亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞表达p38mapk和mcp

亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞表达p38mapk和mcp 亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞表达p38MAPK和MCP 亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞表达p38MAPK和MCP 【关键词】 亚硒酸钠;p38丝裂原活化蛋白激酶;单核细胞趋化蛋 白 Role of sodium selenite in regulating expressions of p38MAPK and MCP1 in rat mesangial cells 【Abstract】 AIM: To observe the effect of sodium selenite on expressions of p38 mitogenactivated protein kinase (p38MAPK) and monocyte chemoattractant protein1 (MCP1) in rat mesangial cell line HBZY1, and to study the mechanism of sodium selenite in preventing diabetic nephropathy. METHODS: Cell line HBZY1 was incubated with high glucose, high insulin, H2O2 and advanced glycosylation end products (AGEs), respectively (control group); simultaneously, the cell line HBZY1 pretreated with sodium selenite was also incubated with the above factors (experimental group). The expressions of p38MAPK and MCP1 were detected and compared in the 2 groups. RESULTS: Four factors increased the expressions of p38MAPK and MCP1 indepently; sodium selenite inhibited the expressions of p38MAPK and MCP1 by the 4 factors distinctly. CONCLUSION:Sodium selenite can suppress the expressions of p38MAPK and MCP1 in the cell line HBZY1, which suggests that sodium selenite may play a significant role in the prevention of diabetic nephropathy by the inhibition of the expressions of p38MAPK and MCP1 in the cell line HBZY1. 【Keywords】 sodium selenite; p38 mitogenactivated protein kinase; monocyte chemoattractant protein1; mesangial cells; diabetic nephropathy 【摘要】 目 的: 观察亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞系HBZY1表达p38丝裂原 活化蛋白激酶(p38MAPK)和单核细胞趋化蛋白1 (MCP1)的影响，从 而研究硒在防治糖尿病肾病(DN)中的作用机制. 方法: 分别以高 葡萄糖、高胰岛素、过氧化氢和糖基化终末产物(AGEs)刺激HBZY1 细胞;先给予100 nmol/L亚硒酸钠预处理后，再分别以上述4种刺 激因素孵育HBZY1细胞，分别检测HBZY1细胞p38MAPK和MCP1的表达并比较. 结果: 4种刺激因素均可作为独立因素，导致HBZY1细胞p38MAPK和MCP1表达量增加;亚硒酸钠能抑制上述4种因素所致的p38MAPK和MCP1的表达. 结论: 亚硒酸钠通过抑制p38MAPK和MCP1在HBZY1细胞的表达, 从而有效防治DN的发生发展，表明硒在DN的防治过程中发挥积极作用. 【关键词】 亚硒酸钠;p38丝裂原活化蛋白激酶;单核细胞趋化蛋白1;系膜细胞;糖尿病肾病 【中图号】 R587.24 0引言 近年来国外研究表明单核细胞趋化蛋白1 (monocyte chemoattractant protein1，MCP1)与糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)有密切关系,1,. p38MAPK是细胞信号传递的交汇点或共同通路,2-3,，但它在DN发生中的作用及其与MCP1关系仍不十分清楚;硒是机体必需微量元素之一，其缺乏可加剧DN的氧化应激，并可产生拟高血糖病理状态，从而加剧DN的发生发展,4,. 但其是否作用于p38MAPK和MCP1国内外未见文献报道. 我们分别给予高葡萄糖(HG)、高胰岛素(HI)、过氧化氢(H2O2)和糖基化终末产物(AGEs)孵育HBZY1细胞，观察HBZY1细胞p38MAPK和MCP1的表达以及亚硒酸钠对HBZY1细胞p38MAPK和MCP1表达的影响. 从而明确二者在DN形成中的作用及硒在防治DN中的作用机制. 1材料和方法1材料大鼠肾小球系膜细胞系(HBZY1，中国典型培养物保藏中心CCTCC);新生牛血清、RPMI 1640培养液、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(二抗)(北京中山生物技术有限公司);亚硒酸钠(Karolinska Institute赠送);柱离心式总RNA抽提试剂盒、RTPCR两步法试剂盒、PCR相对分子量(TaKaRa公司); PCR引物合成(上海博亚生物技术有限公司)，蛋白质相对分子量标记物(BioRad公司);磷酸化p38MAPK兔多抗((Promega公司).2方法2.1细胞系HBZY1的培养HBZY1细胞常规培养于200 mL/L RPMI 1640培养液中，培养条件为37?，饱和湿度50 mL/L CO2，每2~3日用0.2 g/L乙二胺四乙酸(EDTA)消化传代. HBZY1细胞长满培养瓶底40%后分为9组，以无血清培养液饥饿24 h, 然后按实验分组加入刺激(及干预)因素.2.2体外制备AGEs参考文献,5,，按牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA) 50 g/L，与葡萄糖90 g/L，0.5 mmol/L EDTA及0.2 mmol/L PBS (pH 7.4)混匀后过滤除菌，37?恒温培养箱卵孵育60 d. 0.1 mol/L PBS (pH 7.4)中透析48 h，测定蛋白含量及荧光强度，分装后存于-80?冰箱保存备用.2.3实验分组分别以一定浓度HG, HI, H2O2和AGEs刺激细胞系HBZY1一定时间;先给予亚硒酸钠100 nmol/L预处理HBZY1细胞48 h后，再分别以上述4种刺激因素(浓度、时间同前)孵育HBZY1细胞，同时设对照组. 分组情况 ? 对照组:用等体积PBS培养细胞; ? HG组:用25 mmol/L葡萄糖刺激HBZY1细胞72 h; ? HI组:用100 nmol/L胰岛素刺激HBZY1细胞24 h; ? H2O2组:用100 μmol/L H2O2刺激HBZY1 细胞1 h; ? AGEs组:用100 mg/L AGEs刺激HBZY1细胞6 h; ?亚硒酸钠+HG组:依次以100 nmol/L亚硒酸钠和25 mmol/L葡萄糖分别刺激HBZY1细胞48 h和72 h; ?亚硒酸钠+HI组:依次以100 nmol/L亚硒酸钠和100 nmol/L胰岛素分别刺激HBZY1细胞48 h和24 h; ? 亚硒酸钠+H2O2组:依次以100 nmol/L亚硒酸钠和100 μmol/L H2O2分别刺激HBZY1细胞48 h和1 h; ? 亚硒酸钠+AGEs组:依次以100 nmol/L亚硒酸钠和100 mg/L AGEs分别刺激HBZY1细胞48 h和6 h.2.4RTPCR法检测MCP1 mRNA表达以柱离心式总RNA抽提试剂盒提取细胞系HBZY1总RNA，测定总RNA浓度，计算纯度，A260 nm/A280 nm均在1.8,2.0之间. MCP1引物序列按文献,6,:上游引物: 5′ATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCT3′;下游引物: 5′AGAAGTGCTTGAGGTGGTTGTGGAAAAGAG3′， 扩增片段长度258 bp. βactin引物序列:上游引物: 5′TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC3′; 下游引物: 5′TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG3′，扩增片段长度228 bp. 以两步法RTPCR试剂盒进行反转录扩增，扩增条件:94?变性30 s，55?退火1 min,72?延伸1 min,共35个循环，72?最后延伸7 min. 每次PCR反应至少重复3次. PCR产物于15 g/L琼脂糖凝胶电泳，结果经图象分析系统扫描存图，并对目的条带进行密度分 析.2.5Western blot法检测p38MAPK蛋白表达培养的细胞系HBZY1，经4?胞浆蛋白提取液裂解，提取物在冰上孵育2 h，然后 000 g 4?离心10 min，沉淀加入4?预冷核蛋白提取液，震荡混匀，冰浴1 h，再 000 g 4?离心30 min，取上清为核蛋白，其蛋白浓度经考马斯 亮蓝法定量. 磷酸化p38MAPK表达量采用Western blot法检测，核蛋白中加入等体积2×上样缓冲液煮沸5 min. 进行10 mol/L SDSPAGE，将蛋白转至PVDF膜后用5 g/L BSA室温下封闭2 h，分别用1?2000抗磷酸化p38MAPK兔多抗4?孵育过夜，用PBS充分洗涤，再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 1?5000，37?孵育1 h，用PBS充分洗涤，DAB显色试剂盒显色. 结果经图象分析系统对目的条带进行扫描存图并进行密度分析. 统计学处理:资料采用SAS 8.0进行统计分析，组间两两比较用非参数统计分析，P0.05即认为有统计学差异. 2结果 2.1细胞系HBZY1 MCP1 mRNA表达细胞系HBZY1 MCP1 mRNA表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分析， HG，HI，H2O2和AGEs均可作为独立因素