2007年,我国白 酒总消费量占世界烈酒总消费量的 23%,跃居为世界最大的烈性酒消费市场。我国常 年饮酒者的酒精摄入量占总能量的 10%左右,目前我国酒民已超过 5亿人,酒民平均 单次饮酒量 41 g(折算为纯酒精),是 WHO安全饮用标准(20 g/天)的 2倍,是中 国推荐的健康饮酒标准(15 g/天)的近 3倍。过量饮酒使我国饮酒人群整体的身体健 康状况堪忧。研究酒精与健康的关系具有现实的社会意义。 随着我国经济的不断发展,人们的物质生活极大丰富,饮食逐渐向高能量,高脂 肪过度,我国人群血脂异常增多与这种饮食结构变化有关。中国居民膳食指南规定, 我国居民食用油每天不超过 25 g。摄入脂肪能量占总能量的 27.1%,每天胆固醇的摄 入量应低于 300 mg。80年代末,我国居民每日平均摄入总脂肪、占总热量的百分数 和平均每日胆固醇的摄入量分别为 24.1%和 282 mg;而到 2000年,以上数值分别为 11 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 29.1%~31.3%和 388~421mg,即脂肪和胆固醇的摄入量明显增多。 我国居民 总体 食物结构的分析还显示:近年来,我国居民动物性食物的消费量增加了近 5倍,油脂 类增加了 3~5倍,远远超过了国内外健康教育所制定的标准。我国人民从原来有利 于健康的东方型饮食模式逐渐转变为不利于健康的高脂、高胆固醇的西方型饮食模式 [9] 。 胰岛素敏感性(insulin sensitivity)是指胰岛素作用的靶器官(主要是肝脏、骨 骼肌及脂肪,现在认为还包括血管内皮细胞及动脉平滑肌细胞)对胰岛素的反应性。 胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感性 下降,即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态。表现为外周组织尤 其是肌肉、脂肪组织对葡萄糖的摄取减少和抑制肝脏葡萄糖输出的作用减弱。目前在 胰岛素抵抗的研究中,胰岛素信号传导途径中关键分子的数量和功能异常对胰岛素敏 感性的影响逐渐成为研究的重点,胰岛素信号传导途径关键分子包括胰岛素 受体 (insulin receptor, IR)、胰岛素受体底物(insulin receptor substrate, IRS)、磷酸肌醇 3- 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI-3K)、葡萄糖转运体(glucose transporter,GLUT)。 以往的很多研究表明,酒精能导致胰岛素抵抗,流行病学研究表明,适量的酒精 饮料摄入,会增加胰岛素敏感性,降低机体血脂,提高 HDL胆固醇含量,但也有学 者提出不同看法,如 Konrat 等人认为饮酒剂量与胰岛素浓度之间仅存在负相关,而 [10] 不存在 U型关系 。流行病学研究结果显示不同剂量的酒精可以影响机体胰岛素的敏 感性以及患糖尿病的危险度,同时,学者们在酒精和胰岛素敏感性方面也做了一些实 验研究,取得了一些进展。实验研究结果也表明,长期酒精摄入可以导致包括骨骼肌、 [11] 脂肪和肝脏在内的多个器官的胰岛素抵抗 。 近年来,由于人们的饮食模式逐渐向高脂饮食过度,高脂饮食本身对机体的损害 亦成为研究的重点。已有研究表明,高脂饮食对胰岛素敏感性的影响不容忽视,很多 学者用高脂饲料诱导大鼠出现肥胖,同时出现高胰岛素血症、高血糖、肝脏和脂肪细 胞胰岛素受体减少,从而出现胰岛素抵抗。也有研究者用含有能量为 59%的高脂饲料 [12] 喂养大鼠 4~6周后,周围组织出现广泛的 IR 。 我国很多地区人们多以白酒加肉、啤酒加烧烤的夜宵生活,很多单位又以各种山 12 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 珍海味的应酬和酒桌谈判为根本,因此,我国目前的膳食模式逐渐转变高脂、高热量 膳食与酒滥用同时存在。对于长期高脂饮食及不同剂量酒精摄入与胰岛素敏感性及 2 型糖尿病的关系研究,是现实可行的。鉴于以上,本课题以长期高脂喂养的大鼠为动 物模型,给予不同剂量酒精,从血脂、血糖、血胰岛素、并通过其计算出胰岛素抵抗 指数和胰岛 β细胞功能指数来探讨长期高脂饮食及不同剂量酒精摄入对胰岛素敏感性 的影响现象。 肝脏在体内的物质代谢中发挥着重要的作用,是胰岛素发挥作用的主要的靶器官, 也是酒精、脂类的主要代谢器官。因此,肝脏对胰岛素的敏感性降低是导致机体胰岛 素抵抗的重要因素之一,在研究长期高脂饮食状态下不同剂量酒精对胰岛素敏感性影 响机理的研究中有着重要的作用,目前关于高脂饮食及不同剂量酒精对肝脏中胰岛素 信号传导关键分子的表达及功能影响的研究尚未见报道。鉴于以上,本课题通过长期 高脂饮食及不同剂量酒精摄入对肝脏胰岛素信号传导关键分子的影响来研究过量饮 酒及高脂饮食导致胰岛素抵抗的可能分子机制。为有效预防 2型糖尿病提供科学依据。 1.材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 清洁级雄性 Wistar大鼠 112只,体重 130~150 g,由湖北省医学实验动物中心提 供批号:SCXK(鄂)2003-0005。 1.1.2 主要试剂和仪器 1.1.2.1 主要试剂: 无水乙醇 分析醇,武汉江夏中南精细化工厂 甲醛 分析醇,国产 血糖测定试剂盒 中生北控生物科技公司 125 I?胰岛素放免药盒 北京科美东雅生物技术公司 TC、TG、HDL试剂盒南京建成生物工程研究所 PCR: DEPC(焦碳酸二乙酯) Sangon13 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Trizol Reagent Promega M-MLV逆转录酶(200 U/?l)Promega Rnasin(20-40 U/?l) Promega Taq DNA 聚合酶(3 U/?l) Promega Random Primers Promega dNTPs(10 mmol/L) Sangon primers 北京奥科公司 β-actin引物 北京奥科公司 DNA marker Promega 溴化乙锭(EB)Promega Western blot: 总蛋白定量试剂盒 美国 Bio-Rad公司 N,N’-亚甲丙烯酰胺 美国 Promega公司 丙烯酰胺 美国 Promega公司 过硫酸胺 德国 Sigma公司 ’ ’ N,N,N ,N -四甲基乙二胺 TEMED 美国 Promega公司 十二烷基磺酸钠 SDS 德国 Sigma公司 二巯基乙醇 美国 Promega公司 吐温 20 Tween-20 美国 Promega公司 Tris base 美国 Amresco公司 甘氨酸 德国 Sigma公司 脱氧胆酸钠 德国 Sigma公司 二硫苏糖醇 DTT 瑞士 Roche公司 苯甲基磺酸氟 PMSF 瑞士 Roche公司 抑蛋白酶肽 Aprotinin 瑞士 Roche公司 亮抑制肽 Leupeptin 美国 Promega公司 矾酸钠 NaVO 德国 Sigma公司 3 兔抗 PI-3Kp85 α多克隆抗体 美国 Santa Cruz公司14 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 羊抗 GLUT-2多克隆抗体 美国 Santa Cruz公司 鼠抗 β-actin单克隆抗体 德国 Sigma公司 HRP标记抗兔 IgG抗体 德国 Sigma公司 HRP标记抗小鼠 IgG抗体 德国 Sigma公司 HRP标记抗羊 IgG抗体 德国 Sigma公司 ECL显影剂 英国 Amersham公司 1.1.2.2 主要仪器:5804R低温高速离心机 Eppendorf Elx-800酶标仪USA SN-682型放射免疫 γ计数仪 上海核福光电仪器有限公司 -80?低温冰箱USA 核酸蛋白测定仪 Eppendorf PCR仪 Biometra 电泳仪 Biometra TI1全自动凝胶成像分析系统 Biometra Western Blot垂直平板电泳槽 美国 Bio-Rad公司 电泳仪 美国 Bio-Rad公司 转印仪ATTA 公司 微量恒温器 绍兴卫星医疗设备公司 显影暗盒 英国 Amersham公司 T667胶片 美国宝丽莱公司 硝酸纤维素膜(NC膜) 美国 PALL-Gelman公司 脱色摇床 江苏海门麒麟医用仪器厂 1.1.3 主要试剂配制 1.1.3.1三去污剂裂解缓冲液:15 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 试剂(终浓度) 取样量/100 ml Tris base(终浓度为 50 mM,pH8.0) 605.7 mg NaCl(终浓度为 150 mM) 876.6 mg NP-40诺乃碱(终浓度为 1%)1 ml 脱氧胆氨酸(终浓度为 1%W/V)1.0 g SDS(终浓度为 0.1%) 100 mg PMSF(终浓度为 0.05 mM) 0.871 mg Aprotinin(终浓度为 0.002 mg/mL) 0.2 mg NaVO(终浓度为 1 mM) 12.19 mg 3 注:上述试剂除了 NP-40为液体外