血府逐瘀胶囊、血塞通胶囊对溶血磷脂酸诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响_19555

血府逐瘀胶囊、血塞通胶囊对溶血磷脂酸诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响_19555 血府逐瘀胶囊、血塞通胶囊对溶血磷脂酸诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响 [标签:来源] 作者:王阶,付莹坤,方素萍,杨戈 【摘要】 目的 观察血府逐瘀胶囊及血塞通胶囊含药血清对溶血磷脂酸(LPA)诱导的血管平 滑肌细胞(VSMC)增殖效应的影响。方法 采用贴块法培养大鼠主动脉VSMC并分为7组:空白 血清组,血府逐瘀胶囊含药血清组,血塞通胶囊含药血清组,3组分别，LPA组,卡托普利含药 血清，LPA组。以四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察不同含药血清对细胞增殖的影响;采用流 式细胞仪细胞周期和DNA含量。结果 空白血清，LPA组、血府逐瘀胶囊含药血清组较空 白血清组OD值升高(P,0.05),S期指数升高(P,0.01)。血府逐瘀胶囊含药血清，LPA组、血 塞通胶囊含药血清，LPA组较卡托普利含药血清，LPA组OD值降低(P,0.05,P,0.01);S期 指数升高(P,0.01,P,0.05)。结论 LPA、血府逐瘀胶囊对体外培养的VSMC有促增殖作用, 血塞通胶囊无促增殖作用。血府逐瘀胶囊、血塞通胶囊对LPA诱导的VSMC增殖有拮抗作用, 血塞通胶囊作用更强。其作用机制部分与抑制DNA合成、阻止细胞进入S期有关。 【关键词】 血府逐瘀胶囊;血塞通胶囊;溶血磷脂酸;血管平滑肌细胞;含药血清 Abstract:Objective To investigate the effect of the serums containing Xuefuzhuyu capsules and Xuesetong capsules on the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC) induced by 1ysophosphatidie acid (LPA). Methods Rat VSMCs were obtainded by tissue-piece inoculation and divided into seven groups:blank serum group, Xuefuzhuyu (Xuesetong) capsules-containing serum group, LPA，Xuefuzhuyu (Xuesetong, captopril) containing serum group and LPA，blank serum group. Effects of different groups on the proliferation of VSMCs was evaluated by MTT colorimetry. Analysis of cell cycle and DNA content were performed by flow cytometry. Results The optical density (OD) and the S phase fraction (SPF) of LPA，blank serum group and Xuefuzhuyu capsules-containing serum group were more increased than the blank serum group (P,0.05, P,0.01). In comparison with LPA，captopril containing serum group, OD of LPA，Xuefuzhuyu capsules-containing serum group and LPA，Xuesetong capsules- containing serum group was decreased (P,0.05, P,0.01), SPF was increased (P,0.01, P,0.05). Conclusion Xuefuzhuyu capsules and LPA promoted the proliferation of VSMCs in vitro. Xuefuzhuyu and Xuesetong capsules can inhibit the proliferation induced by LPA, and effect of Xuesetong capsules was greater. Part of the mechanism may be associated with the inhibition of DNA synthesis and preventing the transition from G0/G1 to S phase of VSMCs( Key words:Xuefuzhuyu capsule;Xuesetong capsule;lysophosphatidie acid;vascular smooth muscle cell;drug-containing serum 动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖是经皮冠状动脉成形术后再狭窄的主要病理特征,有研究表明,心肌梗死后患者血清中含量明显升高的溶血磷脂酸(LPA)可促进血管平滑肌细胞的增殖[1]、迁移[2]和去分化[3],最终导致血管腔狭窄。活血化瘀中药可广泛用于心肌梗死后的干预治疗,作为其代表药物的血府逐瘀胶囊、血塞通胶囊对LPA诱导的VSMC增殖的影响还未见报道。本实验旨在观察血府逐瘀胶囊、血塞通胶囊含药血清对LPA诱导的体外大鼠VSMC增殖的不同影响,为活血化瘀药在心肌梗死及心肌梗死介入后的选用提供可靠的理论依据。现报道如下。 1 实验材料 1.1 动物 雄性SPF级SD大鼠50只,体重180,230 g,购自军事医学科学院动物所,许可证号:SCXK-军2007-004。 1.2 药物 血府逐瘀胶囊,天津宏仁堂药业有限公司(批号F03302);血塞通胶囊,昆明圣火制药有限公司(批号20070615);卡托普利,施贵宝公司(批号0407021)。 1.3 主要试剂 DMEM高糖培养基、特级胎牛血清(FBS),美国GIBCO公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)、LPA、二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)、RNaseA、胰蛋白酶(1?250),美国Sigma公司;小鼠抗大鼠平滑肌α肌动蛋白多克隆抗体(BM0002)、SP试剂盒(SP-9002)、DAB显色试剂盒,博士德生物公司。其余试剂均为国产分析纯。 1.4 主要仪器 恒温CO2培养箱,Sanyo(日本);倒置显微镜,OLYMPUS(日本);流式细胞仪,BD(美国);酶标仪,BIO-TEK(美国);细胞培养板,Corning(美国)。 2 实验方法 2.1 含药血清的制备 SD大鼠随机分为血府逐瘀胶囊组、血塞通胶囊组、卡托普利组、空白组,每组10只。按Meeh-Rubner氏公式给予10倍等效剂量的药物,充分溶于生理盐水后灌胃;空白组给予等体 积的生理盐水灌胃。每日2次,连续3 d。第4日给药1次后1 h,腹主动脉采血,室温静置1 h,置4 ?过夜。3 000 r/min离心15 min,取上清,经56 ?、30 min灭活,0.22 μm滤膜过滤灭菌,-20 ?保存备用。 2.2 动脉血管平滑肌细胞培养及鉴定 采用组织贴块法培养大鼠主动脉VSMC。戊巴比妥麻醉大鼠,严格无菌条件下将主动脉剪断取出,用加有双抗的PBS液冲洗。将主动脉外膜撕去,沿纵轴剪开主动脉,眼科弯镊轻轻刮去血管内皮。将血管中膜剪成面积约1 mm×1 mm大小的组织块,均匀贴于培养瓶中。将培养瓶竖直置于37 ?、5%CO2培养箱内2,3 h,待组织块牢固贴于培养瓶后,即加入含20%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基,继续置于37 ?、5%CO2培养箱内培养。 组织块周围生长增殖形成单层细胞,当达到80%融合时,即进行传代培养。取第4,6代细胞进行实验。使用相差倒置显微镜观察VSMC,行形态学鉴定,并用α-actin行免疫细胞化染色鉴定。 2.3 分组及处理 实验分为7组:空白血清组、血府逐瘀胶囊含药血清组、血塞通胶囊含药血清组、空白血清，LPA组、血府逐瘀胶囊含药血清，LPA组、血塞通胶囊含药血清，LPA组、卡托普利含药血清，LPA组。血清浓度均为10%,LPA达到终浓度为10 μmol/L, PD98059终浓度为50 μmol/L。干预时间为24 h。 2.4 MTT法检测细胞增殖 取生长良好的对数生长期大鼠VSMCs,用含10%FBS的DMEM培养液制成细胞悬液,以5×107 cells/L的密度接种于96孔板,200 μL/孔,随机分组,每组设10个平行孔。置于37 ?、 5%CO2孵育箱中培养,待细胞长至70%,80%融合状态时,更换为0.1%FBS的DMEM培养24 h,使细胞同步化,然后加入不同处理因素的培养基继续孵育24 h,在孵育结束前4 h每孔加入浓度为5 g/L的MTT 10 μL,培养4 h后吸弃孔内培养液,每孔各加入DMSO 150 μL,37 ?孵育15 min后震荡混匀,用酶联免疫检测仪测定吸光度值(OD值,检测波长570 nm)。 2.5 PI法流式细胞术检测细胞周期 6孔板各孔加入不同处理因素的培养基24 h后,0.25%胰蛋白酶消化、收集细胞,用预冷的PBS洗涤2次,调整细胞数至1×106个/mL,逐滴加入预冷的70%乙醇固定,4 ?过夜。次日,离心,弃乙醇, PBS洗涤, 用含有终浓度为20 mg/mL RNaseA 酶的50 mg/L的PI染液避光染30 min,用300目筛网过滤细胞后,流式细胞仪检测。应用CellQuestPro软件获取至少20 000个细胞的荧光2(FL-2A)直方图,通过ModiFit软件分析细胞周期分布。 3 统计学方法 实验数据采用SPSS13.0统计软件分析,数据用x?s表示,经正态性及方差齐性检验,计量资料多组均数的比较采用方差分析,组间均数比较采用LSD检验,P,0.05表明组间差异有统计学意义。 4 结果 4.1 不同含药血清对血管平滑肌细胞增殖的影响 (见表1)表1 不同含药血清对VSMC增殖的影响(略)注:与空白血清组比较,*P,0.05,**P,0.01;与空白血清，LPA组比较,#P,0.05,##P,0.01;与卡托普利含药血清，LPA组比较,?P,0.05,??P,0.01(下同) 4.2 不同含药血清对血管平滑肌细胞周期的影响 (见表2)表2 不同含药血清对VSMC周期S期指数的影响(略) 4.3 动脉血管平滑肌细胞培养及鉴定结果 组织块接种于培养瓶内5,7 d,有细胞爬出,2,3周可逐渐铺满整个瓶底,成典型的峰谷样生长,倒置相差显微镜下观察,单个平滑肌细胞形态多样,呈梭形、多角形、星形或不规则形,有多个细胞突起,胞浆丰富,胞质密度高,不透明,核卵圆形居中,有多个核仁。第3代的细胞经特异的平滑肌α-actin免疫细胞化学染色鉴定,大于95%的细胞胞浆染色呈阳性。 5 讨论 以往研究表明,血管损伤后新生内膜的主要成分之一是VSMC[4-5]。从中草药中筛选有效的抗VSMC增殖药物,将为防治再狭窄开辟新的途径。本实验采用体外培养VSMC,部分模拟心肌梗死后体内过程与血清药理学方法相结合,是观察中药作用的一种较为理想的方法。LPA被称为细胞间的“多功能磷脂信使”,具有广泛的生物学效应[6]。研究发现,血清LPA的含量与急性心肌梗死的发病密切相关[7]。急性心肌梗死7 d后血清LPA水平仍高于正常水平。LPA作为一种重要的VSMC 丝裂素原,最终导致血管腔狭窄[8]。本研究显示,血府逐瘀胶囊与LPA对VSMC均有促进增殖作用,血府逐瘀胶囊与血塞通胶囊对LPA诱导的VSMC增殖有拮抗作用,其中血府逐瘀胶囊与卡托普利的作用差异无统计学意义,而血塞通胶囊的作用较之更强。 细胞周期分布的变化能够通过DNA含量的变化具体地反映出各种因素刺激后对细胞增殖的影响。S期是DNA合成期,S期指数是处在S期的细胞数占细胞总数的百分比。S期指数升高,表明细胞的DNA合成增快,细胞增殖加速。本实验结果显示,LPA和血府逐瘀胶囊含药血清都能够通过促进DNA合成,加速细胞有丝分裂,发挥其促VSMC增殖作用。血府逐瘀胶囊、血塞通胶囊含药血清拮抗LPA诱导的VSMC增殖作用也部分是通过抑制DNA合成、降低S期指数实现的,其中血塞通胶囊的抑制作用更明显,与卡托普利无差别,而卡托普利几乎完全抑制了LPA的促进DNA合成作用。 综上所述,本实验结果显示LPA对VSMC确有促增殖作用,且其作用是通过促进细胞DNA合成实现的。血府逐瘀胶囊对正常VSMC也有促增殖作用,区别于血塞通胶囊。二者对LPA诱导的VSMC增殖都有拮抗作用,部分是通过抑制细胞DNA合成,减缓细胞有丝分裂实现的,血塞通胶囊这方面的作用更明显。说明在心肌梗死及心肌梗死介入后使用活血化瘀药能够防止再狭窄的发生。但结合MTT及周期的结果可以发现,对细胞周期的调节并非活血化瘀药发挥作用 的唯一途径,以及是何原因导致了血府逐瘀胶囊、血塞通胶囊对正常VSMC的不同作用,临床在 中医辨证的基础上该如何选用还有待进一步研究。 【参考文献】 [1] Gennere I, Xuereb JM, Simon MF, et a1. Effects of lysophosphatidic acid on proliferation and eytosolic Ca+ of human adult vascular smooth muscle cells in culture[J]. Thromb Res,1999,94:317,326. [2] Ai S,Kuzuya M,Koike T,et a1.Rhn-Rho kinase is involved in smooth muscle cell migration through myosin light chain phosphorylation- dependent and independent pathways[J]. Atherosclerosis,2001, 155:321,327. [3] Hayashi K, Takahashi M, Nishida W, et a1. Phenotypic modulation of vascular smooth muscle cells induced by unsaturated lysophosphatidic acids[J]. Circ Res,200l,89:251,258. [4] Christen T, Verin V, Bochaton-Piallat M, et a1. Mechanisms of neointima formation and remodeling in the porcine coronary artery[J]. Circ,2001,103(6):882 ,888. [5] Manabe I, Nagai R. Regulation of smooth muscle phenotype[J]. Curr Atheroscler Rep,2003,5(3):214,222. [6] Tigyi G. Physiological responses to lysophosphatidic acid and related glycero-phospholipids[J]. Prostaglandins Other Lipid Mediat, 2001,64:47,62. [7] Chen X, Yang XY, Wang ND, et a1. Serum lysophosphatidic acid concentrations measured by dot immunogold filtration assay in patlents with acute myocardial infarction[J]. Scand J Clio Lab Invest,2003,63:497,503. [8] Seewald S, Sachinidis A, Dusing R, et a1. Lysophosphatidic acid and intracellular signaling in vascular smooth muscle cells[J]. Atherosclerosis,1997,130:121,131.