噬菌体效价及转导实验

噬菌体效价及转导实验 噬菌体效价测定及转导 姓名 学号: 系别:生命科学学院生物科学专业 班号: 实验日期:4月26日、5月3日 同组同学: 实验目的 1. 学习噬菌体效价测定的方法 2. 了解转导原理、学习转导实验方法 实验材料 菌种:E. coli K12 F、E. coli K12S、噬菌体裂解液 培养基:牛肉膏蛋白胨液体培养基、 EMB培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基 实验原理 1. 噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑 2.噬菌体的悬浮液是由双重溶源菌(内含一个λ及一个λdg两种噬菌体)裂解而来的，因此λ及λdg两种噬菌体是等量的。 3. λ噬菌体能够侵染大肠杆菌并能使其裂解，因此能够形成噬菌斑;λdg噬菌体能够侵染大肠杆菌但不能使其裂解，因此不能够形成噬菌斑 4.噬菌体效价/噬菌体数/ml=每皿平均噬菌斑数*稀释倍数/0.5ml*2 (λdg不能够形成噬菌斑且其数量与λ相等，因此计算时乘以2) 5. λdg是缺陷型噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因。当λdg侵染S菌的时候，就能够使得S菌具有发酵半乳糖的能力，因此菌落也会显现出发酵半乳糖的特征(菌落有金属光泽)。 6.转导子数/ml=每皿平均转导子数*稀释倍数/0.1ml*2 (因为裂解液为0.5ml，所以要乘以2);转导频率=转导子/ml./噬菌体效价*100% 实验步骤 一、噬菌体效价的测定 1)熔化100mlEMB固体培养基、100ml牛肉膏蛋白胨固体培养基 2将熔化的EMB培养基中加入6.5ml的0.1%的美蓝和2ml的2%的伊红 3)用100ml熔化的EMB培养基倒六个平板。编号EMB1-EMB6 4)用100ml熔化的牛肉膏蛋白胨固体培养基倒4个平板。编号牛固1-牛固 5)水浴加热5管素琼脂，溶解后置于50摄氏度下保温。 6)稀释裂解液:取0.5ml裂解液，加入到4.5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，稀释成了10^-1的稀释液，以此方法，再稀释到10^-2、10^-3、10^-4.并做好标记。 7)向每支素琼脂中接入0.5ml K12S，混匀，再分别取噬菌体裂解液0.5ml(10^0、10^-2、10^-4)，加入到素琼脂中，摇匀后立刻倒在牛肉膏蛋白胨平板上。 8)培养 待平板凝固后于37 ?，培养24hr 9)观察实验现象，并数出噬菌斑的多少，根据噬菌斑数量计算噬菌体效价 二、转导 1.点滴法 1)如上图，取两个EMB平板按照上图的轮廓添加试剂，注意接种的裂解液是未经稀释 的裂解液。 2)在37 ?下培养24h，然后置于室温下培养6d 3)观察实验结果 2.转导频率的测定 1)将S菌取0.5ml于空试管中，37?预热10min,加入0.5ml噬菌体裂解液， 37?继续 保温10min。 2) 用牛肉膏蛋白胨液体培养基稀释到10^-4，并注意编号 3)取0.1ml的稀释液(10^-3、10^-4)涂布在EMB平板(每种浓度对应两个EMB平板)。 h，并在室温下培养6d 37?培养24 4)观察实验结果 注意事项 1. 素琼脂一定要保持在50 ? 水浴中，防止凝固 2. 转导频率测定时一定要稀释到合适浓度后才能涂平板，保证培养后长出单菌落 实验结果及分析 一、 噬菌体效价的测定 10^0的牛肉膏蛋白胨固体培养基中长出了霉菌、2个细菌、及1个放线菌。没有出现噬 菌斑 2的牛肉膏蛋白胨固体培养基中什么也没长。没有出现噬菌斑 10^- 10^-4的牛肉膏蛋白胨固体培养基中长出了霉菌、没有出现噬菌斑 实验分析:实验失败，实验平板遭到污染，可能原因是，在倒平板、涂布及接种过 程中没有严格的按照规定来操作，导致了污染，也可能是接种的噬菌斑或或s菌本身就 被污染了。没有长出噬菌斑，可能原因是裂解液的浓度出了问题，问了下其他组的情况， 都没有长出噬菌斑，说明很可能是噬菌体裂解液出了问题，不然何以所有的组都没有长 出噬菌斑呢。 二、 转导实验 1. 点滴法 裂解液区域没有长出任何东西，F菌区域也什么都没有长(其他组也是这样的结果)，s菌区域长出了紫色的光滑菌落，在与裂解液的交界处，仍然是紫色，没有任何变化。 实验分析:此次实验做得阳性对照F菌什么也没长，说明是老师准备的F菌液本身出现了问题，而S菌与裂解液的交界没有出现不同，由上一个实验分析可以知道，是裂解液出了 问题，因此肯定不会出现转导成功的现象。 2. 转导频率的测定 所有平板长的都是紫色的菌落，对光旋转也没有发现哪一个菌落有金属光泽。 实验分析:实验失败，没有发现有金属光泽的菌落，说明长的肯定不是F菌，说明没有转导成功，由第一个实验分析，我们就知道是噬菌体的裂解液出现问题，所以没有出现预期的实验现象。 实验讨论 本次试验，全部失败，究其原因有如下: 1. 实验过程中，无菌操作不当，使得平板受到污染。 2. 噬菌体裂解液有问题 3. F菌出现了问题 避开失败，我们讨论了其他问题。 1(噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑。 2. 噬菌体的悬浮液是由双重溶源菌(内含一个λ及一个λdg两种噬菌体)裂解而来的，因此λ及λdg两种噬菌体是等量的。 3. λ噬菌体能够侵染大肠杆菌并能使其裂解，因此能够形成噬菌斑;λdg噬菌体能够侵染大肠杆菌但不能使其裂解，因此不能够形成噬菌斑 4.噬菌体效价/噬菌体数/ml=每皿平均噬菌斑数*稀释倍数/0.5ml*2 (λdg不能够形成噬菌斑且其数量与λ相等，因此计算时乘以2) 5. λdg是缺陷型噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因。当λdg侵染S菌的时候，就能够使得S菌具有发酵半乳糖的能力，因此菌落也会显现出发酵半乳糖的特征(菌落有金属光泽)。 6(素琼脂一定要保持在50 ? 水浴中，防止凝固 7(转导频率测定时一定要稀释到合适浓度后才能涂平板，保证培养后长出单菌落