外周伤害性刺激诱导大鼠脑干内延髓网状背侧亚核传入投射神经元的c_fos表达

外周伤害性刺激诱导大鼠脑干内延髓网状背侧亚核传入投射神经元的c_fos达 中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志 V o l. 9. N o. 2 第 9 卷第 2 期 CH IN E SE JOU RN A L O F H ISTO CH EM ISTR Y A N D C YTO CH EM ISTR Y 2000 年 6 月 J un. 2000 外周伤害性刺激诱导大鼠脑干内延髓网状背侧亚核 3传入投射神经元的 2表达 cfo s 高永静凌树才 ()南通医学院神经生物学研究室, 南通 226001 摘要 用荧光金逆行追踪和 荧光免疫组织化学染色相结合的对外周伤害性刺激下大鼠脑干内向延髓网状背侧 FO S 亚核传入投射的神经元中 2的表达进行了研究。在麻醉状况下将 0115荧光金注入大鼠单侧延髓网状背侧亚核, 存活2% cfo s Λl 5 后用 1% 福尔马林刺激同侧前爪、后爪和口周, 2 后灌注取材, 再行 免疫荧光标记。结果发现在脑的中脑导水管周 d h FO S 围灰质、中缝背核、线形核和中缝大核内观察到荧光金标记细胞、样免疫阳性反应细胞及荧光金双标细胞。在这ƒFO S FO S ))( ( ( 四 个核团中, 双标细胞数分别占荧光金逆标神经元数的 25% 中脑导水管周围灰质、 1117% 中缝背核、 819% 线形) )(核和 1211% 中缝大核。结果提示在脑干向延髓网状背侧亚核投射的神经元中, 有一部分与外周伤害性刺激信息的调控 有关, 还有的神经元可能具有其它的功能。 关键词 脑干 延髓网状背侧亚核 荧光金 大鼠FO S - PER IPHERAL NO X IO US ST IM UL A T IO NIND UCED EXPRESS IO N O F FO S PRO TE IN IN NEURO NES O F BRA IN STEM PRO JECT ING TO THE M ED ULL A RY SUBNUCL EUS RET ICUL A R IS DO RSAL IS IN THE RA T Gao Yo n g jin g L in g Sh u ca i (), , 226001, D ep a rtm en t of N eu robiology N a n ton g M ed ica l C ol leg eN a n ton gC h in a () T h e m e tho d com b in ed f luo ro go ld F Gre t ro g rade w ith f luo re scen t imm u no h isto ch em ist ry w a s u sed to ()2stu dy cfo s exp re ssio n o f th e n eu ro n s o f b r ian stem p ro jec t in g to th e su b n u c leu s re t icu la r is do r sa lis SRD . 0115 2% u n de r no x io u s st im u la t io nT h e ra t s w e re an ae sth e t ized an d in jec ted u n ile te ra lly w ith Λl o f F G in 2 . , 1% to SRDA f te r f ive day s su rv iva l p e r io dno x io u s p e r ip h e ra l st im u la t io n w a s g iven b y in jec t in g fo rm a lin , . , su b cu tan eo u s in to th e ip sila te ra l h in dp aw fo rep aw an d m u zzle o f th e ra t sTw o ho u r s la te rth e ra t s w e re . p e rfu sed an d th e b ra in w a s rem o ved an d sec t io n edT h e sec t io n s w e re p ro ce ssed fo r FO S f luo re scen t im 2 (m u no h isto ch em ist ry. T h e re su lt s show ed: F G re t ro g rade ly lab e lled ce lls, FO S2lik e imm u no reac t io n FO S2 ) ƒ1L sin g le lab e lled ce lls an d F GFO S do u b le lab e lled n eu ro n e s w e re fo u n d in th e p e r iaqu edu c ta l g ray () () () (), , . PA G do r sa l rap h e n u c leu s D RN lin ea r n u c leu s rap h e L R an d n u c leu s rap h e m agn u s N RM T h e 217%25% , 11p e rcen tage o f do u b lelab e lled ce lls in th e pop u la t io n o f re t ro g rade ly lab e lled ce lls w a s in PA G 819% 1211% in D RN , in L R , in N RM , re sp ec t ive ly re su lt s su gge st th a t som e affe ren t n eu ro n s to SRD in b ra in stem a re in vo lved in m o du la t io n o f p e r ip h e ra l no x io u s sign a ls, th e o th e r n eu ro n s m ay h ave o th e r 1fu n c t io n s ra t Key W ord s b ra in stem ; m edu lla ry su b n u c leu s re t icu la r is do r sa lis; f luo ro go ld Fo s; ( ) 延髓网状背侧亚核 su b n u c leu s re t icu la r is do r2 sa lis SRD 是近年来发现的一个在伤害性信息调控 中起重要作用的核团; 而且, 它与弥散型伤害抑制 3 ()性控制 江苏省自然科学基金资助项目()d iffu sed no x io u s in h ib ito ry co n t ro l DN IC 197150N o B K 1 江苏 省 “333 工 程”培 养 基 金 资 助 项 目 „N o. 苏 科 基 现象也有密切关系。 形态学研究表明, 与脊SRD 2 , 5 () 1998004?髓之间存在往返投射, 这种往返投射被认为是 DN IC 现象的基础。然而 SRD 与内源性镇痛系统的 , 在照片上分别计数核团中 F G 单标细胞、FO S 出后 单标细胞及 ƒ双标细胞的数目。其它核团之间的联系尚不清楚, 我们曾经用荧光金 F G FO S 逆行追踪方法对脊髓上中枢向 的传入投射进21 对照组SRD ()行过研究, 发现 可接受来自中脑导水管周围灰 211 手术对照组 = 2。动物的饲养环境、饲 SRD n 6 质以及中缝核群部分核团来的传入投射。 为了进 养时间、 手术过程与实验动物完全相同, 只是注射 一步探明这些传入投射与外周伤害性信息的传递与 到前、 后爪及口周皮下的为等量生理盐水, 其后的 调控的关系, 本文中采用免疫荧光组织化学与荧光金 材料制备、 免疫组化反应过程完全同实验组。 逆行追踪相结合的方法对这一问进行探讨。 本组对照的目的在于观察手术及麻醉等对实验结果 的影响。 材料和方法 ()212 免疫组化染色对照组 = 2。取一 FO S n 实验() 200, 300 g , 体重 用雄性 SD 大鼠 12 只, 套实验组大鼠的切片, 用正常羊血清 1?50代替 一抗,其余步骤同上。本组对照是为了检测 免组 8 只, 对照组 4 只。 FO S 疫组化染色的特异性。11 实验组 () 将动物用复合麻醉剂 2 ƒ腹腔注射麻醉 m lk g结果 后, 将头固定于立体定位仪上, 暴露延髓尾侧部。将 ()() 注入左侧0115 Λl 2% 的荧光金 F luo ro go ld, F G F G 注射区局限在 SRD 范围内 图 1, F G 逆标 () ( 神经元主要出现于中脑导水管周围灰质 图注射点坐标定位是: 闩平面下方 1, 115 , , PA GSRD mm ()( ())正中线旁开 1, 115 , 深度为 016, 018 该 mm mm 211、 中 缝 背 核 图 212、 线 形 核 a D RN a ( )()注射点所在平面相当于 图谱定 P ax ino s & W a sto n 图 213a 、 臂 旁 核、 蓝 斑 核、 中 缝 大 核 L R )() ()位时, 耳间线向后 516, 510 之间的平面。注射 mm N RM 图 214a 、 巨细胞网状核 Α部、 中缝隐核 时间持续 1 , 进针前后各留针 10 。动物放在安等。逆标神经元多为圆形、三角形、梭形, 以中 h m in F G 静、避光、温暖的环境中饲养, 5 后在乙醚吸入麻 等大 小 细 胞 为 主, 大 型 或 小 型 细 胞 较 少。 其 中, d 醉下将 1 1% 福尔马林注入同侧前爪、 后爪及口 、、中 阳性细胞较密集。中m l D RN L RN RM F G N RM 周皮下, 再放入原饲养环境中。2 后, 再次用复合的细胞排列有极性,其突起走向多呈水平方向。h 阳 性 细 胞 麻醉剂腹腔麻醉, 经左心室向升主动脉灌注生理盐FO S ( 水 150 , 继之用含 4% 多聚甲醛的 011 的ƒ主要见于 图m lm o lL PA G )() ( 灌注211、 液 712, 714350, 450 灌注固定, 图 b D RNPB pH m l ( ) 212、 115 。灌毕立即取脑, 置于上述固定液中后 图时间为 b L Rh ( ) (213、 固定 2 , 再移入 20% 的蔗糖溶液中 011 ƒb N RM图h m o lL PB ()) 配制, 712, 714过夜 4?。待组织块沉底后, )及 外 侧 网 状pH 14 2 b 作冰冻横断连续切片, 隔 4 片取 1 片, 片厚 40 。核等。 由于 蛋Λm FO S () 用 0101 的 12, 714接片并洗涤 ƒ7白 存 在 于 胞 核 内, m o lL PB S pH 后, 进行 免疫荧光组化染色: 一抗为兔抗 镜 下 只 见 到 圆 形 的 FO S FO S ) (放入 4?冰箱中孵育 72 h; 阳 性 胞 核, 而 不 能 IN C , 血清 1?3000, ( 二 抗 为 结 合 的 羊 抗 兔 血 清 1 ? 200, 观 察 到 细 胞 全 貌。 B io t in IgG ) , 4?冰箱孵育 48 ; 三抗为 结合的、 、在V ec to r hA v id in PA GD RN () 2?300, 4?冰箱孵育 24 。以中 阳 性1T ex a sR ed V ec to rhN RM FO S 细 胞 排 列 密 集, 而2100 0103% 上几种抗体和复合物均用含 T r ito n X 的抗体稀释液稀释。以上各步骤间均用 0101 中 该 细 胞 较 ƒ m o lLN RM 的 漂洗 10 ×3 次, 裱片于清洁载玻片上。少。 PB S m in 待片干后, 用 1?1 甘油-封片, 荧光双 标 细 胞 见 于 、 、 、ƒ PB S O lym p u s F GFO S PA GD RN L R显微镜下观察、摄片。波长 360 的紫外光用于观这四个核团中三种细胞的数目以及双标细胞 , nm N RM 分别占 逆标和 阳性神经元的百分比见表察 发出的黄色荧光, 波长 550 的绿色激发光 F G FO S F G nm 用于观察 阳性细胞发出的红色荧光。待照片洗 FO S 1。 中国组织化学与细胞化学杂志第 9 卷170 表 1, 为了这一伤害性信息传递之间的关系。 因此 F G 逆标和 FO S 阳性神经元及双标神经元在 脑干中的主要分布区域及数目点,本文将 逆行追踪与 免疫组化方法结合 F G FO S 3 3 3 起来进行研究。2是一种“即刻2早期”原癌基因, cfo s FO S F GƒF G FO S % % 当外周受到伤害性刺激或中枢核团直接受到化学性 2510 614 36 140 9 PA G 刺 激时, 在伤害性信息的传导通路上会引起 2cfo s 1117 612 60 113 7 D RN 的表达。本研究结果发现在外周给予化学性刺激后,L R 819 412 56 119 5 58 36 7 1211 914 N RM 在 、、、等核团向 传入投 PA GD RN L RN RM SRD 射的神经元中有一定数目的 ƒ双标细胞存 F G FO S 注: 3 , 为双标神经元占各该核团 逆标神经元的百分比; F G 3 3 , 为双标神经元占各该核团 阳性神经元的百分比在, 这四个核团中双标细胞数占 逆标神经元的FO S F G 两 个 对 照 组 中, 在 荧 光 显 微 镜 下 可 以 看 到 百分比依次为 25% 、1117% 、819% 、1211% , 说明、、、以及外侧网状核中有少数 PA GD RN L RN RM 这些核团中还存在着相当数量的 单标神经元和F G 几个淡染的 阳性胞核, 而在照片上几乎看不 FO S 单标神经元,, 有待它们可能还有其它的功能FO S 到。 进一步研究。 收稿 1998212 修回 1999210 讨论 () 本文图 1- 2 见插图第 4 页电生理研究表明,的神经元能对来自全身 SRD 参 考 文 献 各处的伤害性刺激起反应, 并且能在一定的刺激强 度范围内准确地编码电、 温度以及机械性刺激的强, , , . Bo uh a ssira D V illanueva L B ing Ze t a lInvo lve2 1 7 m en t o f th e subnuc leu s re t icu la r is do r sa lis in d iffu se 度。的这种对刺激的反应能被吗啡抑制, 并 SRD 8 . no x io u s inh ib ito ry co n t ro ls in th e ra tB ra in R e s 可被纳络酮翻转, 这说明 在处理伤害性信息SRD () 1992; 595 2: 353 方面起着一定的作用。形态学研究表明,与脊 SRD , , . V illanueva L B e rna rd J F L e B a r sD ist r ibu t io in o f 2 髓之间存在着往返纤维投射, 并且认为这种投射是 sp ina l co rd p ro jec t io n s f rom th e m edu lla ry subnuc leu s 调控脊髓伤害性信息传入的结构基础。然而痛 SRD : re t icu la r is do r sa lis and th e ad jacen t cunea te nuc leu sa 觉的调控机制很复杂, 涉及到镇痛系统中的许多核 2. p h a seo lu s vu lga r isleuco agg lu t in in study in th e ra tJ 团, 而且在各镇痛核团之间存在着复杂的联系。 例 () Com p N eu ro l 1995; 352 1: 11 如中脑导水管周围灰质一方面可发出纤维与中缝大 3 , , , . R abo isso n P D a lle l R B e rna rd J F e t a lO rgan iza2 核联系, 通过中缝大核发出下行轴突对脊髓的伤害 9 t io n o f effe ren t p ro jec t io n s f rom th e sp ina l ce r ica l en2 性信息进行调控。 另一方面它还可向上投射到边 la rgem en t to th e m edu lla ry subnuc leu s re t icu la r is do r2 10 缘系统, 参与构成中脑边缘镇痛环路。那么 SRD2: sa lis and th e ad jacen t cunea te nuc lea sa PHA L study 与其它镇痛核团之间是否存在着联系呢? 在过去的 () . 1996; 367 4: 503 in th e ra tJ Com p N eu ro l 文献资料中有关这方面的报道极少。 11J F B e rn a rd L im a D. A Sp inom edu lla ry p ro jec t io n te rm ina t ing in 4 曾经用 顺行追踪方法研究了 的传出纤 PHA SRD . 1990;th e do r sa l re t icu la r nuc leu s o f th e ra tN eu ro sc i 维投射, 发现在丘脑腹内侧核、 丘脑束旁核、 巨细 () 34 3: 577 胞网状核、 小细胞网状核等核团内有 标记的PHA 11 , . T ava re s IL im a DD e scend ing p ro jec t io n s f rom th e 5 阳性终末。 但是尚未见到有关 传入投射方 SRD cauda l m edu lla o b lo nga ta to th e sup e rf ic ia l o r deep 面的报道。本研究用 逆标方法对此进行了研究,F G . do r sa l ho rn o f th e ra t sp ina l co rdE xp B ra in R e s 表明在中脑导水管周围灰质、 中缝核群、 臂旁核以 () 1994; 99 3: 455 及蓝斑核等核团内均可 见 到 标 记 的 神 经 元 胞F G 高永静, 凌树才, 田美玲 1 大鼠延髓网状背侧亚核传入 6 体, 表明 SRD 接受上述核团的传入投射。本研究结投 射 的 荧 光 金 逆 行 追 踪 法 研 究 1 南 通 医 学 院 学 报, 果提示这些核团也可通过 对伤害性信息进行 SRD () 1998; 18 2: 142 调控。 , , , . V illanueva L B ing ZBo uh a ssira D e t a lE nco d ing 7 虽然电生理学研究资料表明 与外周伤害 SRD , o f e lec t r ica lth e rm a l and m ech an ica l no x io u s st im u li by subnuc leu s re t icu la r is do r sa lis neu ro n s in th e ra t 性信息的调控有关, 但是目前还缺乏形态学方面的 () 61 2: 391 m edu lla. J N eu rop h y sio l 1989; 证据来证明脑干向 传入投射的神经元与外周SRD 4b FO S 样免疫反应阳性神经元在中缝大核的分布; B ing Z, V illanueva L , L e B a r s. E ffec t s o f sy stem ic 8 100×箭头所示为 F GFO S 双标神经元 ƒ 22m o rp h ine upo n A ? and C f ib re evo k ed ac t iv it ie s o f subnuc leu s re t icu la r is do r sa lis neu ro ne s in th e ra t EXPL A NA T IO N O F F IGURES () . 1989; 164 1: 85 m edu llaJ N eu rop h y sio l 9 1 F ig. F G in jec t io n site s d raw ed unde r m ic ro scop y in sec2 , . S im L J Jo e sep h SAE ffe ren t p ro jec t io n s o f th e nu2 10、 - 514 - 5165t io n - and mm cauda l to th e in2 () . 1992; 28 5: 679c leu s rap h e m agnu sB ra in R e s B u ll te rau ra l line fo llow ing th e ste reo tax ic coo rd ina te s . 5, o f P ax ino s & W a sto nSp C nuc leu s o f th e sp ina l L i YQ , R ao ZR , Sh i JW . Se ro to n ine rg ic p ro jec t io n s 10 , ; , ; t r igem ina l ne rvecauda lC u cunea te nuc leu sf rom th e m idb ra in p e r iaqueduc ta l g ray to th e nuc leu s , ; , So lnuc leu s o f th e t rac tu s so lita r iu sSRV sub2 () . 1989; 98 3: 276accum ben s in th e ra tN eu ro sc i L e t t ; , nuc leu s re t icu la r is ven t ra lisSRD subnuc leu s , , , . B e rna rd J F V illanueva L C a r ro ue J e t a lE ffe ren t 11 .re t icu la r is do r sa lis p ro jec t io n s f rom th e subnuc leu s r re t icu la r is do r sa lis D ist r ibu t iio n o f F G re t ro g rade ly labe lled neu ro n s 2 F ig. ( ) 2: leuco agg lu t in in study in SRD a P h a seo lu s vu lga r is ( ) ( 1, 42- aa and FO Slik e imm uno reac t ive FO S () th e ra t. N eu ro sc i L e t t 1990; 116 3: 257 ) () 1, 4:L Ineu ro ne s bb in b ra in stem 1a D ist r ibu t io n o f F G re t ro g rade ly labe lled neu2 ()ro n s in m idb ra in p e r iaqueduc ta l g ray PA G 图 版 说 明 2D ist r ibu t iio n o f FO Slik e imm uno reac t ive 1b ( 图 1在 的注射区 按 图谱定 F G SRD P ax ino s & W a sto n () 2,FO SL Ineu ro ne s in PA G 位, 在耳间线后- 510、- 514 和- 516平面。根据 mm D ist r ibu t io n o f F G re t ro g rade ly labe lled neu2 2a )显微镜下所见绘制。 三叉神经脊束核尾侧亚5: Sp C () ,ro n s in do r sa l rap h e nuc leu s D RN 核; C u: 楔束核; So l: 孤束核; SRD : 延髓网状背侧 2D ist r ibu t io n o f FO Slik e imm uno reac t ive 2b 亚核; : 延髓网状腹侧亚核SRV () 2,FO SL Ineu ro ne s in D RN () 图 2标记的神经元 1, 4和 样免疫反应阳性 F G aaFO S D ist r ibu t io n o f F G re t ro g rade ly labe lled neu2 3a () 神经元 1, 4在脑干中的分布;bb () ,ro n s in L inea r nuc leu s rap h e L R 1a F G 标 记 的 神 经 元 在 中 脑 导 水 管 周 围 灰 质 的 分 2D ist r ibu t io in o f FO Slik e imm uno reac t ive 3b 布;() 2,FO SL Ineu ro ne s in L R 样免疫反应阳性神经元在中脑导水管周围 1b FO S D ist r ibu t io n o f F G re t ro g rade ly labe lled neu2 4a 灰质的分布; () ,ro n s in nuc leu s rap h e m agnu s N RM 标记的神经元在中缝背核的分布;F G 2a 2D ist r ibu t io n o f FO Slik e imm uno reac t ive 4b 2样免疫反应阳性神经元在中缝背核的分布; b FO S () 2,FO SL Ineu ro ne s in N RM 3标记的神经元在中缝线形核的分布;a F G FO S do ub le2labe lled neu2 A r row s po in t to F Gƒ3样免疫反应阳性神经元在中缝线形核的分 b FO S ×100ro ne s. 布; 标记的神经元在中缝大核的分布;4a F G 高永静等 1 外周伤害性刺激诱导大鼠脑干内延髓网状背侧亚核传入投射神经元的 c2fo s 的表达 () 正文见第 168 页, 图说明见正文后第 171 页 〃4〃