实时荧光定量pcr检测限的统计推断

实时荧光定量pcr检测限的统计推断 实时荧光定量PCR检测限的统计推断 实时荧光定量PCR检测限的统计推断 作者:王文清，王昌富，袁琳，彭长华，常武 【摘要】 检测限是检 测方法的重要性能指标，用Poisson分布的概率函数分式计算一次抽 样检测出现的结果推论总体出现该结果的概率。以实时荧光定量 PCR(FQ PCR)检测乙型肝炎病毒DNA结果为例，计算可知，一次抽 样反应管的检测结果?4时，才可推论总体与0(空白)差异有显着性 (P0.05)。因而检测血清中病原体时扩增反应管中的检测限是4拷贝 /ul计算也可知，1拷贝/ul示一次抽样的结果为0的概率可达 0.368，结果在0拷贝/ul,4拷贝/ul的概率为0.996，而1000拷贝 /ml表示一次抽样结果为0的概率为0。结果在905拷贝/ml,1 095 拷贝/ml的概率为0.997;而100 000拷贝/L表示一次抽样结果在997 000拷贝/L,1 003 000拷贝/L的概率为0.997。抽样单位ul不能随 意放大为ml甚至L。 【关键词】 实时荧光定量PCR;检测限;统计 推断 Statistical Conclusion of Limit of Quqntitation in Real time Fluorescence Quantitative PCR Abstract:Limit of quantiation is a important performance index of assay methods.Results of sample drawing are calculated through possiblity function equation of Poisson distribution,then the possibility of results emerged in population is deduced.For example,in Real time Fluorescence quantitaive PCR to assay HBV DNA,only when sample drawing results?4,significance of difference(P0.05)could be deduced between population and blank.So limit of quantitation is 4 copies/ul denoting 0 in one sample drawing is 0,and Possibility of results between 905 copies/ml to 1095 copies/ml is 0.997.Possibility of 100 000 copies/L denoting results between 997 000 copies/L to 1 003 000 copies/L in one sample drawing is 0.997.Sample drawing unit ul could not be replace by ml or L. Key words:Real time Fluorescence quantitative PCR;Limit of quantitation; Statistical conclusion 检测限是检测方法的重要性能指标，只 有在检测报告中明确表达了检测方法的检测限，该检测报告在各实验间及同一项目的各种检测方法间才可进行比较。能检测到的最低分析物浓度为检测系统的检测限。当前，检测限术语混乱，如:灵敏度(sensitivity)、分析灵敏度(analllytical sensitivity)、定量限度(limit of quantitqtion)等,1,。每个词语的实际含义中包含有各自的实验方式、数据处理方式及由数据作出的推论等。我们采用统计学方法，以期得到一致的实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ PCR)检测限，现介绍如下。 1 文献中FQ PCR检测限的描述 检测乙型肝炎病毒DNA的文献中检测限使用了“最低检出量”,2，3,、灵敏度,5,7,等术语，它等于已知的高拷贝HBV DNA血清10倍系列稀释后能检测到扩增曲线的最大稀释倍数管浓度。表述有:阴性HBV DNA?106拷贝/升,4,;荧光定量PCR法检测灵敏度102拷贝/ml,5,、104拷贝/ml,6,、8.6×102拷贝/ml,7,;HC ?法检测灵敏度1.4×105拷贝/ml,7,;103 Eq/ml理论值时到达检测极限,3,;PCR FP检测HBV DNA的最低检测出量1×101拷贝,2,;bDNA在105 Eq/ml时到达检测极限,3,。以上检测限术语各不相同，且同一方法检测HBV DNA在上述各实验室发出同样的“HBV DNA低于检测下限”的报告时其实际HBV DNA拷贝数相差可达100倍。 2 FQ PCR检测过程简介 以测定血清乙型肝炎病毒DNA为例:将40 μl血清样本加40 μl DNA提取液处理后，将其中2 μl(相当于1 μl血清)加入主反应液(含DNA引物、酶、DNA构件分子dNTP等)管中，在自动热循环上进行温度循环，自动热循环仪记录每一反应管在每一次温度循环的荧光强度，记30次温度循环后结束。在PCR循环过程中，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数称为Ct值(Cyclethreshold),它与反应管中DNA起始拷贝数的对数值(lgN)呈非常显着的直线相关关系。自动热循环仪对标准样品自动生成一条Ct值对于起始拷贝数值(lgN)的工作曲线，并通过该工作曲线来确定待测未知样品反应管的起始拷贝数(N)。当30次循环后某一待测管仍检测不到高于基线水平的荧光信号时，仪器默认Ct值为30，不计算起始拷贝。 3 确定FQ PCR检测限的统计学原理 如果被检物的含量和检测方法的空白响应量的波动服从正态分布规律，则检测限可用多次检测空白的方法来确定。可信限为95%时检测限,x空白+2.s空白;可信限为99.7%时检测限=x空白+3.s空白。这是目前多数检测限的确定方法。对核酸检测方法的检测限的理解可能与此有差别，但是原理应是一致的,1,，FQ PCR检测限也应是推论总体与空白有统计学差异的最小抽样结果。 4 FQ PCR检测限的统计推断 假设病原体在血液等体液中的分布是随机的，则单位体积中(如1.0 μl)病原颗粒数的分布服从Poisson分布。以Poisson分布的概率函数公式计算一次抽样检测出现的结果推论总体概率。从理论上来说，使用PCR测定技术测定病原体核酸序列的量可低至1个拷贝,2,。例如:血清标本中加入等量的DNA提取液，于离心管中煮沸，4 ?放置，离心，吸取上清液2 μl作 进行扩增检测(2 μl上清液相当于抽样1 μl血清),2,，其中至少有1个拷贝的HBV DNA才能有典型扩增反应，这时检测结果是1拷贝/μl。由Poisson分布的概率函数公式可计算出1次抽样检测结果出现0时，推断总体为1,9的概率见表1。