[word doc]胰高血糖素样肽-2对小鼠小肠黏膜作用及其受体在体内的分布

[word doc]胰高血糖素样肽-2对小鼠小肠黏膜作用及其受体在体内的分布 胰高血糖素样肽-2对小鼠小肠黏膜作用及 其受体在体内的分布 现代中西医结合杂志 ModernJournalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine2010 Oct,19(30)’3237’ 胰高血糖素样肽一2对小鼠小肠黏膜作用及其 受体在体内的分布 韩伟’,朱亮.,马晓健,宫德_tY-,邹原 (1.怀化医学高等专科学校,湖南怀化418000;2.大连医科大学,辽宁大连116023) [摘要]目的观察胰高血糖素样肽一2(GLP一2)对小鼠小肠黏膜的作用效果;检测胰 高血糖素样肽一2受体(GLP一2R)在小鼠不同脏器的分布和表达.方法选用5,6周龄的 雄性健康BALB/C小鼠,体质量17,20g.随机分为3组,腹腔注射组9只,脑内注射组9只, 对照组8只,分别给予相应处理,3d后处死小鼠,做组织切片进行HE染色,观察小鼠小肠黏 膜的组织学变化,用免疫组化方法检测GLP一2R在不同脏器的表达和分布.结果?小鼠 经腹腔注射GLP一2后,小肠不同肠段黏膜的绒毛高度较对照组明 显增加(P均<0.05);脑 内注射组的肠黏膜无明显形态学变化.(GLP一2R在小鼠胃,空肠,结 肠,气管等部位均有表 达,而食管,肝,肺,肾与膀胱显阴性.?腹腔注射组的GLP一2R表达较 对照组显着下调(P< 0.05),而脑内注射组的GLP一2R表达无变化.结论GLP一2能刺激 小肠黏膜上皮增厚,增加小肠不同肠段黏膜的 绒毛高度;小鼠的胃,空肠,结肠,气管均有GLP一2R的表达,食管,肝, 肺,肾与膀胱无GLP一2R的表达. [关键词]胰高血糖素样肽一2;小肠黏膜;胰高血糖素样肽一2受体; 受体表达 【中图分类号]R一332[文献标识码]A【文章编号】 1008—8849(2010)30—3237—04 Effectsofglucagonlikepeptide2onmUCOUSmembraneofsmallintestinea nditsreceptordistributioninmice HanWei,ZhuLiang,MaXiaojian.,GongDezheng,ZouYuan (1.HuaihuaMedicalCollege,Huaihua418000,Hunan,China;2.DalianMedi calUniversity,Dalianl16023,Liaoning,China) Abstract:0bjectiveItistoobservetheeffectofGLP一 2onmucousmembraneofsmallintestineanddetecttheexpres— sionanddistributionofGLP一 2Rinthedifferentpartsofdifferentorgansinmice.MethodsMaleandhealthyBALB/Cmice (5to6weeksold)weighing17to20gwereusedanddividedintocontrolgroup(n=8),GLP一2cerebralcavitytreatment group(rt=9)andGLP一 2cavumabdoministreatmentgroup(n=9)randomly.Allanimalsweretreatedwithcorresponding method.Threedayslater,themiceweresacrificed.Thehistologicalchangesofmucousmembraneofsmallintestineinmice wereobservedbydyeingwithhematoxylinandeosinstaining,andtheexpressionanddistributionofGLP一2Ringastrointesti— naltissueweredetectedbyImmunohistoehemistry.Results? AftercavumabdoministreatingwithGLP一2,themucosalvillus indifferentsectionofsmallintestinegrowobviouslyhighercomparedwithcontrolgroup(P<0.05);andnoobviousmorpho? logicalchangeswasf0undincerebralcavitytreatmentgroup.?GLP一 2Rwaswidelyexpressedineachpartofgastrointestinal tract,tracheainmice.Butitwasnotobservedinesophagus,liver,lung,kidneyandbladder.?GLP一2Rincavumabdomi— nistreatmentgroupwaslessobviouscomparedwiththecontrolgroup(P<0.05)whileGLP一2Rincerebralcavitytreatment grouphasnochanges.ConclusionGLP一 2isabletostimulatesmallintestineepitheliummucosatogrowandincreasemuc o— salvillusheightindifferentsectionofsmallintestine;GLP一2Riswidelyexpressedingastric,jejunum,colon,andtrachea inmice,theexpressionbecamelessobvious;theexpressionofGLP一2Rinesophagus,liver,lung,kidneyandbladderwas notobserved. Keywords:GLP一2,mUCOUSmembraneofsmallintestine,GLP一2R,receptorexpression 肠道是消化吸收营养物质的主要场所,各种应激损伤对 [作者简介]韩伟(1966一),男,副教授,主要从事生理学,机能 学教学和科研工作. [通信作者]邹原,博士,教授,E—mail:zouyuan@126.com. [基金项目]国家自然科学基金资助项目(30801127) 机体肠道正常黏膜组织结构造成破坏,从而降低肠道对营养 物质的消化和吸收.多肽类生长因子如表皮生长因子,转化 生长因子,胰岛素样生长因子一I等参与了肠上皮生长调控, 并对肠黏膜损伤后的再生修复有促进作用,但其作用缺乏特 异性.1996年Drucker等首次阐明胰高血糖素样肽一2 (GLP一2)具有明显促进肠道对营养物质吸收的作用,使有关 ? 3238?现代中西医结合杂志 ModernJournalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine2010 Oct,19(30) GLP一2与肠上皮生长调控关系日益明了.本研究初步探讨 了GLP一2促进小鼠小肠黏膜细胞增殖的效应,并观察了胰 高血糖素样肽一2受体(GLP一2R)在小鼠食管,胃,小肠(空 肠),大肠(结肠),肝,气管,肺,肾与膀胱不同部位的表达. 1实验资料 1.1实验动物BALB/C小鼠26只,健康,雄性,体质量17,2O g,5,6周龄,由大连医科大学实验动物中心提供(证号: SCXK辽2008—0002).动物实验饲养环境:室温,自然光照, 自由饮水,喂养饲料(大连医科大学实验动物中心提 供). 1.2试剂与仪器合成人GLP一2(美国APC公司),多克 隆GLP一2R(ABCAM公司),SABC试剂盒(天津市灏洋生物 制品科技有限责任公司).AR1140/C分析天平(美国Ohaus 公司),SYD一2010石蜡切片机(中国沈阳誉德电子仪器有限 公司),LEICQWIN病理图像分析仪(德国莱卡公司),Image— ProPlus6.0图像分析软件(美国MediaCybernetics公司). 1.3实验方法 1.3.1动物分组选用5,6周龄的雄性健康BALB/C小鼠 26只.随机分为3组.对照组8只,脑内注射GLP一2组9 只,腹腔注射GLP一2组9只. 1.3.2给药方法腹腔注射组:予GLP一2经PBS液溶解 后,按250g/(kg?d)分2次腹腔注射,注射间隔12h1次, 连续给3d.脑内注射组:予GLP一2按25g/(kg?d),分2 次脑内注射,注射间隔12h1次,连续给3d.对照组:注射 PBS液,2次/d,连续3d.脑内注射方法:小鼠腹位固定,消 毒其额部.注射针在小鼠两耳连线与两眼连线的中间,即两 眼窝后缘连线稍偏离正中线的头盖骨上,垂直刺入2,3mm 深,缓慢注射.一次注射量为0.02,0.03mL. 1.3.3动物取材与固定各组小鼠禁食l6,18h后断头. 打开腹腔,在距回盲部10cm处环形切取回肠组织.同时,常 规方法取出食管,胃,十二指肠,空肠,回肠,结肠,肝,气管, 肺,肾与膀胱组织.将取出的组织标本用生理盐水进行清洗, 清洗后按名称分别投人10%中性缓冲甲醛液进行固定,保存 于4?的环境中. 1.4检测方法及指标 1.4.1小肠黏膜形态检测分别取十二指肠,空肠,回肠不 同部位的肠管标本,按上述常规石蜡包埋切片与HE染色后. 在显微镜下观察切片小肠黏膜绒毛高度与隐窝深度.十二指 肠,空肠,回肠每张切片随机选取1O根绒毛,用图像分析仪检 测绒毛高度. 1.4.2GLP一2R的测定多克隆GLP一2R抗体与小鼠组织 切片上的GLP一2R抗原结合,标记上生物素的多克隆抗体再 与GLP一2R抗体结合,经SABC法在组织细胞上显示出棕黄 色阳性产物,即表示该切片组织有GLP一2R的表达.显微镜 下选择实验片和对照片进行典型视野摄片. 1.4.3图像采集分析方法切片采用LEICQWIN病理图像 分析仪进行拍照,采用计算机图像分析软件Image—ProPlus 6.0对GLP一2R表达进行分析,测量其灰度值(gray)与阳性 面积(masculinearea). 1.5统计学处理计量资料以均数?标准差(面?s)表示,用 t检验,单因素方差分析法测定GLP一2R的表达.数据处理 采用SPSS16.0统计学分析软件进行处理,P<0.05为有显着 性差异. 2结果 2.1GLP一2不同给药途径对小鼠小肠黏膜的作用比较 2.1.1十二指肠,空肠与回肠的形态变化小鼠经GLP一2 腹腔注射处理后,十二指肠黏膜的绒毛增高,隐窝加深(见图 1),局部(白框区域)放大,肠黏膜的形态学变化更清晰;空 肠,回肠黏膜的绒毛也增高,隐窝加深(见图2,图3).提示 GLP一2能促进肠上皮细胞增殖,增大肠黏膜面积,有利于营 养物质的吸收.小鼠经GLP一2脑内注射处理后,十二指肠, 空肠,回肠黏膜与对照组比较无明显形态学变化. A(×40),C(×100)为对照组,B(×4O), D(×100)为腹腔注射组 图1GLP一2腹腔注射后十二指肠形态(HE)染色 A(×40),C(×100)为对照组,B(×4O), D(x100)为腹腔注射组 图2GLP一2腹腔注射后空肠形态(HE)染色 2.1.2小肠不同肠段绒毛高度的比较腹腔注射组的小鼠 小肠不同肠段黏膜的绒毛高度较对照组明显增加(P均< 0.05).见表1. 表l2组小肠肠段绒毛高度的比较(?s,m) 注:?与对照组比较,P<0.05. 2.2GLR一2R的表达情况 现代中西医结合杂志 ModernJournalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine2010 Oct,19(30)’3239’ A(×40),C(×100)为对照组,B(×40), D(×100)为腹腔注射组 图3GLP一2腹腔注射后回肠形态(HE染色) 2.2.1GLP一2R在小鼠消化器官的表达情况采用免疫组 化的方法观察GLP一2R在小鼠胃的表达,结果显示,对照组 与GLP一2处理组的实验片(加一抗)均有不同程度的棕黄色 产物显示,表示该组织有GLP一2R表达,而3组的对照片(未 加一抗,用PBS液替代)均无棕黄色产物显示(见图4和图 5). A对照组实验片,B对照组对照片,C脑内注射组实验片,D脑内 注射组对照片,E腹腔注射组实验片,F腹腔注射对照片 图4GLP一2R在小鼠胃的表达(×400) ? G对照组实验片,H对照组对照片,I脑内注射组实验片,J脑内 注射组对照片,K腹腔注射组实验片,L腹腔注射组对照片 图5GLP一2R在小鼠气管的表达(×400) 果显示,3组食管,肝的实验片与对照片均无棕黄色产物显 示,表示食管与肝组织无GLP一2R表达;3组小肠(空肠),大 肠(结肠)的实验片(见图3c,d)均有不同程度的棕黄色产物 显示,表示这些器官的组织有GLP一2R表达,而3组的对照 片均无棕黄色产物显示. 2.2.2GLP一2R在小鼠呼吸与泌尿器官的表达情况采用 免疫组化的方法观察GLP一2R在小鼠气管的表达,结果显 示,3组的实验片(加一抗)均有不同程度的棕黄色产物显示, 表示该组织有GLP一2R表达,而3组的对照片(未加一抗,用 PBS液替代)均无棕黄色产物显示(见图5).同法对小鼠肺, 肾与膀胱进行GLP一2R检测,结果显示,3组肺,肾与膀胱的 实验片与对照片均无棕黄色产物显示,表示肺,肾与膀胱无 GLP一2R表达. 2.3GLP一2不同给药途径对小鼠体内不同器官GLP一2R 表达的影响腹腔注射组的GLP一2R表达较对照组显着下 调(P<0.05),而脑内注射组的GLP一2R表达与对照组比较 无变化.见表2. 同法对小鼠食管,空肠,结肠与肝进行GLP一2R检测,结3讨论 表2GLP一2不同给药途径对小鼠胃,小肠,大肠及气管GLP一2R表达的影响(?s) 肠道绒毛高度和隐窝深度是反映肠道生长发育的两大指 标.研究表明给予大鼠注射人GLP一2(hGLP一2)及猪GLP一 2(pGLP一2)都能使小肠的质量和长度增加,同时近端回肠的 横截面积增加. GLP一2除了能促进肠道的正常生长发育外,还对胃肠黏 膜的损伤具有保护作用.研究表明,GLP一2能削弱缺血再灌 注(I/R)对小鼠小肠的损伤作用,增加肠绒毛高度及隐窝深 度,同时降低肠系膜淋巴结(MLN)细菌移位率.抑制肠道氧 自由基及炎性细胞因子的释放..实验证实GLP一2可促 进肠黏膜细胞的增殖分化,有利于颅脑外伤后肠黏膜的修复, 改善肠黏膜的机械免疫.梗阻性黄疸时,补充GLP一2可 影响小肠黏膜上皮紧密连接蛋白的分布和表达,提示GLP一2 能恢复和维持小肠黏膜上皮屏障的完整性.GLP一2能刺 激小肠黏膜上皮增生,抑制凋亡,显着促进肠道缺血再灌注后 的黏膜增殖修复.小肠移植后应用GLP一2,有利于移植 肠黏膜的再生和修复,进而促进肠功能的恢复. 本研究观察了GLP一2对小鼠小肠黏膜的影响.小鼠每 天2次连续3d腹腔注射GLP一2后,经组织取材HE染色, 镜下观察显示,小肠各部分肠段的绒毛增高,隐窝加深,且 GLP一2腹腔注射组的小肠不同肠段黏膜的绒毛高度较对照 组明显增加(P<0.05).提示GLP一2可促进小肠黏膜上皮 细胞的增殖,增加肠的吸收面积,有利于肠对营养物质的吸 麓? ? 3240’现代中西医结合杂志 ModernJournalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine2010 Oct,19(30) 收,从而促进肠道的生长发育.GLP一2脑内注射组的肠黏膜 无明显形态学变化. 目前有关GLP一2的作用机制还存在争议,但GLP一2能 特异性地与GLP一2R结合而实现其生理作用已经得到了确 认.GLP一2R是由550个氨基酸组成的G蛋白偶联受体超 家族成员之一.有学者采用RT—PCR方法在大鼠肠黏膜的 神经细胞检测到GLP一2R分布,进而采用体细胞诱变谱系分 析技术证明,GLP一2可特异性作用于肠隐窝的柱状细胞祖细 胞,并且发现这种作用可被河豚毒素所阻断. GLP一2可能通过多条途径最终促进正常小肠的生长和 病理肠黏膜的恢复.一方面GLP一2通过分布于肠上皮细胞 GLP一2R直接促进肠上皮细胞的增殖,抑制其凋亡;另 一 方面GLP一2通过分布于肠内其他部位的GLP一2R间接发 挥保护肠道细胞,促进肠功能恢复的作用.GLP一2作用于肠 内在神经元,肠内分泌细胞的GLP一2R_l,使二者产生神 经递质和激素(一氧化氮,血管活性肠肽,5羟色胺等),促进 肠隐窝细胞的增殖,增加肠系膜血液供应,减少胃酸分泌和抑 制胃排空.GLP一2作用于肠黏膜下的肌纤维母细胞GLP一 2R” ,使其产生生长因子(IGF一1,IGF一2,KGF等),促 进肠上皮增殖和功能改善. 本实验应用免疫化的方法观察GLP一2R在小鼠体内不 同器官的表达.结果显示:在消化器官,食管与肝无GLP一 2R表达;而胃,小肠(空肠)与大肠(结肠)有GLP一2R表达. 在呼吸与泌尿器官,气管有GLP一2R表达;肺,肾与膀胱无 GLP一2R表达,腹腔注射组(胃,肠,气管)的GLP一2R表达 较对照组显着下调(P<0.05),而脑内注射组的GLP一2R表 达与对照组比较无变化,其作用机制有待进一步研究. 总之,对GLP一2及其受体的表达规律,调控及作用机制 的深入研究,有助于其在临床上更广泛地推广应用. [参考文献] [1]DruckerDJ,EhrlichP,AsiaSL,eta1.Inductionofintestinalepithe. 1ialproliferationbyglucagon—likepeptide2[J].ProcNatlAcadSei USA,1996,93(15):7911—7916 [2]李凤奎,王纯耀.实验动物与动物实验方法学[M].郑州:郑州 大学出版社,2007:283 [3]Pede~enNB,ajollundKR,JohnsenAH,eta1.PorcineGlucagon— likepeptide一2:Structure,signaling,metabolismandef-fects[J]. 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