筋骨草抗肿瘤有效部位的提取及药效学研究

筋骨草抗肿瘤有效部位的提取及药效学研究 专 业:中 药 学 研 究 生:谢 学 建 导 师:吴 符 火 副教授 摘 要 目 的:通过对福建草药筋骨草(古田苦草)不同提取物，进行动物急性毒性和抑瘤实验，并对抗肿瘤的有效提取物进一步的进行药效学以及增效减毒实验，初步证实筋骨草的抗肿瘤有效部位以及有效部位的作用机理，为有效部位的提取和开发应用，提供理论基础与实验依据。 方 法:筋骨草的成分提取是用水提醇沉法，然后进行精制而得醇溶物和醇沉物，并对其成分进行初步定性鉴别;急性毒性实验:测定醇溶物和醇沉物的小鼠日灌胃(ig)最大耐受量(MTD)和半数致死量(LD);筋骨草醇溶物和醇沉物的抑瘤实验:选用种50 植S-180瘤株的小鼠，用等体积的醇溶物和醇沉物灌胃(ig)，计算两者的抑瘤率，以大于30%者为有效;筋骨草有效部位---醇溶物的抑瘤实验:将醇溶物配成高、中、低三种浓度的混悬液，按体重0.3ml/10g给接种后的小鼠灌胃，每日一次，以饮用水为空白。以环磷酰胺为阳性对照，隔日一次，腹腔注射40mg/kg(0.2ml)环磷酰胺。连续8天，第9天以摘眼球法取血，分离血清，测定血清中VEGF和IL-2的含量，并取瘤块、胸腺、脾脏称重，计算取出物指数;筋骨草有效部位---醇溶物的减毒实验:实验设醇溶物+环磷酰胺(20mg/kg)组，用醇溶物配成所需浓度的混悬液，给接种后小鼠灌胃(ig)，每日一次，并隔日腹腔注射20mg/kg(0.2ml)环磷酰胺;环磷酰胺40mg/kg组，每日给小鼠灌胃饮用水一次，隔日腹腔注射40mg/kg(0.2ml)环磷酰胺;空白组，腹腔注射和灌胃等体积生理盐水和饮用水。连续8天，第9天以摘眼球法取血，并取瘤块、胸腺、脾脏称重，计算取出物指数。测定血常规(血红蛋白HB、白细胞总数WBC)。 结 果: 筋骨草醇溶物抑瘤率大于30%，醇沉物低于30%;醇溶物混悬液的LD50是133.86g/kg;醇溶物混悬液在浓度大于1.12g/ml时，抑瘤率与空白组比较有显著性差异(P<0.01)，而脾脏和胸腺的重量则无显著性差异(P>0.05)，环磷酰胺组脾脏和胸腺 1 的重量与空白组比较有非常显著性差异(P<0.01)，血清中VEGF的含量无显著性差异(P>0.05)，而血清中IL-2的含量与空白组、环磷酰胺组相比都有显著性差异(P<0.05);环磷酰胺组和环磷酰胺+醇溶物组相比较，脾脏和胸腺的重量有极显著性差异(P<0.001)，血常规中白细胞数、分叶细胞、淋巴细胞都有极显著差异(P<0.001)，红细胞和血红蛋白无显著性差异(P>0.05)。 结 论: 初步实验证明筋骨草的有效部位为醇溶物，主要含有黄酮类物质。对S-180瘤株有显著的抑制作用，但作用强度小于环磷酰胺，有增强环磷酰胺作用，可减少环磷酰胺用量，减轻环磷酰胺毒性。醇溶物对免疫器官无损伤作用，可用于化疗时的辅助用药，能显著增强因化疗所致的白细胞以及免疫力下降。筋骨草醇溶物的抑瘤机理初步认为与提高机体的免疫力有关。 主题词: 筋骨草 醇溶物 醇沉物 黄酮类 急性毒性 环磷酰胺 S-180瘤株 抑瘤率 胸腺 脾脏 VEGF IL-2 血常规 小鼠 2 Experimental Studies on Extraction and Pharmacology of the Anti-tumor Effective Fractions from Ajuga decumbens In Fujian Major: Chinese Materia Medica Postgraduate: Xie Xuejian Tutor: Associate prof. Wu Fuhuo Abstract Purpose : Through animal's acute toxicity and anti-tumor and reducing toxicity and improving function experiment on different extracts of Ajuga decumbens in Fujian， it verified the anti-tumor function mechanism and effective Fraction tentatively， and offered the theoretical foundation and experiment basis for the abstraction and development for the effective Fraction. Method : The compositions of Ajuga decumbens were withdrawed by water and separated by ethanol， then refined; Alcohol solute and alcohol deposit are obtained and qualitatively identified. Acute toxic experiment: Maximum tolerance dose and 50 percents lethal dose of alcohol solute and alcohol deposit are determined by dreaching mice. Anti-tumor Experiment of Alcohol solute and alcohol deposit: On selected mice with S-180 tumor that Alcohol solute and alcohol deposit dreached， If anti-tumor rate of one Fraction exceed to 30 percents， it is considered that it is effective for anti-tumor. Anti-tumor experiment of effective composition of Ajuga decumbens --- Alcohol solute: Alcohol solute is mixed into requisite concentration. Mice are deached in the light of 0.3ml/10g once every day with vacancy group of normal sodium and positive group of Cyclophosphamide. Cyclophosphamide(40mg/kg (0.2ml)) was infected into mice abdominal cavity once every two days. After eight day ， mice were measured the concentration of IL-2 and VEGF in blood ， the weight of tumor、thymus and spleen， then work out index. Allayed toxic 3 experiment of the effective composition of Ajuga decumbens --- Alcohol solute: In the experiment， mixed liquid of Alcohol solute is deached into mice with Alcohol solute + Cyclophosphamide (20mg/kg) group， then deached into mice once every day with mixed liquid of requisite concentration， and infected Cyclophosphamide(20mg/kg (0.2ml) ) into mice abdominal cavity once every two days; With Cyclophosphamide group， Cyclophosphamide(40mg/kg (0.2ml) ) is infected into mice abdominal cavity once every two days， while mice are deached water once every day ; With normal sodium group， normal sodium is infected into mice abdominal cavity ， and mice are deached drinking water once every day. After eight day ， mice were measured the weight of tumor、thymus 、spleen and blood routine (hemoglobin HB ， amount of WBC )， then work out index. Result: Anti-tumor rate of alcohol solute in Ajuga decumbens > 30%， other compositions are lower than 30%; LD50 of mixed liquid of alcohol solute is 133.86g/kg; The Anti-tumor rate is significantly different between mixed liquid of alcohol solute group and vacancy group At concentration > 1.12g/ml(P<0. 01)， but the weight of spleen and Thymus gland are not significantly different (P> 0. 05); The weight of Thymus gland and Spleen is significantly different( P<0.01) between vacancy group of normal sodium and positive group of Cyclophosphamide. Compared to vacancy group of normal sodium、positive group of Cyclophosphamide and normal group， concentration of VEGF is not distinct ( P>0.05) in blood-serum， but concentration of IL-2 is significantly different ( P<0.05). Compared to Cyclophosphamide group and Cyclophosphamide + Alcohol solute group， though anti-tumor rate is significantly different (0.01< P<0.05)， the weight of Thymus gland and Spleen is extremely different( P<0.001). Amounts of WBC 、seg-cell and lymph-cell In blood routine is extremely different ( P<0.001)， whereas amount of RBC and hemoglobin is not distinct( P>0.05). Conclusion: The preliminary experiment proved that the effective Fraction is the flavonoids in alcohol solute of Ajuga decumbens. It take remarkable inhibition on S-180 tumour， but the intensity of function is smaller than Cyclophosphamide， strengthen the function of Cyclophosphamide， reduce dosage of Cyclophosphamide， allayed toxicity of Cyclophosphamide. Alcohol solute did not damage immune organ， and can be used such as the medicine of assisting chemotherapy， strengthen the leucocyte and immunity while chemotherapy is used. Anti-tumor mechanism of the Alcohol solute in Ajuga decumbens 4 proved preliminarily that it can improve immunity of organism. Theme word: Ajuga decumbens Alcohol solute Alcohol deposit Flavonoids Acute toxicity Cyclophosphamide S-180 Tumor Anti-tumor rate Thymus gland Spleen VEGF IL-2 Blood routine Mice 5 筋骨草抗肿瘤有效部位的提取及药效学研究 专 业:中 药 学 研 究 生:谢 学 建 导 师:吴 符 火 副教授 前 言 恶性肿瘤的主要病因病理之一是热毒蕴结，中医文献中多认为无论内热外热，如果不能及时清除，久留体内，血遇热形成瘀血，津液遇热则炼成痰，热与痰、瘀等相结，内蕴结毒形成热毒，热毒阻塞于经络脏腑，就形成肿瘤。由于肿瘤的机械压迫，致使脏器的管腔、血脉受压或梗阻，造成脏器功能失调及气血循环障碍，则易发生感染，同时晚期肿瘤组织坏死、液化、溃烂而伴发炎症。 炎症或感染往往是促使肿瘤恶化和发展的因素之一，清热解毒法就是用寒凉药物(清热解毒药)来消除发热因素，即消除或降解体内毒素，控制和消除肿瘤及其周围的炎症和水肿，而达到泻火解毒、清热散结等作用。清热解毒法治疗恶性肿瘤的作用机制 [1]现代研究明，清热解毒法具有消炎、杀菌、排毒、退热以及增强免疫等作用。根据现代药理研究报道，清热解毒药具有以下方面的作用:(1)直接抑制肿瘤作用。 (2)调节机体免疫功能，促进自然杀伤细胞NK活性，提高脾细胞白介素-2(IL-2)的生成。(3)抗炎排毒作用，清热解毒药能控制或缩小肿瘤，改善脏器腔受压或梗阻，恢复全身或局部气血循环，从而能缓解症状。(4)调节内分泌功能，清热解毒药能增强肾上腺皮质的功能，影响肿瘤发生和发展。(5)阻断致癌和反突变作用，部分清热解毒药能阻断细胞在 [2][3]致癌物质作用下发生突变。用清热解毒法治疗肿瘤，不仅有抗癌作用，对机体的免疫功能也有调节作用，从而达到治疗效果。随着研究的进一步深入，清热解毒药在肿瘤辅助治疗中的作用已得到广泛的认同。 本实验选用筋骨草为古田苦草，为唇形科植物金疮小草(Ajuga decumbens Thunb.)的全草(别名:破血丹、散血草、苦草)，收载于《福建药物志》，在民间作为清热解毒类 6 [4]药物用于防治上呼吸道感染、肺脓疡、乳腺炎等疾病。近年来，闽东(古田)地区一些肺癌、胃癌患者术后因无法耐受化疗反应，长期服用筋骨草获得良好的效果(症状改善、体重增加、许多患者三年内未见复发与转移)。2000年4月由福建中医学院立项资助，对该药进行了抑瘤初筛实验，经两次重复实验，该药水提液对昆明种小鼠S-180肉 [5]瘤的抑瘤率为73%和81%，有较好的重复性。 本实验将通过对筋骨草提取部位的毒理学和药效学研究，初步确定其有效部位，对该有效部位的有效性和安全性做出科学的评价，为进一步开发研制成为辅助手术，放、化疗治疗肿瘤的新药提供实验依据，更方便、快捷、有效地应用于临床治疗。 7 材料与方法 一 筋骨草成分的提取 1 主要实验药品和化学试剂 筋骨草，采集于福建省古田县，经福建中医学院药用植物学教研室鉴定为唇形科筋骨草属金疮小草(Ajuga decumbens Thunb.)。 95%乙醇，批号:20030509，上海联试化工试剂有限公司提供。 2 主要仪器设备 HH-2 数显恒温水浴锅 国华电器有限公司 3 方法(水提醇沉法) 取晒干的筋骨草，沸水提取三次(1:1:0.5h)过滤，三次滤液合并(减压)浓缩至一 定体积，加入乙醇沉淀(乙醇浓度80%)，冰箱静置24h后，抽滤，得醇溶物和醇沉物。醇溶物回收乙醇，趁热过滤得滤液和滤渣。滤液冷却后析出的沉淀物，用盐酸—镁粉显色法作定性试验，溶液呈现红色为含黄酮类物质。 二 筋骨草醇溶物和醇沉物急性毒性实验 1 实验动物 清洁级KM种小鼠，体重20?2g，雌雄各半，福建中医学院实验动物中心代购提供，合格证:医动字第23-007号。 2 主要实验药品 筋骨草水提醇溶物10g/ml (含生药);水提醇沉物5g /ml (含生药) 。 3 方法 3.1 筋骨草醇沉物最大耐受量(MTD)测定 经预试验，测得醇沉物一次给小鼠灌胃(ig)不足引起小鼠死亡，用一日给药3次，测定小鼠ig 给药的日最大耐受量。选18,22g 小鼠20只雌雄各半，禁食不禁水16h 后，给5g/ml(含生药)醇沉物按体重0.3ml /10g ig ，一日内连续ig 3次，每次间隔3h，日累计剂量为450g /kg (含生药)，连续观察7d ，小鼠全部存活，测得筋骨草醇沉物小鼠ig 给药的日最大耐受量(MTD)。 3.2 筋骨草醇溶物LD测定 经预试验，测得小鼠100,死亡的剂量(DM)为50 146.6g/kg;0,死亡的剂量(DN)为90.0g/kg。Dm/Dn为1.6倍，实验设4组，组间剂量比1:0.85，进行LD测定。 50 8 选18,22g小鼠40只，按性别随机分4组，每组10只，??各半。试验前小鼠禁食不禁水16h后，分别给每组小鼠ig不同浓度等体积的醇溶物混悬液: 1组小鼠ig 5g/ml(含生药)混悬液，按体重0.3ml/10g(150g/kg)。 2组小鼠ig 4.25g/ml(含生药)混悬液，按体重0.3ml/10g (127.5g/kg)。 3组小鼠ig 3.61g/ml(含生药)混悬液，按体重0.3ml/10g(108.375g/kg)。 4组小鼠ig 3.07/ml(含生药)混悬液，按体重0.3ml/10g(92.12g/kg)。 小鼠ig后连续观察3h毒性反应后，小鼠置洁净层流柜饲养，室内调控温度22-23?，湿度<60%，每天观察两次(上下午)连续7d。记录小鼠毒性反应和死亡情况结果见表1，用改进寇氏法计算LD。 50 观察指标 重点描述小鼠死亡前症状 神经系统方面:?行为及反应(包括不正常叫声、烦躁、不安、易怒、感觉过敏、少动、嗜睡或昏迷);?运动(包括肌肉抽搐、僵硬、强迫运动、松弛、麻痹等)。 呼吸及心血管方面:呼吸状态、触心前区心率快慢等。 胃肠方面:腹部胀气、大便性状和色泽。 泌尿系统:尿液量。 皮肤和毛:颜色、完整性、有无充血、毛松散等。 眼:有无眼睑下垂，眼球突出、震颤等。 三 筋骨草醇溶物和醇沉物的抑瘤实验 1 实验动物 清洁级KM种小鼠30只，体重20?2g，雌雄各半，福建中医学院实验动物中心代购提供，合格证书:医动字第23-007号。 2 主要实验药品 由上述提取得到的醇溶物和筋骨草醇沉物，试验时配成所需浓度。 3 主要仪器设备 TN-100B 扭力天平 上海第三分析仪器厂 4 方法 4.1 动物模型的建立 实验动物选用接种7d的荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，碘酊、酒精消毒局部皮肤，在 3无菌条件下(无菌操作台)，选择生长良好的S-180肉瘤组织剪取2-3mm的小块，塞入无菌套管针内，接种于清洁级KM种小鼠右前肢腋窝皮下。 4.2 试验方法 9 小鼠30只，接种，禁食不禁水24h后，根据小鼠体重(20?2g)随机分成空白组、筋骨草醇溶物组、筋骨草醇沉物组，每组10只，雌雄各半。空白组灌服饮用水30ml/kg，醇溶物组灌服等体积(30ml/kg)的醇溶物混悬液33.5g(生药)/kg，醇沉物组灌服等体积(30ml/kg)的醇沉物混悬液33.5g(生药)/kg，每日1次，置洁净层流柜饲养，室内调控温度22-23?，湿度<60%，连续7d 。第八天，将小鼠颈椎脱臼处死，剥离瘤块称重，分别计算肿瘤抑瘤率(抑瘤率>30%视为有效)，并称取荷瘤小鼠胸腺、脾脏重量。结果见表2。 四 筋骨草有效部位---醇溶物的抑瘤实验 1 实验动物 清洁级KM种小鼠50只，体重20?2g，雌雄各半，福建中医学院实验动物中心代购提供，合格证书:医动字第23-007号。 2 主要实验药品和试剂 由上述提取得到的筋骨草醇溶物，试验时配成所需浓度。 环磷酰胺注射剂，0.5g， 批号:20030406，江苏恒瑞医药股份有限公司提供。 VEGF试剂盒，批号:0213M1，大连泛邦化工技术有限公司提供。 IL-2试剂盒，批号:20031220，解放军总医院科技开发中心放免所提供。 3 主要仪器设备 TN-100B 扭力天平 上海第三分析仪器厂 TDL-4 低速台式离心机 上海安亭科学仪器厂 DDL-5 低速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂 ELX808 酶标仪 美国宝特公司 TGL-16G 离心机 上海安亭科学仪器厂 MDF-V5410 低温冰箱 日本三洋(SANYO) 5 方法 小鼠50只，接种, 禁食不禁水24h后，根据小鼠体重(20?2g)随机分成空白组，阳性对照组(环磷酰胺)，筋骨草醇溶物高、中、低剂量组，每组10只，雌雄各半。空白组灌服饮用水30ml/kg，每日1次。阳性对照组腹腔注射环磷酰胺40mg/kg(0.2ml)，隔日1次。醇溶物高剂量组灌服等体积(30ml/kg)的醇溶物混悬液67g(生药)/kg，醇溶物中剂量组灌服等体积(30ml/kg)的醇溶物混悬液33.5g(生药)/kg，醇溶物低剂量组灌服等体积(30ml/kg)的醇溶物混悬液16.8g(生药)/kg，每日1次，置洁净层流柜饲养，室内调控温度22-23?，湿度<60%，连续8d 。第九天，将小鼠以摘眼球法取血， 10 离心取血清，测定血清中的血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素-2(IL-2)的含量;随即颈椎脱臼处死，剥离瘤块称重，分别计算抑瘤率，并称取小鼠胸腺、脾脏重量。 6 统计学处理:结果用平均数?差(χ?S )表示。所有数据经SPSS统计软件分析。结果见表3、表4和表5。 五 筋骨草有效部位---醇溶物的减毒实验 1 实验动物 清洁级KM种小鼠，体重20?2g，雌雄各半，福建中医学院实验动物中心代 购提供，合格证书:医动字第23-007号。 2 主要实验药品 上述提取得到的筋骨草醇溶物，试验时配成所需浓度。 环磷酰胺注射剂，0.5g， 批号:20030406，江苏恒瑞医药股份有限公司提供。 3 主要仪器设备 TN-100B 扭力天平 上海第三分析仪器厂 CA-620 血常规分析仪 瑞典Medonic仪器公司 4 方法 小鼠30只，接种，禁食不禁水24h后，根据小鼠体重(20?2g)随机分成空白 组、环磷酰胺组、环磷酰胺+筋骨草醇溶物组，每组10只，雌雄各半。空白组灌服 饮用水30ml/kg， 每日1次。环磷酰胺组腹腔注射环磷酰胺40mg/kg(0.2ml)，隔 日1次。环磷酰胺+筋骨草醇溶物组注射环磷酰胺20mg/kg(0.2ml)，隔日1次，并 灌服醇溶物混悬液33.5g(生药)/kg，每日1次，置洁净层流柜饲养，室内调控温度 22-23?，湿度<60%，连续8d 。第九天，将小鼠以摘眼球法取血，测定血象指标(血 红蛋白HB、白细胞总数WBC)，计算指数;随即将小鼠颈椎脱臼处死，剥离瘤块称 重，分别计算抑瘤率，称取荷瘤小鼠胸腺、脾脏重量。 5 统计学处理:结果用平均数?标准差(χ?S )表示。所有数据经SPSS统计软 件分析。结果见表6和表7。 11 结 果 表1各组小鼠用药、死亡情况及有关计算表(鼠数n=10) 22 组别 剂量g/kg(d) logd(x) 死亡数 死亡率(P) P P-P1 150 2.1760 8 0.8 0.64 0.16 2 127.5 2.1055 3 0.3 0.09 0.21 3 108.375 2.0389 1 0.1 0.01 0.09 4 92.11875 1.9643 0 0.0 0.00 0.00 22ΣP=1.2 ΣP =0.74 ΣP-P=0.46 i=logd-logd=2.1760-2.1055=0.0705 12 (logLD) X=Xm-i(ΣP-0.5) 5050 =2.1760-0.0705(1.2-0.5) =2.1760-0.04935 =2.12665 -1LD=logX=133.86g/kg 5050 2Σ (P-P) 0.46 LogLD的标准误Sx=i ------------ =0.0705 ----------=0.0159 5050 n-1 9 -1LD的95,可信限=log(X?1.96Sx) 505050 -1 =log(2.12665?1.96×0.0159) -1=log(2.12665?0.03116) -1 =log(2.15781,2.09549) ,143.82,124.59g/kg LD的平均可信限 =133.86?(143.82,124.59)/2 50 =133.86?9.62g/kg 结论: 在本实验条件下，测得筋骨草醇沉物小鼠ig 给药的MTD为450g /kg (含生药); 测得醇溶物小鼠ig给药LD为133.86g/kg，LD的平均可信限为9.615g/kg。醇溶物5050 12 能测出LD，说明醇溶物大量服用有一定的毒性。小鼠中毒死亡时间都是灌胃后1天内50 2、6、8小时死亡，尤其是在灌胃后2h内死亡较多，第二天到第七天都未有死亡。小鼠中毒表现为先镇静后烦躁，并出现呼吸急促、毛发松散、肢体倾斜，尿液增加、大小便失禁，最后抽搐而死亡。 表2筋骨草各部位对S-180瘤株重量以及脾脏、胸腺重量的影响(χ?S，n=10) 剂量 瘤块重量 脾脏重量 胸腺重量 组别 (g/kg) (g) (g) (g) 30ml/kg 空白组 1.017?0.199 0.486?0.180 0.090?0.023 ***筋骨草醇溶物组 33.5 0.577?0.144 0.372?0.075 0.109?0.024 筋骨草醇沉物组 33.5 0.839?0.253 0.323?0.162 0.088?0.027 注:各给药组与空白组比较P>0.05 为空 ， P<0.05为:*， P<0.01为:** P<0.001为:*** 表2结果显示:筋骨草醇溶物组与生理盐水组比较，瘤块重量有极显著性差异(P<0.001)，其抑瘤率为43.3%。而筋骨草醇沉物组与空白组相比较则无显著性差异(p>0.05)，其抑瘤率为17.5%。脾脏和胸腺各组间都无显著性差异。 表3 筋骨草醇溶物对S-180瘤株重量以及脾脏、胸腺重量的影响(χ?S，n=10) 剂量 瘤块重量 脾脏重量 胸腺重量 组别 (g/kg) (g) (g) (g) 空白组 30ml/kg 1.058?0.383 0.475?0.094 0.134?0.030 ********阳性对照组 40mg/kg 0.368?0.055 0.338?0.116 0.045?0.010 醇溶物低剂量组 16.8 0.801?0.167 0.445?0.095 0.122?0.027 **醇溶物中剂量组 33.5 0.650?0.234 0.420?0.125 0.126?0.030 ***醇溶物高剂量组 67 0.603?0.229 0.399?0.101 0.101?0.032 注:各给药组与生理盐水组比较P>0.05 为空 ， P<0.05为:*， P<0.01为:** P<0.001为:*** 表3结果显示:筋骨草醇溶物低剂量组与生理盐水组相比较，瘤块重量、脾脏重量、胸腺重量均无显著性差异(P>0.05)。筋骨草醇溶物中、高剂量组与生理盐水组相比较，瘤块重量有显著性差异(P<0.01)，但脾脏重量、胸腺重量均无显著性差异(P>0.05)。环 13 磷酰胺组与生理盐水组相比较，瘤块重量、脾脏重量、胸腺重量均有显著性差异(P<0.01,0.001)。 表4 筋骨草醇溶物对血清中IL-2含量的影响(χ?S，n=8) 剂量 IL-2 组别 (g/kg) 空白组 30ml/kg 4.548?0.502 *阳性对照组 40mg/kg 3.446?0.989 醇溶物低剂量组 16.8 4.924?1.899 **醇溶物中剂量组 33.5 5.626?0.664 *醇溶物高剂量组 67 5.898?1.321 注:各给药组与生理盐水组比较P>0.05 为空 ， P<0.05为:*， P<0.01为:** P<0.001为:*** 表4 结果显示:筋骨草醇溶物低剂量组与生理盐水组相比较，血清中IL-2含量无显著性差异(P>0.05)。筋骨草醇溶物中、高剂量组与生理盐水组相比较，IL-2含量有显著性差异(P<0.05,0.01)。 表5 筋骨草醇溶物对血清中VEGF含量的影响(χ?S，n=8) 剂量 VEGF 组别 (g/kg) 空白组 30ml/kg 12.705?8.247 阳性对照组 40mg/kg 7.572?1.179 醇溶物低剂量组 16.8 8.918?0.934 醇溶物中剂量组 33.5 7.404?1.393 醇溶物高剂量组 67 7.909?2.151 注:各给药组与生理盐水组比较P>0.05 为空 ， P<0.05为:*， P<0.01为:** P<0.001为:*** 表5结果显示:筋骨草醇溶物低、中、高剂量组与生理盐水组相比较，血清中VEGF含量均无显著性差异(P>0.05)。 14 表6 醇溶物对环磷酰胺治疗荷瘤小鼠的瘤块及脾脏、胸腺重量的影响(χ?S，n=10) 剂量 瘤块重量 脾脏重量 胸腺重量 组别 (g/kg) (g) (g) (g) 空白组 30ml/kg 1.031?0.427 0.290?0.054 0.154?0.024 环磷酰胺组 40mg/kg 0.344?0.062 0.118?0.031 0.077?0.015 ******环磷酰胺+醇溶物组 20mg/kg+33.5 0.489?0.157 0.196?0.034 0.114?0.016 注:环磷酰胺组与环磷酰胺+筋骨草醇溶物组比较P>0.05 为空 ， P<0.05为:*， P<0.01为:** P<0.001为:*** 表6结果显示:环磷酰胺组与环磷酰胺+筋骨草醇溶物组同生理盐水组相比较，瘤块重量均有非常显著性差异(P<0.01)，环磷酰胺组与环磷酰胺+筋骨草醇溶物组相比较，瘤块重量无显著性差异(P>0.05)，而脾脏重量、胸腺重量均有极显著性差异(P<0.001)。 表7 醇溶物对环磷酰胺治疗荷瘤小鼠血液指标的影响(χ?S，n=10) 白细胞分类 剂量 红细胞数 血红蛋白 白细胞数 组别 分叶细胞129(g/kg) (10/L) (g/L) (10/L) 淋巴细胞(%) (%) 4.001?0.450 113.70?12.51 5.330?1.10 27.10?6.94 72.90?6.94 空白组 30ml/kg 3.996?0.092 110.20?3.19 2.230?0.33 20.80?7.63 80.20?8.23 环磷酰胺组 40mg/kg *********4.060?0.148 111.60?4.90 3.700?0.71 40.30?6.22 59.70?6.22 环磷酰胺+醇溶物组 20mg/kg+33.5 注:环磷酰胺组与环磷酰胺+筋骨草醇溶物组比较P>0.05 为空 ， P<0.05为:*， P<0.01为:** P<0.001为:*** 表7结果显示:环磷酰胺组与环磷酰胺+筋骨草醇溶物组相比较，血液中红细胞数和血红蛋白均无显著性差异(P>0.05)，而白细胞数、分叶细胞数和淋巴细胞数均有极显著性差异(P<0.001)。 15 讨 论 肿瘤是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤是当前严重威胁人类健康和生命的一类疾病。不论在发达国家还是发展中国家，恶性肿瘤都是5岁以上的人群中前三位的死亡原因，全世界每年死于肿瘤的人数在500万左右。因此国内外均在研究肿瘤的发病机理， [6]寻找治疗及预防肿瘤的药物和方法。 一 国内外现代医学研究 恶性肿瘤的病因主要是由于致癌的化学物质、放射线、特殊的病毒以及内源性代谢反应产生的自由基而导致正常细胞基因突变，细胞过度增殖和去分化，并有浸润及转移的特性。现代医学还证实机体免疫力低下也是肿瘤形成的主要原因之一。在西医学中作 ，，[789]为肿瘤治疗的常用方法有:手术、放疗、化疗及生物治疗。近年来随着基础医学 ，，，，[1011121314]的发展，又相继出现了热疗、电化学治疗、基因治疗等其它手段。目前肿瘤治疗主要以手术、放疗、化疗及药物(配合中药扶正培本)治疗的综合疗法。虽然手术治疗、放射疗法等对肿瘤的治疗皆有一定的效果，但二者的应用皆有其局限性，如电 [15]化学疗法在正常皮肤上形成化学性烧伤，使创面过大。手术治疗对可能一些特殊病人并不适用;现国内外对基因疗法虽进行了大量研究，但尚处在临床实验的初期阶段，还存在一些关键问题未能很好的解决，惟有药物疗法应用较为广泛。经过40多年的努力，已发现几十种有效的抗肿瘤药物，但是多数常见的实体瘤如肺癌、肝癌及胰腺癌等还缺乏有效药物，不少抗肿瘤药物在临床应用过程中产生耐药性，还存在着严重的毒副作用[16]。 [17]现代医学治疗肿瘤的药物主要有以下四类: 1 烷化剂类 具有活泼的烷化基因，可与癌细胞中的脱氧核糖核酸(DNA)交叉联结使其断裂，从而干扰癌细胞内的生物合成。代表药如环磷酰胺(CYT)、替哌(TEPA)等，其中CYT的设计运用了潜药原理，提高氮芥对癌细胞的选择性，降低对正常细胞的毒性。 2 核苷酸类 模拟正常机体代谢物质，如叶酸、嘌呤的化学结构所合成的类似物，因此与有关代谢物质发生特异性拮抗作用，干扰核酸的生物合成从而阻止癌细胞的分裂增殖。代表药如甲氨喋呤(MTX)、6-巯基嘌呤(6-MP)。 3 抗肿瘤抗生素 化学结构的多样性决定其作用机制也不尽相同。如丝裂霉素 16 C(MMC)具有烷化作用;放线菌素D(DACT)嵌入DNA从而抑制依赖于DNA的核糖核酸(RNA)合成;博莱霉素(BLM)直接损伤DNA模板使其断裂。 4 铂类配合物 能与DNA交联干扰其复制。代表药如顺铂(DDP) 近年来，恶性肿瘤的化学治疗有了较大进展，但如何进一步提高疗效，延长生存期，减轻因肿瘤化疗引起的毒副作用，是当前研究的一个热点。临床实践证明中医中药治疗肿瘤有肯定的疗效，结合我国特有的中医药治疗的综合治疗肿瘤方法成为当今治疗方向 [18]之一。 二 中医药学研究 在古代中医学文献中，虽然没有肿瘤学专著，但在许多有关医籍文献中，以症状、体征、病因病机、病位结合主证记载了很多关于肿瘤的病名。我国最早的医书《灵枢经》就认为肿瘤起因于“营卫不通”、“寒气客于肠外与卫气相搏”。汉代张仲景在《金匮要略》记载“……妇人脏肿如瓜，阴中痛，引腰痛者，杏仁汤主之……”提示了妇科肿瘤的治疗用药。近代张锡纯《医学衷中参西录》提出了用参赭培气汤治疗膈食证，为治疗 [19]食管癌提供了扶正治本的范例。中医药治疗肿瘤的疗效是确切的，这一点是不容置疑的。经典的肿瘤模式概念决定了经典的肿瘤治疗疗效标准是运用各种治疗手段达到无癌程度，而中医药治疗肿瘤，带瘤生存是其显著的特点，延长肿瘤患者的生存期，认识不到这一点就会陷于中医药治疗肿瘤没有疗效这种偏见中去。中医药治疗恶性肿瘤是全面调节身体内环境的平衡，改善或减轻癌变过程中机体的调控失常，为宿主对肿瘤的控制功能重新建立提供条件，这也许对研究中医药治疗肿瘤带瘤生存的疗效机理会开拓一个新的研究思路。同时我们必须清醒地认识到中医药治疗肿瘤在疗效测评上的不足，尤其是在研究程序和方法上缺陷，如疗效标准不统一，疗效测评操作不，掌握测评尺度 [20] 不一等等。因此，必须提高对中医药治疗肿瘤疗效测评客观化认识的重要性。 中药抗肿瘤有效成分的提取是中西医结合肿瘤研究的主要方向，诱发肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化、逆转肿瘤细胞多药耐药等是中医药研究的新思路;在辨证理论指导下进行方药加减变化、剂型改革及扩大给药途径是提高中西医结合治疗肿瘤疗效的关键环节，并强调在晚期肿瘤综合治疗中，尤应充分发挥中药不良反应小，遣方用药灵活的优势，同时指出中药在四种结合模式中发挥着重要作用，其运用的最佳时机、周期或疗程应以具体病情而定。中医理论的标准化、中药运用的现代化是中西医结合工作者 [21]多年来探索的主要问题，亦是当今中西医结合肿瘤学须解决的主要矛盾。 中医认为，热毒是恶性肿瘤的主要病因之一;现代医学研究表明，炎症和感染往往 17 是促进肿瘤发展和病情恶化的因素之一。清热解毒药不仅抗癌活性较强、减轻症状，也能控制和消除肿瘤周围的炎症、感染，在肿瘤某些阶段可起到一定程度控制肿瘤发展的作用。因此，清热解毒类中药在治疗恶性肿瘤药中占重要地位，而草药筋骨草就是属于此类中药。 [22]现代研究发现中药抗肿瘤作用的机理研究主要有以下几点: 1 直接杀伤癌细胞 如沈洪薰等研究复方参七汤(由当归、木香、陈皮、甘草、茯苓、西洋参、黄芪、黄精、半边莲、半枝莲、生半夏、生川草乌、参三七、谷麦芽、佛手花组成)对人胃癌细胞株体外抑制作用时发现，复方参七汤对人胃腺癌细胞株BGC-823的细胞分裂和集落形成有明显的抑制作用，用集落形成法测定其半数抑制浓度(IC)为0.007g生药,ml，50 在浓度较高时也有直接杀伤作用，用台盼蓝排斥实验测定其半数杀伤浓度为0.048g生 [23]药,ml。 梁福佑等研究发现， 10 μg,mL的去甲斑蝥素(NCTD) 对乳腺癌细胞显著 [24]的杀伤作用，并呈时间和剂量依赖性。 2 促进癌细胞凋亡 利用传统中药从肿瘤细胞凋亡角度治疗癌症，不仅为癌症治疗提供了新方法，而且为传统中药的发展开辟了新途径。从细胞凋亡的角度来分析发现，细胞通过发生凋亡进行细胞自杀的途径被抑制，也是细胞癌变的重要原因之一。尤其是中药复方诱导肿瘤细 [25]胞凋亡，具有毒副作用小和不易复发等优点。 有研究发现，益气养阴方、健脾理气方诱导肿瘤细胞凋亡与抑癌基因Bcl-2的表达 [26]下调和Bax基因上调有关。如榄香烯可诱导多种肿瘤细胞发生凋亡，其作用机制可能 [27]与癌基因Bcl-2、c-myc表达减少，p53表达增加有关。某些中药如黄芪、当归、枸杞、党参、灵芝等还具有通过诱生IL-2(白细胞介素2)、IFN(干扰素)等细胞因子，诱导LAK [28]细胞凋亡或增加TNF(肿瘤坏死因子)诱导凋亡的能力。许多中药及其有效成分均具有良好的诱导分化作用，如丹参酮、人参皂甙Rh、苦参、葛根、三七、金荞麦等通过分2 [29]化诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤的作用。 3 抑制癌细胞转移 如云芝多糖能抑制B16—BL6细胞在C57,B16小鼠体内的自发性肺转移，抑制肿瘤 [30]细胞对基底膜的粘附、降解。草药Sho-Saiko-To能显著降低恶性黑色素瘤在脑、肾脏及肝脏的转移发生率，通过调节基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶水平组织抑制因子 [31]的平衡，抗黑色素瘤增殖及其转移。刺五加皂甙能诱导肝癌细胞凋亡，抑制宿主肝癌生长、转移，对动物腹膜、肝肠及脾的癌转移具有明显抑制作用，对BALB,C小鼠HepG2 18 [32]移植性肝癌的生长和腹腔转移也有明显抑制作用。紫杉醇、三尖杉酯醇及高三尖杉酯 [33]醇能显著抑制B16 -BL6细胞侵袭和运动。 4 提高免疫功能。 扶助正气，调动体内的积极因素，提高机体的抗癌力和自修力，驱除邪气，抑制和杀灭癌细胞，是治疗肿瘤的根本法则。临床常用中草药经现代药理及临床研究发现有其 [34]特点，运用于临床取得满意临床效果。 如齐文杰等报道黄芪也具有抑制TNF过度分泌作用。因此，黄芪能提高机体的免疫 [35]能力，防御能力及抗瘤能力。李京等报道以当归为主药之一的扶正保真汤能通过增强免疫及造血机能，升高cAMP/GMP比值，阻滞瘤细胞于G,G期，而抑制肿瘤生长，增01 [36]强放、化疗疗效。王炳胜等报道丹参能减轻放化疗对骨髓功能的抑制，保护机体的免 [37]疫功能。 从以上的研究可以发现，中草药主要是通过调节机体的免疫功能治疗或辅助治疗肿瘤，因此免疫学指标是药物实验中的重要指标。胸腺和脾脏是与免疫应答反应密切相关的两个脏器，而药物对它们的影响可间接反应出对机体的免疫及脏器功能的影响。 白介素-2(IL-2)是T细胞生长因子，少量的IL-2可明显延长细胞毒性T细胞(Tc)在体内的存活时间，并增强其抗肿瘤效果。增强自然杀伤细胞(NK)的活性。淋巴因子激活的杀伤细胞只识别肿瘤抗原，对宿主正常细胞没有影响，而此细胞是淋巴细胞与IL-2接触后产生的一种具有高效抗肿瘤效应的杀伤细胞，对原发性及转移性肿瘤，均有 [40]明显的抗肿瘤作用。血液中IL-2发生变化时，机体抗肿瘤的免疫功能也在发生变化，测定其含量可以研究药物对机体免疫功能的调节作用。 大量实验证明，多种肿瘤的生成、转移、复发和预后均与肿瘤血管生成密切相关，因此，以肿瘤血管生成为靶点，开发血管生成抑制剂在抗肿瘤研究中是一个新的十分活 [38]跃的研究领域。肿瘤血管形成的调节异常复杂，其中许多血管形成的生长因子和抑制因子发挥了重要的作用。血管生成促进因子有VEGF、PDGF、TGF、EGF、FGF、基质金属蛋白酶(MMP)、某些白细胞介素和粘附分子等，其中只有VEGF专一作用于血管内皮细胞， [39] 是最强和最特异的生长因子。现代研究发现，肿瘤能诱导宿主对肿瘤产生血管。血管的形成 ，不仅促进肿瘤生长，也和恶性实体瘤的浸润和转移有密切关系。血管内皮生长因子(VEGF)是一个高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂原，在低氧及肿瘤血管形成中是最为重要的血管形成调节剂，可特异性地作用于血管内皮细胞，它是内皮细胞特异的有丝分裂剂及化学趋化剂:可诱导蛋白激酶及组织纤维蛋白溶酶原激活剂的产 [40]生，体外许多细胞株(肿瘤细胞及非肿瘤细胞)均可分泌VEGF。在肿瘤血管的形成 19 期，血液中的VEGF的含量必然发生变化，测定其含量变化则可以研究药物对肿瘤血管生长的影响。 中西医结合治疗肿瘤是我国与西方国家不同的、独具特色的治疗方法。由于中药可减轻放、化疗的毒副作用，如改善骨髓的造血机能，保护肝功能，减轻胃肠消化道反应，防护放射引起的肺损伤，治疗放射引起的直肠炎、膀胱炎等，尤其是在减轻放、化疗毒副作用的同时可增强机体的免疫功能、提高治疗肿瘤的效果、提高患者的远期生存率。故在放疗过程中和放疗后应给予扶正培本、养阴清热的中药，既能明显地减轻放疗所致的各种毒副反应，又能提高其临床治疗效果，即在保证其治愈率或缓解率提高的同时亦要注意提高患者的生存质量和生存期。化疗药物的毒副作用主要表现在骨髓造血功能的 [41]抑制、消化道胃肠反应 。在肿瘤治疗中，中药在提高患者免疫力，增强放、化疗敏感性，减轻放、化疗不良反应与提高患者生存质量、延长生存期等方面发挥着重要作用[42]6060。如陈信义等研究脑瘤消胶囊与,,合用时的增效减毒作用时，脑瘤消胶囊对, 60,照射具有增效作用，其抑瘤率为49.79%，并能减轻,,引起的,,,、,,,下降， 60增加免疫器官重量，恢复肝、肾功能。因此脑瘤消胶囊与,,照射合用，可明显增加 [43]其抗癌作用并降低其毒性。又如李毓等研究薏苡仁酯对人鼻咽癌细胞乏氧照射的增敏作用时发现，薏苡仁酯(,,,)是从中药薏苡仁提取的有效成分，具有抗癌和免疫调节作用。薏苡仁酯(,,,)可使,,,-2,的放射—存活曲线左移，,0和,？和,值下降。不同剂量的,,,(10-7,10-6,,,/,)使照射剂量减少10.67%,35.69%(在,37水平)，其增敏比(,,,):,0比值1.07,1.43，,？比值1.16,1.72。所以,, [44],可提高乏氧,,,-2,的辐射敏感性。 现代研究表明，中药的各类成分均有抗肿瘤的作用，主要包括蛋白质类活性成分，蟾蜍甾二烯类活性成分，多糖类活性成分，萜类活性成分，黄酮类活性成分，生物碱类活性成分，苷类活性成分。在中草药治疗方面，虽然抗肿瘤中药种类繁多，但国内外学者只对其中的十几味中药做了大量细致，阐述较清的工作，大量的中草药资源还有待于开发和研究。中药的抗肿瘤疗效虽没有西药快、强，但疗效持久，在预防或减轻肿瘤疾 [45]病有独特的作用。因此在中医药学这个宝库中寻找疗效高、稳定、持久、毒副作用小的中草药显得具有十分重要的意义。 三 筋骨草有效部位的安全性、药效学和增效减毒作用的初步评价 1 筋骨草成分的提取 筋骨草中成分的提取后，分为醇溶物和醇沉物。在用盐酸-镁粉进行显色，发现醇溶物显深红色，而醇沉物不显色。说明醇溶物中主要含黄酮类成 20 分，而醇沉物中无黄酮类成分。 2 有效部位的筛选评价 本实验结果说明筋骨草提取出的醇溶物成分可显著抑制S-180瘤的生长，抑瘤率大于30%。而醇沉物并无抑制S-180瘤生长的作用。证实筋骨草中有效部位是醇溶物。 3 有效部位的安全性评价 通过急性毒性实验测出了醇溶物成分的LD为50133.86g/kg。在实验中观察到，小鼠都在1天内死亡，尤其是在灌胃后2h内死亡较多，第二天到第七天均未有死亡。小鼠表现为先镇静后烦躁，出现毛发松散、肢体倾斜，尿液失禁，最后抽搐而死亡。说明筋骨草的醇溶物有一定的毒性，但其安全范围比较大，按成人体重(60kg)来算LD可达8032g(8kg)。 50 4 有效部位的药效学评价 本实验结果证实醇溶物在33.5g/kg剂量时，具有抑制S-180瘤株生长作用，但作用强度比环磷酰胺弱。结果证实环磷酰胺对脾脏和胸腺有一定的毒性，但筋骨草醇溶物则无影响。醇溶物可以升高血清中的IL-2的浓度，显示可以升高机体的免疫力，对间接杀伤肿瘤具有促进作用。在此实验中，结果未能证实醇溶物影响血清中VEGF的浓度，从而说明醇溶物可能不具有抑制肿瘤血管生长作用。 5 有效部位的增效减毒实验评价 本实验结果证实醇溶物在与环磷酰胺共用时，可增加环磷酰胺的治疗效果，并降低环磷酰胺对脾脏和胸腺的毒性。可明显升高因环磷酰胺治疗时所致的白细胞数量降低，增强机体的免疫功能。但在此实验中未能证实醇溶物对红细胞和血红蛋白的影响，可能是实验时间较短的原因，有待进一步研究。 21 小 结 1 本文通过对筋骨草的有效部位药效学、毒理学实验研究，证明筋骨草的有效部位是醇溶物，主要含有黄酮类成分。其在中、高剂量可以显著抑制肿瘤的生长，对免疫器官(脾脏和胸腺)无毒副作用，可以升高血清中的IL-2的含量，提高了机体的免疫力。在与环磷酰胺共用，可降低环磷酰胺对机体的毒副作用，减少环磷酰胺的用量，升高白细胞，保护免疫器官不受损伤。筋骨草醇溶物大剂量服用时具有毒性，但其安全范围比较大。 2 筋骨草醇溶物成分抑制肿瘤生长的机理初步认为与增强免疫功能有关。本课题将继续研究筋骨草对其它如艾氏腹水癌、肝癌H等肿瘤的抑制作用，以考查其抗瘤谱。22 同时进一步分离醇溶物的成分进行药效学研究。 22 参 考 文 献 [1]李佩文. 中西医临床肿瘤学[M] 第1版 北京:中国中医药出版社,1996,144 [2]张民庆,龚惠明. 抗肿瘤中药的临床应用[M] 第1版 北京:人民卫生出版社, 1998,102 [3]章永红. 抗癌中药大全[M] 第1版 南京:江苏科技出版社,2000,96 [4]福建药物志[M],(?):410-1 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本课题是在导师吴符火副教授悉心指导下完成的，三年的硕士研究生期间，恩师的谆谆教诲和无微不至的关怀令我深为感谢和终生受益。 论文完成过程中，福建中医研究院汪培清老师，福建中医学院药理毒理教研室王瑞国老师、贾铷实验员，福建中医学院药用植物学教研室卢伟副教授，福建中医学院方剂教研室张小如教授，福建中医学院药学系郭素华主任，福建中医学院图书馆、检索中心的老师给予了大力支持;同窗好友廖华军、郑远斌、叶静、刘洪旭以及宫建伟等同学给予了热忱的帮助。 在三年的学习生活中得到了研究生部杨敏主任、翁峰、朱力义、林涛老师和药学系领导的关心和帮助。 谨此，致以诚挚的感谢～ 谨向在本文中被作者引用过资料的国内外专家学者深表谢意。 26 综述: 中药对小鼠S实体瘤抑制作用的研究进展 180 摘要:本文主要综述了近年来国内外对以S实体瘤为模型的中药抑瘤实验研究，发现180 中药抗瘤作用表现有以下特点:?在一定剂量范围内，对肿瘤的发展有所抑制，并存在剂量-效应关系，但有的中药在高剂量下可能无抑制作用，甚至可能剂量在高于一定范围后，存在相反的作用;?可提高荷瘤小鼠的体内NK及LAK活性，调节血清IL-2、IL-6的水平，抗瘤作用与其促进机体的免疫功能有密切关系;?可通过减少VEGF的表达，间接抑制肿瘤血管的生长来抑制肿瘤生长和转移。?部分作用机制可能同化学药物相似，能阻断细胞生长于G/G期，将大量细胞阻滞在S期之前，控制基因的表达来抑制01 肿瘤细胞增殖过程的蛋白复制、细胞因子的产生。?能协同化疗药物的治疗，减轻化疗药物毒性，防止肿瘤细胞多药耐药的产生。 关键词:中药 S实体瘤 免疫 细胞凋亡 增效减毒 180 恶性肿瘤是当前严重威胁人类健康和生命的一类疾病，病因主要是由于致癌的化学物质、放射线、特殊的病毒以及内源性代谢反应产生的自由基而导致正常细胞基因突变，细胞过度增殖和去分化，并有浸润及转移的特性。现代医学还证实机体免疫力低下也是肿瘤形成的主要原因之一。中医药治疗恶性肿瘤是全面调节身体内环境的平衡，改善或减轻癌变过程中机体的调控失常，为宿主对肿瘤的控制功能重新建立提供条件。临床上多见的肺癌、肝癌及胰腺癌等都属于实体瘤类型，因此近年来国内外的研究人员建立以S实体瘤的小鼠为模型，研究中药对实体瘤的抑制作用，现将研究进展归纳如下: 180 一 抑制瘤块生长 柳明洙等用16.7g,kg、8.4g,kg珍珠梅乙酸乙酯提取物分别给S肉瘤小鼠灌胃，180 [1]抑瘤率分别为46,、57,。如曾茂贵等研究发现筋骨草水提液对小鼠S肉瘤抑瘤率180 [2]分别为81,和73,(两次实验)，与对照组比较均为P<0.01。周俊等发现在剂量0.21mg,(g? bw?d)时蛇床子水提取液能显著降低血清SA(9碳糖神经氨酸衍生物的总称，是细胞膜上糖蛋白和搪脂的重要成份，参与细胞表面的多种生理功能)浓度。但高剂量 [3]组[0.83mg,(g?bw?d)]血清SA高于肿瘤组。彭海燕等用龙枝提取物治疗小鼠移植性 [4]肝癌H和肉瘤S，均有较明显的抗肿瘤活性，其抑瘤率分别达63,和41,。程振22180 倩等通过小鼠荷瘤实验，证明中药抗癌I号直接作用于实体瘤，降低了肿瘤cell数和 [5]实体瘤瘤重，并有一定剂量-效应关系。赵铁华等发现3个剂量的黄芩茎叶总黄酮皆可抑制移植肉瘤S瘤株的体内增殖，量效关系较显著，以100-200mg/kg黄芩茎叶总黄180 酮的抑瘤率>30,，与对照组比较差异有高度显著性和显著性(P<0.01，P<0.05)，但其 [6]活性低于50mg/kg环磷酰胺(平均抑瘤率达90.50,)。张英慧等将柘木根水提液全组分F经聚苯乙烯吸附树脂D3 250处理和酒精分步洗脱得到的F，F和F几个组分(其1234中组分F黄酮含量最高，约占75,。给S肉瘤小鼠腹腔注射F和F实验结果显示，318013 [7]F和F都对肿瘤生长起到抑制作用(其中F的抑瘤效果比F有所提高。朴惠顺等研l331 27 究发现不同剂量小叶锦鸡儿乙酸乙酯萃取物对雌性小鼠S肉瘤的抑制率分别为28,，180 33,、52,，对雄性小鼠S肉瘤的抑制率小于30,;不同剂量乙醇提取物对S肉瘤180180 [8]的抑制率均小于30,。古建立等用化岩胶囊以不同浓度药液给S荷瘤小鼠灌胃(低、180中、高剂量分别相当于临床用量1倍、2倍、3倍)，发现以低剂量组抑瘤率最显著，为49.83,;中剂量组次之，为40.65,;高剂量组最差，为23.67,。按抑瘤率大于30, [9]为治疗有效，化岩胶囊在低、中剂量下对小鼠S肉瘤的生长有抑制作用。王传武等180 发现复抗309和卡介苗(BCG)治疗S肉瘤小鼠，血清总蛋白和白蛋白高于对照组，组180 织学检查发现实验组小鼠的肿瘤坏死程度比对照组严重。第5、10天及15天时的抑瘤率分别是14.3,，21.4,和36.4,。第5天及第10天的瘤重差异无显著性，第15天 [10]的瘤重差异有显著性(P<0.05)。 从上研究可以发现，多数药物可直接作用于小鼠体内肿瘤细胞，在一定剂量范围内，药物对肿瘤的发展有所抑制，并存在剂量-效应关系，因此可用于化疗后的辅助治疗，并可进一步开发成为新的高效低毒的抗肿瘤活性药物。但有的药物在高剂量下可能无抑制作用，甚至可能剂量在高于一定范围后，存在相反的作用，这一方面的研究要进一步研究，以指导临床正确用药。 二 增强免疫功能 海马在临床上治疗乳腺癌有效，且表现为剂量依赖性。李文琪等进一步研究发现海马显著抑制小鼠S实体性肿瘤形成，延长肿瘤潜伏时间，提高肿瘤抑制率，显著增加180 [11]胸腺和脾脏指数，显著提高免疫器官指数，海马加强巨噬细胞功能。姜秀梅等研究鸡冠花对S荷瘤鼠免疫器官的影响时发现，各实验组的荷瘤重均明显低于对照组180 (P<0.05)，各实验组胸腺和脾脏重量均明显高于对照组(P<0.05)，以高浓度组增重明显[12]。戴关海等用6.25g/kg鸡血藤水煎醇提液给予荷瘤小鼠(S)，显示低剂量的鸡血藤180 对NK细胞活性有显著提高作用(P<0.01)，而其他剂量组不明显;而各剂量组的鸡血藤对LAK活性均有明显提高作用(P<0.05)，其中低剂量最显著(P<0.0l)。各剂量组的鸡血 [13]藤对M活性均有明显的抑制作用(P<0.05)，其中高、低剂量最显著(P<0.01)。白桦Φ 等研究蒙药发现阿如拉(TR) 抑制S荷瘤小鼠肿瘤生长是通过破坏肿瘤细胞结构，使180 瘤细胞细胞器与细胞核发生改变，细胞表面微绒毛减少或消失起作用的。其能使带瘤宿 [14]主及免疫受抑小鼠血清IL-2水平增高，拮抗荷瘤机体IL-6的过度产生。白明东等天胡荽提取物的起始给药量在10g/kg时即对Hep有明显的抑瘤作用;给药量在3.0g,kg其对Hep、S、U的抑制率最高，分别为47.0,、59.0,、55.1,;给药量在1.5g18014 ,kg及3.0g/kg能明显提高小鼠网状内皮系统吞噬功能、免疫器官的重量及血清溶血素 [15]值且均有统计学意义(P<0.05)。季宇彬等研究发现2种仙人掌多糖可增加S荷瘤小180鼠红细胞膜带3蛋白的含量，降低膜交联蛋白含量，提高膜脂流动性。药用仙人掌多糖 [16]的中剂量组效果显著(P<0.01)，食用仙人掌多糖的高剂量组效果显著(P<0.01)。蒋时红等用具有健脾益气、解毒化瘀、软坚散结功效的中药复方益肝化毒胶囊对S荷瘤小180鼠治疗，测定血清IL-2、TNF-α含量，发现能提高IL-2水平，并能有效降低异常升高 [17]的TNF-α。刘春英等以S荷瘤小鼠为实验对象，分别用补气的四君子汤、活血的桃180 28 红四物汤、益气活血的加味八珍汤给药，发现对照组的NK活性、IL-2分泌水平及腹腔巨噬细胞吞噬能力均明显低于正常对照组，经灌胃2周后，益气组、活血组、益气活血组的NK活性、IL-2分泌水平及腹腔巨噬细胞吞噬能力均接近或高于正常对照组。以加 [18]味八珍汤治疗组的效果最好，抑瘤率高达45.9,。古建立等研究发现化岩胶囊的低、中、高剂量对S肉瘤小鼠的单核吞噬细胞功能无影响，但均可提高淋巴细胞转化率，180 [19]以中剂量效果为好 。 在以上的实验中发现，中药可提高NK及LAK活性，改善荷瘤小鼠红细胞膜功能，调节荷瘤及免疫受抑小鼠血清IL-2、IL-6水平，证明中药具有的抗肿瘤作用，与其促进机体的免疫功能有密切关系。从以上研究还发现中药的来源和适宜剂量对肿瘤的治疗是很关键的。临床上用中药抗瘤时，多种单味中药联合应用可能比单味中药作用强，符合中医的辨证施治指导原则。 三 抑制肿瘤血管生长 冯刚等发现薏苡仁注射液具有明显的抑制S肉瘤生长作用，用药后瘤体内微血管180 密度均明显低于对照组，大、中剂量组均可下调S瘤体内VEGF、bFGF的表达。薏苡180 [20]仁注射液对肿瘤血管形成均有明显抑制作用。孔庆志等用苦参素、莪术油、薏苡仁3种药物给S小鼠灌胃，发现三者均具有明显抑制肿瘤生长的作用，大剂量时抑瘤率分180 别为31.36,，46.68,，46.21,，瘤体内微血管密度均明显低于对照组，并可抑制瘤 [21]体内VEGF、bFGF的表达。苦参素、莪术油、薏苡仁对肿瘤血管形成均有明显抑制作用。 血管内皮生长因子(VEGF)是一个高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂原，在低氧及肿瘤血管形成中是最为重要的血管形成调节剂，体外许多细胞株(肿瘤细胞及非肿瘤细胞)均可分泌VEGF。因此降低VEGF的表达可以抑制肿瘤血管的形成，从以上的研究可以看出中药是通过减少VEGF的表达，间接抑制肿瘤血管的生长来抑制肿瘤生长和转移。 四 促进细胞凋亡 李岩等用形态学检测方法(Giemsa染色法)和流式细胞光度术检测白桦三萜类物质(TBP)诱导的S肉瘤细胞调亡时，发现1.2g/kg剂量的TBF对带瘤小鼠生命延长率为180 [22]41.04,，可诱导S肿瘤发生细胞凋亡，G,G期细胞比例增加，S期细胞比例下降。18001 包素珍等发现蛇六谷对S肉瘤小鼠抑瘤率可达51.08,，对G、S、G,M期细胞分别18011 [23]为37.8%，46.7%和15.5%，将大量细胞阻滞在S期。王彦刈等在观察不同剂量复方抗瘤冲剂对S肉瘤抑瘤作用时，发现其对肿瘤细胞有诱导凋亡的作用，Bax(促细胞凋180 亡基因)的表达水平用药后有明显升高，细胞周期用药前后没有显著改变。复方抗瘤冲剂对CD(细胞粘附因子)表达也有明显的抑制作用。 复方抗瘤冲剂的抑瘤活性与其54 [24]诱导细胞凋亡有关，凋亡是通过上调Bax的表达水平来实现的。陈清勇等用复方抗瘤合剂对小鼠S肉瘤进行治疗，以对照组为基数，用药组有不同程度的抑瘤率(P<0.05180 [25]或P<0.01)和不同程度的P阳性细胞数降低(P<0.01)。蔡宇等也发现养胃抗瘤颗粒53 对S肉瘤细胞中P和PCNA(DNA多聚酶辅助核蛋白)表达均有抑制作用，且两组差18053 [26]异显著(P<0.05)。 29 中药在临床应用时，就发现具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。现证实中药成分的作用机制可能同化学药物相似，能阻断细胞生长于G,G期，将大量细胞阻滞在S期之前。01 并通过控制基因的表达来抑制肿瘤细胞增殖过程的蛋白复制、细胞因子的表达，从而抑制肿瘤的生长和转移。 五 增效减毒 临床实验证明灵芝、白花蛇舌草、汉防已具有抗癌作用，而活血化瘀药有明显的放射增敏作用。王玉龙等发现方中以抗癌药为主，以活血化瘀、补养气血等药为辅的“泰乐抗癌增敏口服液”能使博莱霉素(BLM)的抑瘤效应增强60%以上，联合治疗的S180 [27]肉瘤小鼠存活时间比单独用BLM延长21%。韩莉等以S实体瘤小鼠为模型，观察到180 3组不同剂量的合欢皮皂甙及合欢皮皂甙加环磷酰胺组的抑瘤率分别为25.4,，35.1,， [28]40.5为，77.4,呈明显显效关系与环磷酰胺合用效果最佳。孙付军等建立以小鼠S180肿瘤细胞多药耐药模型，给予苦参碱4周后，苦参碱明显降低化疗诱导后耐药细胞P、170 [29]LRP的表达率和ROPO II活性。张勇研究中药神龙液配合放疗对小鼠S肉瘤的放射180增敏效应时将各组抑瘤率与对照组抑瘤率比较，神龙液组为22.75,、单放组为30.69,，神龙液加放射组为51.85,，说明中药神龙液配合放疗对小鼠S肉瘤有放射增敏效应180 [30]。曹勇等发现补肾化瘀解毒方能显著增强顺铂(DDP)对小鼠肉瘤S的抑瘤作用180 [31](P<0.05)。 从以上研究证实中药可通过调节通过相关生物活性物质，增强化疗药物的治疗效果，减少化疗药物的用量，减轻其产生的毒副作用，并有干预化疗诱发的肿瘤细胞多药耐药的产生，有利于患者的治疗。 30 参考文献 [1]柳明洙,张学武,朴龙等. 珍珠梅提取物对小鼠S肉瘤的抑制作用[J] 中华180综合临床医学杂志 2003,5(3):18-9 [2]曾茂贵,贾铷,吴符火. 筋骨草对小鼠S肉瘤的抑瘤试验[J] 福建中医学院学180 报2003,13(2):30-1 [3]周俊,殷学军,王瑞等. 蛇床子水提取液对小鼠S肉瘤的抑制作用[J] 癌180变?畸变?突变 2001,13(3):160-3 [4]彭海燕,章永红,王梦等. 龙枝提取物对小鼠H和S移植瘤的抑制作用[J] 22180中西医结合学报 2004,2(3):213-5 [5]程振倩,杜慧真,孙秀珍. 中药抗癌I号对S腹水瘤和实体瘤的抑制作用[J] 180山东医药工业 2003,22(4):52-3 [6]赵铁华,花宝金,石艳华等. 黄芩茎叶总黄酮对小鼠肉瘤S瘤株体内增殖的抑制180作用[J] 中国中医药信息杂志 2001,8(7):34-5 [7]张英慧,徐誉泰. 拓木根黄酮注射液对小鼠S肿瘤的抑制作用[J] 佛山科学180技术学院学报(自然科学报) 2001,19(3):75-7 [8]朴惠顺,金光洙,张善玉. 小叶锦鸡儿对小鼠S肉瘤的抑制作用[J] 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