阴沟肠杆菌高产AmpC酶和ESBLs的检测及其耐药性研究

阴沟肠杆菌高产AmpC酶和ESBLs的检测及其耐药性研究 阴沟肠杆菌高产AmpC酶和ESBLs的检测及其耐药性研究 作者: 耿燕，张王刚，王香玲，杨会斌，张毅，李淑琴【摘要】 目的: 了解本地区阴沟肠杆菌高产AmpC酶和超广谱β 内酰胺酶(ESBLs)的流行状况及其耐药性。: 收集154株临床分离无重复阴沟肠杆菌，通过改良三维实验检测阴沟肠杆菌高产AmpC酶和超广谱β 内酰胺酶(ESBLs)，运用K-B琼脂扩散法进行药物敏感性试验。结果: 在154株菌中，18.83,的菌株单产ESBLs，22.73,的菌株单产AmpC酶， 5.19,的菌株同时产AmpC酶和ESBLs，53.25,的菌株AmpC酶和ESBLs均不产生。产不同类型β 内酰胺酶其耐药性有所不同。结论: 本地区阴沟肠杆菌产AmpC酶和ESBLs的流行处于一个相对较高的水平。高产AmpC酶菌株对 一、 二、三代头孢菌素、头孢西丁、酶抑制剂复合制剂等高度耐药，对头孢吡肟敏感，而产ESBLs菌株对三代头孢菌素、头孢吡肟均不同程度耐药，而对各种酶抑制剂复合制剂保持较高的敏感性，因此，产Ampc酶及ESBLs酶的细菌的耐药性不完全相同，产酶类型不同需选用不同类型的抗生素。 【关键词】 阴沟肠杆菌;AmpC酶;ESBLs;改良三维实验;耐药性 Study on the Detection of AmpC Enzyme Hyperproduction and Extended spectrum β lactamases and its Antimicribial Resistance in Clinical Isolates of Enterobacter Cloacae Abstract:Objective To detect the stably derepressed expression of AmpC β lactamases (AmpC) and extended spectrum β lactamases (ESBLs) of Enterobacter cloacae，and its antimicrobial activities.Methods 154 clinical strains of Enterobacter cloacae were collected from five hospitals in Xi‘an area from January 2017 to June 2017;Modified three dimensional of cefoxitin,cefiriaxone test were used to detect AmpC and ESBLs respectively;Lirby Bauer (K-B) method were performed to detect the susceptibility of 16 antimicrobial agents against Enterobacter cloacae.Results The incidence rate of single producing AmpC was 22(73,;the incidence rate of single producing ESBLs was 18(83,;the incidence rate of producing both enzymes was 5(19,;the incidence rate of producing neither AmpC nor ESBLs was 53(25,.Conclusion The study demonstrated that the prevalence of strains producing AmpC and,or ESBLs isolated from patients in Xi‘an area was at a higher level pared with other cities in our country;the strains producing AmpC and,or producing ESBLs were multiple antibiotics resistant to β lactamases cephalosporins;the best antibiotics for treatment of infections caused by AmpC producing strains in Enterobacier cloacae is Imipenem，followed by Cefpirome;the best antibiotics for treatment of infections caused by ESBLs producing strains is Imipenem,followed by Piperacillin,Tazobactam and Cefoperazone,Sulbatam;hyperproduction of the AmpC β lactamase and,or ESBLs had been documented as a prevalent mechanism of β lactam resistance in Enterobacter cloacae( Key words:Enterobacter Cloacae;AmpC enzyme;Extended spectrum β lactamases(ESBLs);The modified three dimensional testing;Antimicribial Resistance 近年来由于三代头孢菌素在临床上的广泛应用，导致细菌耐药性的不断增加。有关AmpC酶,1,和ESBLs,2,的问是目前肠杆菌科细菌感染面临的最大问题，其中最具代性的是阴沟肠杆菌，目前国内外对阴沟肠杆菌ESBLs和AmpC酶的检测方法以及如何治疗由高产AmpC酶和ESBLs的阴沟肠杆菌引起的感染都无明确的定论,3,，而且由于不同地区、不同医院抗生素的使用及其耐药趋势存在差异，本研究以阴沟肠杆菌为对象，调查本地区AmpC酶和ESBLs在阴沟肠杆菌的流行情况，明确本地区阴沟肠杆菌的耐药现状，阐明其耐药表型与耐药基因的表达关系，探讨阴沟肠杆菌临床分离株对β 内酰胺类抗生素耐药机制。 1 方法 1(1 细菌的鉴定及收集 收集2017年1月至2017年6月间西安交通大学第一附属医院、第二附属医院、陕西省人民医院、西京医院、西安市中心医院五家医院细菌室临床送检标本中培养鉴定的阴沟肠杆菌，细菌的鉴定采用全自动微生物分析仪Vitek-60或Vitek?。 1(2 药敏试验 1.2.1 方法 采用琼脂纸片扩散(K-B法)，药敏试验按NCCLS 2017年操作和结果判读(S、I、R)，药敏纸片的抑菌圈直径用游标卡尺测量并,4,。 (2 药敏纸片 头孢唑啉(KZ，30 μg)，头孢克罗(CEC，30 μg)，头孢呋新 1(2 (CXM，30 μg)，头孢曲松(CRO，30 μg)，头孢噻肟(CTX，30 μg)，头孢他啶(CAZ，30 μg)，氨曲南(ATM，30 μg)，头孢西丁(FOX，30 μg)，头孢吡肟(FEP，30 μg)，亚胺培南(IMP，10 μg)，哌拉西林,三唑巴坦(TZP，100 μg/10 μg)，头孢哌酮,舒巴坦(SCF，75 μg,10 μg)，替卡西林,克拉维酸(TIM，75 μg,10 μg)，环丙沙星(CIP，5 μg)，左旋氧氟沙星(LEV，5 μg)，阿米卡星(AK，30 μg)，头孢他啶,克拉维酸(CD02,30 μg,10 μg)、头孢噻肟,克拉维酸(CD03，30 μg,10 μg)，纸片为英国OXOID公司产品。 1(2(3 质控菌株 大肠埃希菌ATCC 2592 2、大肠埃希菌ATCC 35218(仅作为TIM、TZP和SCF三种药敏纸片的质控)、肺炎克雷伯菌ATCC 700603(仅作为产ESBLs阳性的质控菌株)，阴沟肠杆菌029M(仅作为高产AmpC酶的阳性菌株)。每周用质控菌株进行质量控制，所有药敏结果按NCCLS的标准进行判定。 1(3 改良三维实验进行阴沟肠杆菌AmpC和ESBLs的检测 1(3.1 β 内酰胺酶(BLA)酶提取物制备,5, 将1个菌落种入5 ml胰蛋白大豆汤中，35 ?摇床过夜，4 ? 4 000 r,min离心20 min，弃上清液，沉淀物放-80 ?冻融，反复5次。加入 1.5 ml 0(01 mol磷酸缓冲液(PH7(0)混匀，4 ? 12 000 r/min离心20 min，取部分上清液，经MH琼脂平板常规细菌培养阴性后，于-20 ?保存备用。 1(3(2 头孢西丁FOX三维试验检测AmpC酶,6, 在MH琼脂平板上按纸片扩散法标准涂布0(5麦氏浊度的大肠埃希菌(ATCC 25922)，平板中央贴一张30 μg的FOX纸片，距纸片边缘5 mm处用无菌刀片向平板边缘挖一放射状沟槽，由纸 片端向平板边缘方向向槽内加入30 μL酶粗提液，置35 ?过夜，观察结果。无菌水为阴性对照，E(cloacae 029 M为高产AmpC酶阳性对照。 1(3(3 头孢曲松三维试验测ESBLs 用CRO纸片取代FOX纸片，用25 μl的酶提取液加上4 μl 2 mmol,LCA取代30 μl酶提取液，其余操作同AmpC酶的检测。肺炎克雷伯菌ATCC 700603为ESBLs阳性对照,E(cloacae 029 M阴性对照。分别于槽内加30 μl酶粗提液、酶粗提液+2 mmol,L CLA(25 μl酶粗提取液+4 μl CA)、酶粗提液+2 mmol,L CLO(25 μl酶粗提取液+4 μl CLO)及酶粗提液+CA+CLO(25 μl酶粗提取液+4 μl CA+4 μl CLO)，置35 ?培养24 h。 2 结果 2(1 阴沟肠杆菌AmpC酶和或ESBLs的检出率 154株阴沟肠杆菌中，35株产AmpC酶占22.73%,29株单产ESBLs占18.83%,8株同时产两类酶占5.19%,82株均不产生两种酶占53.25%。 2(2 阴沟肠杆菌产不同类型酶耐药性 见表1。 表1 产不同类型酶的阴沟肠杆菌的体外抗菌活性(略) 2(2(1 对单产AmpC酶的阴沟肠杆菌的耐药性 IPM具有较高的抗菌活性，其次为FEP(敏感率为88(57,)，FOX高度耐药，无敏感菌株。对 一、 二、三代头孢菌素均高度耐药，CAZ、ATM、CTX、CRO敏感率分别为34(29,、31(43,、22(86,和22(86,，喹诺酮药物CIP和LEV的敏感率 (14,，氨基糖甙类药物AK的敏感率为57(14,。 均为37 2(2(2 产ESBLs阴沟肠杆菌的耐药性 IPM对产ESBLs菌的体外抗菌活性最高，敏感率达96(55,。在三种含β 内酰胺酶抑制剂的复方抗生素中，TZP敏感率最高，为89(66,，SCF次之，为86(21,，而TIM敏感率最低，仅为68(97,，FOX敏感率为79(31,，FEP敏感率为55(17,。在体外耐药表型中，仍有部分菌株在体外表现为敏感，且CAZ、ATM敏感率(34(48,和27(59,)高于CRO和CTX敏感率(24(14,)，其他6种头孢菌素的耐药率范围为55(17,,89(66,，产ESBLs菌对LEV和CIP耐药率均为62(07%。 2(2(3 同时产AmpC酶和ESBLs酶的阴沟肠杆菌的耐药性 对于8株同时产AmpC酶和ESBLs酶的细菌，IPM具有较高的敏感性(为87(5,)，其次为AK敏感率为50(0,，三种酶抑制复合制剂中，敏感率由高至低依次为TZP、SCF、TIM(25,、25,和0)，FEP敏感率为50(0,，对其余8种头孢 一、 二、三代头孢菌素和FOX均高度耐药(敏感率除CAZ为12(5,外均为0)，CIP和LEV敏感率均为25,。 2(2(4 抗生素对不产两类酶的82株阴沟肠杆菌的耐药性 IPM敏感率为100,，三种加酶抑制剂中，TZP、SCF和TIM的敏感率分别为96.34,、95(12,和86(59,，其次为FEP敏感率为89(02,，FOX的敏感率为8 1.71%。其余头孢类抗生素从一代到三代的敏感率为56(10,,80(49,，CIP和LEV的敏感率分别为60(98,和59(76,，AK的敏感率为89(02,。 3 讨论 3(1 阴沟肠杆菌产AmpC酶和或产ESBLs的分离率 ESBLs和AmpC酶在不同地区、不同菌株的分布呈现明显的差异性。本次调查结果西安地区阴沟肠杆菌 ESBLs产酶率(含同时产两种酶)为24(03,，AmpC酶的检出率为27(92,，而各地区ESBLs和AmpC酶的检出率和耐药率有一定差异: 在浙江地区,7,阴沟肠杆菌中ESBLs检出率为68.2,，AmpC酶的检出率为29(5,;四川地区,8,细菌耐药性监测表明革兰阴性杆菌中，ESBLs检出率为16(7,，AmpC酶的检出率为42(6,;佘丹阳等,9,报道阴沟肠杆菌ESBLs检出率为10(4,，AmpC酶的检出率为16(0,。可能与其环境、感染状况、治疗措施、消毒隔离措施等各种因素有关。