镉离子胁迫菱后根系活力与过氧化物酶活性的测定

镉离子胁迫菱后根系活力与过氧化物酶活性的测定 09050411孙娜 09050412 严志祥 09050413 陈乐 植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和代谢水 平即根系活力直接影响植物地上部的生长和营养情况以及产量，使植物 生长的重要生理指标之一;过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高 的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系， 在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可 2+以反映某一时期植物体内代谢的变化。利用不同浓度Cd处理菱幼苗，研究重金属离子对菱生长、根系活力、过氧化物酶(POD)活性的影响，2+Cd各处理浓度均抑制菱幼苗生长。 本次实验材料来自南京师范大学实验室，待菱角萌发后三周 2+在塑料桶中用Hogland溶液培养，Cd浓度分别为5、10、20mg/ml,以不 2+加Cd为对照。每个浓度两组,对照组一组. 2+ α-萘胺氧化法测定Cd胁迫菱的根系活力 植物根系能氧化α-萘胺，生成红色的α-羟基-1-萘胺，并沉淀于有氧化能力的根表面，使这部分根染成红色，根对α-萘胺的氧化能力与呼吸强度有密切联系。生成的红色偶氮化合物在PH 7.0时在510 nm处有最大吸收峰，分光光度计测定其吸收值。 1〉 取50μg/ml的α-萘胺和磷酸缓冲液各25ml于三角瓶混匀，须根系洗净吸干，取0.2g 浸于三角瓶,同样取α-萘胺和磷酸缓冲液各 25ml于另一三角瓶,不放根系作对照,5分钟后两瓶各取2ml,按步骤3座第一次测定。 2〉将两三角瓶置于25?恒温箱避光保存60分钟后，各取2ml，按步骤3进行第二次操作。 3〉取2ml培养液加10ml水混匀，再顺次加入1ml对氨基苯磺酸与1ml亚硝酸钠，混匀观察颜色变化，再定容至25 ml，室温25分钟，于510nm处测OD值。 4〉作曲线：以50μg/ml的α-萘胺为母液，配制40，30，20，10，5，0 μg/ml溶液各10ml，各取2ml，按步骤3分别反应，测OD值，以OD值为纵坐标，浓度为横坐标，作标准曲线。 5〉分别查对标准曲线，计算出实验组和对照组实验前后对应的 α-萘胺浓度。 2+胁迫的菱叶的过氧化物酶活性 比色法测定Cd 在有过氧化氢存在下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶褐色物质,该物质在470 nm处有最大吸收,分光光度计测量吸光度变化来测 定过氧化物酶活性。 1〉 制反应混合液：取100mmol/L磷酸缓冲液（PH 6.0）50ml 于烧 杯中，加入愈创木酚28μL，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈 创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19μL,混合均 匀。 2〉 不同浓度胁迫的菱的叶子选取较新鲜的两片，称重后剪碎，放 入研钵中加3ml磷酸缓冲液研磨成匀浆，以4000rmp低温离心 15分钟，上清夜转入100ml容量瓶中，残渣再用2ml磷酸缓冲 液提取一次，上清夜并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下 备用。 3〉 取两只比色杯，一只加3ml反应混合液，再加0.2ml磷酸缓冲 液调零,另一只加3ml反应混合液, 再加0.2ml酶液,立即开始 计时,测量OD值,每10秒读一次数,一分半钟时结束。 4〉 计算酶活性（U/gFW?min）=?A470×Vt/ W×Vs×0.01×t ΔA470------反应时间内OD变化值 Vt---------提取酶液总体积（ml） W--------植物鲜重 Vs--------测定时取用酶液体积（ml） t--------反应时间 不同浓度α-萘胺反应标准曲线 40 30 20 10 5 0.7010.5350.364000.0820.181 各组实验经对比得数据如下； 2+0 5 5 10 10 20 20 Cd浓度 （mg/ml） 4 12.5 10 4 3 9.7 8.9 α-萘胺浓度 （μg/ml） 取相同浓度的均值得图如下 20 11.25109.3 543.5 0 2+2.2 Cd 2+0 5 5 10 10 20 20 Cd浓度 （mg/ml） 7235.3 8537.6 3907.5 6185.9 6882.4 616 酶活性 （U/gFW? min） 经过有效数据的取舍得图如下 8537.6 7235.3 6185.9 616 051020 (1) 在高等植物中，重金属的毒害主要表现在抑制植物水分的吸收 和运输，抑制光合作用、呼吸作用，抑制氮素代谢及细胞分裂等方面。 从而使植物出现褪绿、萎黄、矮化、物候期延迟和生物量下降，严重 2+者致死。本实验中菱幼苗生长受到Cd、抑制是呼吸作用、蒸腾作用 等方面受到破坏的综合结果，因为它们是植物最基本的生理活动，一 旦受到抑制必然导致整个植株代谢过程紊乱，生长发育受到影响。 (2) 过氧化物酶(POD)是植物抗氧化酶系统中重要的酶。它在活性氧 的清除、抑制膜脂过氧化等植物抗逆生理方面发挥作用。本实验中 2+Cd处理引起POD活性变化，反映了重金属胁迫使活性氧自由基增多， 2+ +膜脂过氧化加剧。在低浓度Cd处理时，植物体内POD受到活性氧自由基的诱导，活性上升，参与清除自由基；在长时间高浓度作用后， 酶系统就会被重金属离子破坏而使POD活性下降,植株对自由基和过氧化物的防御能力减弱。 (3) 根系活力的测定中每组实验数据较接近,较大原因是材料在同一个桶 中培养,另外本次实验取材较杂,由于菱的培养空间有限,换水次数以 2+及营养不够导致菱生长情况不好,且各组在未加入Cd胁迫前生长情况不一,还有的组为临时摘取的野菱,所以取材是该实验失败的一个 原因.当然与实验中的个人操作和仪器的使用也有一定关系. (4) 酶活性的测定在舍弃无效数字后的图象比较能说明正确的实验结果,这说明是由于个人操作失误造成的.