半定量RT—PCR检测少量兔血管内皮细胞中特异mRNA的
达
半定量RT—PCR检测少量兔血管内皮细胞
中特异mRNA的表达
200O年3.}I第17卷第l期广州中医药大学
Mh200O,Voll7.N?lJoumaiofG?曲
?Umvemit~ofTrMifion~lC)mne~M~icine8l
,一zz
,半定量RT—PCR检测少量兔血管内皮
细胞中特异mRNA的表达
V,
堕丛’,堡重差,王奇高国仝,程淑意’,赖世隆’
(1.,州中医药大学DME中心.广州510405;2广州中医药大学第二附属医院,广州510120;3.中
山医科大学生化教研室.j-”州510~9)
摘要:目的:半定量检测体外培养的少量兔血管内皮细胞中待异mA的表达.方法:用P}】肌na出雠
套司的快速微量mA提纯试剂盒从免内皮细胞中直接提取出mRNA.并以此为摸板,用半定量I?一PER
技术挂洲培养的兔血管内皮细胞中内皮素(田一1)mRNA的相对台量.结果;从1十兔血管内皮细胞中提
取出未降解的mRNA,A2A瑚)18;用半定量I?一PER技术测定出田
一1mRNA的表达.结论:本实验
嚣屯篓挂:兔肢啦主置词:毫里4粤传学;睾垒壁丝垦皇/方法;RN.
离和挺纯;兔J’u
中圈分类号:R39233文献标识码:Am,f,,v
半定量反转录一聚合酶链反应(semi—
quantitativerevetranscriptionandymase
Chainreaction,SqRT-PCR)是近年来常用的
一
种简捷,特异的定量RNA测定方法…1,
通过mRNA反转录成cDNA,再进行PCR扩
增,并测定PCR产物的数量,可以推测各
样品中特异mRNA的相对数量.虽然本方法
较斑点杂交,Nolthem印迹法等所需的样品
大为减少,但对于培养的细胞,仍需l以
上的细胞数量_2J.为了检测培养的少量血瘀
证兔模型以及对照组兔的血管内皮细胞中特
异mRNA的含量,本实验采用Pharmacia
Bioteeh公司的Qujck叩MicromRNAPu一
cation试剂盒,从l个细胞中直接抽提出
mRNA,并用半定量RT—PCR技术,检测了
培养的兔血管内皮细胞中内皮素(Endothe—
lin-1,ET-I)mRNA的表达.
1材料与方法
1.1动物新西兰纯种兔,雄性,体重
收翦日期:1999—0吕一12;
作者茸彳r:第一作者.男,1964年J月出生,副研究员
基金项目:国家中医药管理局资助课珂(o95?35)
1.0—1.5ks,由广东省卫生厅医用实验动物
场提供.
1.2试剂QI1ickPr叩圆MicromRNAPu商ca_
tionKit和相应的cDNA合成试剂盒,购自
PharrmciaBiotech公司.dNTP,酶购自
n0帮公司.LowDNAMASSLadder和RNA
酶抑制剂(RNasin)购自LifeTechnologies公
司.焦碳酸二乙酯(DEPC)购自sma公司.
1,3细胞培养按本室建立的血瘀证模型
兔主动脉血管内皮细胞培养方法IsJ,选用原
代细胞进行实验.
1.4mRNA的镧备取l的内皮细胞,用
Pha~aciaBiotech公司的快速微量ndtNA提
纯试剂盒提取细胞ndtNA.提取完毕后,共
获得0.4mLmRNA溶液,加入加以的30
mol/LKOAc,10t,L糖原溶液(10异/L)及
2.5倍体积的无水乙醇,一2o沉淀过夜,
4离心(相对离心力为16000g,
10rain)后,一75保存.
将mRNA沉淀用70%乙醇洗涤干燥,
广州中医药大学2OO0年第17卷
加经DEPC处理的无菌水混匀后,用微量比色
杯(经去RNA酶处理)在Phanr.acia4O0O型紫
外分光光度计上测定OD值,重复3次,用
5%聚丙烯酰胺凝胶电泳检查mRNA的质量l4J.
1.5反转录取25ngmRNA,置65?变性
10min,之后在冰上冷却..在1.5mLEppen—
doff管中依次加入下列物质:热变性25ng
mRNA,l/zLOligo(dT)l8(0.5g/L),eDNA
合成试剂盒中第一链反应混合物(含鼠原逆
转录酶M—MuLV,dYl37和反应缓冲液)l
份受8oURNasin,总反应体系为33,混
合均匀后,于37?保温lh.
1.6PCR扩增兔ET—l寡核苷酸引物参
照TakagiH.的文献_5.由上海生物工程公司
合成,可以扩增出自201bp一64Obp(产物
为44Obp)的兔ET一1eDNA片段
取2.0?L反转录液(eDNA),加入
0.2nmaol/LdNTP.1.5nln3o1/LMg,10uL
10xb1.1~G:’T.40pmol/LET—l寡核苷酸引物,
总反应体积50.最后加入50石蜡油.
PCR反应条件为95?5min.然后进行下列
循环:95?lmin,62?45S,72?1win,共
32次循环.之后72?再延伸7rain.
1.7PCR扩增产物的定?检测准确吸取
l0uL扩增产物,用5.0%聚丙烯酰胺凝胶电
泳进行分离,每次电泳都加2的定量
DNAlllarkel~,2/zLtmarkers电泳后可分离出6
条分子量分别为2t300,l200,800,4CO,
200,和100bp的条带,这6条带分别含
100,60,4o,20,l0,5喀的DNA,其
DNA含量与条带的IOD(Integralopticalden.
sitv)值呈直线相关关系.溴化乙锭(EB)
染色后,在UVP凝胶图像
仪上观察记
录实验结果,并根据定量markel~所得到的
电泳各条带DNA含量和IOD值的关系曲线,
对每一PCR扩增产物进行定量计算分析,
数据表示(?s),单位为咏.
2结果
2.】兔血管内皮细胞mRNA提取与鉴定
用快速微量mRNA提纯试剂盒从l个内皮
细胞中直接抽提出mRNA,A26o/A均在
1.8L2上.经EB染色的凝胶显示,mRNA呈
弥散状,基本集中在5,l0kb范围(图1).
2.2兔血管内皮细胞ET一1mRNA的RT—
PcRET一1mRNA的RT—PCR电泳结果发
现,在一定的条件下,扩增出44Obp的特异
带,无明显的非特异产物出现.为排除可能
的污染,在实验中同时设置两个阴性对照
组,一是以m/~NA为
直接进行PCR反
应,另一组不加任何模板.结果表明均未扩
出44Obp的ET一1目的eDNA片段(图2).
2.3RT—PCR扩增产?与总mRNA模板?
的关系分别取25,50,100,150.2OOng
的mRNA进行RT—PCR反应,随着mRNA
的增加,扩增产量也增加,存在明显的剂量
—
效应关系(图3).根据定量markers计算
出扩增产物量,绘制出扩增产量与mRNA模
板量的关系曲线(图5),用少至0.25ng
mRNA即可检测到ET一1mRNA的表达.
多次取同样量的mRNA模板(25)数
份,进行RT—PCR反应,反应结果都表明
其PCR产量相近(图略),从多个泳道计算
分析扩增产量为(11.8?0.48)ng(n:5
次),说明该方法具有良好的重复性.
2.4RT—PCR扩增产?与循环次数的关系
取上述mRNA模板200ng,分5次进行RT
—
PCR+分别为l5,20,25,30,35个循
环,电泳后发现其扩增量与循环次数密切相
关(图4),循环次数在20—35次范围内,
RT—PCR的产量的对数值与之呈直线正相
关(图6).上述结果都经5次重复验证.
3讨论
目前RT—PCR实验一般都需对组织或
细胞进行总RNA的制备,由于常规的异硫
氰酸胍一酚一氯仿法仅适用于l06个细胞以
上的ILNA提取,且制备时间稍长(4h)_2J,
mP,NA易降解,对于从更少量的细胞中提取
RNA就较困难.为了检测体外培养的血瘀
弟1期胨波.等半定量册咄检测少量兔血管内皮细胞中特异mRNA
的表达83
证兔模型血管内皮细胞中ETmRNA的表达,
须将单个模型兔的血管内皮细胞进行培养并
传代,而原代培养的内皮细胞数量较少,传
至第5代的内皮细胞数量也不多本实验采
用PharmaciaBiotech公司的快速微量mRNA
提纯试剂盒,从培养的lO5个血管内皮细胞
中,仅用15mln就抽提出含量较纯的mR—
NA,较传统方法快捷,简便而稳定.
以半定量RT—PCR为基础建立起来的
mRNA含量测定技术,较含内标化的RT—
PCR定量测定mRNA的方法更为简便可
行….这种方法不另设”内标准”,排除了
两对不同引物之间的相互抑制和灵敏度差
异,而且具有明显的剂量一效应关系和良好
的重复性.本实验在25,200ng的mRNA模
板量及20,35次循环范围内,RT—PCR扩
增产物与上述两因素呈直线正相关,且在同
一
用量(如少至25的mRNA模板)和同
样循环次数(32次)条件下,具有良好的
重复性.虽然此法只能测定mRNA的相对含
量,但在比较模型组和对照组样品之间特异
mRNA表达差异时亦足以说明问题另外.
由于本实验进行ET一1RT—PCR所需的mR.
NA模板量较少,在合成了其他相应加0
?恩暑瓷警雷躲i簟暴::朋6RT—PCR扩增产量Imr_】与慵环玻敦(?
lit-】的美燕
广州中医药大学200O年第17卷
素和液闪测定,有更安全省时的优点.
半定量RT—PCR方法除了要求反转录
和PCR条件完全一致外,相比较样品之间
晟好同批进行RT—PCR,对于用凝胶扫描
检测PCR扩增产物来说.更适宜在同一块
凝胶上进行电泳分离_1.如果样品数量多,
由于泳道限制,就不能同时在一块胶上电
泳.而本实验采用了”feTechnologies公司的
定量Markets,通过计算分析,得到PCR扩
增产物的含量,这样就可对同批扩增的样品
进行多次重复电泳检测,以提高定量的准确
性和可靠性.
(致谢:奉工作得到奉校免疫研究室王
,
周联老师厦黄丰博士的大力支持和帮助,在此致以
衷感谢!)
参考文献:
【1]张晨晖.李情红.张继峰.等一氧化氮台成酶
(NOS)基因表达的半定量檀鬟I厦其运用[J生理
.1994.46(4):.~t47
2]cbmP,SaechiN.
isohai~byacidgltamdinium
sepI0d0f删A
耐m叩_JJAlIBl陆舶.1ej~/,l:l56
[3]脒云波,王奇,王培训.等血寮证兔模型血管内
皮细胞培养的形态结梅改变[J]中国中医基础医
学杂志.1999,5(5):12
_4gREPdy(A)RNA的制备[Mj.见:(美)
F奥斯伯等着颜子颍.王海韩译精编分子生物
学实验指南.北京:科学出版社.199B.130—131
_5]蛳H,R曲PS.dn由SD,dBd0lld
礁di越edojgg田dI皿Ii0inh呻dr椭
咖?印id谴.曲LJ]hg.q心I?
Vi&】日l帆P,1994,35(J):134
6]uM,RM.JS,d.AI口帆0f
?cl?rI曲emd&??c~eel:tct.sintI-e
Bll删}啪n[J].G皿dt,哪.8”/【2):454
[7]高国全.蚺志彬,马洞泉大鼠脑,肝和前列腺一
氧化氟台酶mPd’~A表达[】]中山医科大学,
1997,l8(增刊):25
Semi-QmmlltaliveRT-PCRAnalysisforSpec~mRNAE耳lre
MinuteQuantityofRabbitVascular勘删b山diIlCells
CHENYunbo,ft0UMe,~2,WANG,
0m,CHENG鼽州,LA/鼎渤
【1.D崛Cent~GgI-lJrdv~wdty0f删.GgI-510405.a血B;2,C曲k田劬嵋y.se叫
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G曲-1.hivm~y0fT0?,0EhoI】510120.0Ii呻;3姊0fB啪i哪.SunYat-sen删印0fMedi~J?.
G|埘w州510089.chi舶)
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rabbitv日蚓】IarendothelialcellsTotaltuRNAw舾abstractedflx~nrabifiteado~lialceilswithOl;ck印
施ca-omRNAnlrificationKit.UsingmRNAasateraplate,therelative伽l姗t.fD-山tIldiI卜l(ET-1)
mRNAwas珊1aledby一quantitativereveYt~transcripn0nandpdym~chain弛?6?(Sq~-PCR)
method.Resudtsshowedthattheu|lderadedmRNAwaseXtlt~qedfranlcultu
redrabbitvasculareft—
dothelialcells,anditsratioofAwasI?than1.8.Thequ~tityofET-/isolationandpurification;RABBITS