抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体轻链可变区的克隆及序列分析

抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体轻链可变区的克隆及序列分析 抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体轻链可变区 的克隆及序列分析 澎江右矸学2009年第4期圆 抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体轻链 可变区的克隆及序列分析 宋帅,林彤,邵军军,丛国正,独军政,高闪电,常惠芸 (中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室,甘肃兰州730046) 摘要:应用分子生物学技术,从分泌抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞9F12中提取总RNA,经 反转录,PCR扩增及克隆,得到v.基因.序列测定结果表明,9F12的v.基因为336bp,可编码112个氨基酸. 用NCBIGenBank分析表明,v.基因符合小鼠抗体可变区特征,为功能性重排的抗体可变区基因.根据Kabat分 类体系,9F12的v基因片段隶属于抗体K轻链2O家族.9F12的v基因的克隆为抗O型口蹄疫病毒单链抗体的 构建与表达奠定了基础. 关键词:O型口蹄疫病毒;单克隆抗体;轻链可变区;基因克隆;序列分析 中图分类号:$852.6文献标识码:B文章编号:0528.9017(20o9)04.0809.03 口蹄疫病毒(foot.and.mouthdiseasevirusFMDV) 是小RNA病毒科(pieomaviridae)口蹄疫病毒属 的成员…,偶蹄动物对该病毒极为敏 (aphthovims) 感,可造成患病动物的口,蹄和乳房等部位发生水 疱,破溃并形成烂斑,发病率几乎达100%.鉴于 口蹄疫病毒对畜牧业生产和发展造成的巨大危害, 世界动物卫生组织(OIE)和联合国粮农组织 (FAO)将其列为A类动物传染病之首.因此,对 FMDV的免疫和控制显得尤为重要.而FMDV现有 7个血清型,各血清型之间不能产生交叉免疫,但 各血清型之间有不同程度的交叉反应,这种特性给 FMDV的诊断和疫苗免疫带来了极大的困难J.单 克隆抗体与抗原结合的特异性强,从而使单抗在 FMDV的研究中发挥了重要的作用.但由于杂交瘤 细胞的制备步骤烦琐,筛选费时,且培养杂交瘤细 胞需要复杂而昂贵的细胞生长培养液,这给单克隆 抗体技术在FMDV防治领域中的广泛应用带来了一 定限制.随着DNA重组技术和PCR技术的诞生, 形成了以基因方法构建重组菌并以此为生物反 应器研制基因工程抗体的生物高技术,它为大量生 产廉价的抗体提供了一条新思路].基因工程抗体 的构建其关键之一是抗体可变区基因的获得J. 本试验采用抗体基因工程技术,从分泌抗O 型FMDV的杂交瘤细胞中提取总RNA,逆转录合成 eDNA,以此为模板利用PCR方法扩增出轻链可变 区基因,并进行了序列测定和分析,旨在为构建抗 FMDV单链抗体(scFv)奠定基础.现将有关结果 报道如下. 1材料与方法 1.1细胞,质粒及菌株 分泌抗O型FMDV单克隆抗体的杂交瘤细胞 株9F12由本室制备及保存,单克隆抗体为IgG1 型;pGEMT.easyVector为Promega公司产品;感受 态细胞JM109购自宝生物(大连)公司. 1.2主要试剂 RNeasyMinikit购自Qiagen公司,AMV反转录 酶,Oligo(dT),连接酶为Promega公司产品,限 制性核酸内切酶,IPTG,X.gal,TaqDNA聚合酶, DNAMarker,DNA片段纯化试剂盒均购自宝生物 (大连)公司,其它试剂均为国产或进口分析纯. 1.3PCR扩增引物根据 GenBank中查找到的编码小鼠IgGV.区基因序 列中相对保守的框架区FR1,FR4的基因片段核苷 收稿日期:2009.05.11 基金项目:国家科技支撑计划项目(No2006BAD06A14;No2006BAD06A10) 作者简介:宋帅(1982一),男,河南汝州人,硕士生,主要从事病毒基因工程研究工作.E-mail:Songshuai0602@126.corn. 注:常惠芸系通讯作者. 澎江考矸学2009年第4期 酸序列,设计了V区的上,下游引物,引物核苷 酸序列如下: VLFor(29):5一GGATCAAGTYGGTCCACCATCA. GCCCGTF-3; VLBack(23):5'-GACATTCTGMTSACMCAGMC. TCC一3. 其中:W=A/T,M=A/C. 1.4总RNA提取,反转录 从液氮罐中取出冻存的抗0型FMDV杂交瘤 细胞株9F12,复苏后用含10%胎牛血清的RPMI一 1640培养至细胞总数约为2×1.2000r?min离 心10min后,收集细胞,然后参考RNeasyMinikit 操作说明提取细胞中的总RNA,并进行反转录. 反转录体系为:总RNA1/_tg,dNTP2ttL,Oligo (dT)0.5,5×RTbuffer4,反转录酶0.5, RNA酶抑制剂0.5ttL,加双蒸水至20体系.混 匀后置于42?水浴2.5h,99?水浴5min,冰浴 冷却备用. 1.5V. 基因的扩增 PCR反应体系为:10×PCRbuffer5,dNTP 4,上,下游引物各lttL,eDNA5ttL,Taq酶 0.5ttL,加双蒸水至50体系;反应程序如下: 95?5min,94?1min,55oC30S,72qc2min, 35个循环后,72?终延伸10rain;1%琼脂糖电泳 观察结果. 1.6V.基因的克隆 将纯化的PCR产物和pGEMT.easy载体于16? 水浴进行连接反应,转化感受态细胞JM109,均匀 涂布于含有IPTG,X.蹦和Amp的LB琼脂平板上, 37?温育12h后,挑取白色单个菌落.以碱裂解 法小剂量制备质粒,并进行酶切和PCR鉴定,将 初步鉴定为阳性的重组质粒进行测序. 1.7V基因的序列测定及分析 序列测定反应试剂为:BigDyeTeminatorv3.1 CycleSequencingKit(ApphedBiosystems).测序所用 引物:FPrimer(M13—47):CGCCAGGGTYTYCCC AGTCACGAC.测序仪为:ABIPRISMTM377XLDNA Sequencer.对VI.基因的序列测定后,按Kabat等 的方法对V..基因片段进行序列分析. 2结果和分析 2.1V基因的RT—PCR扩增和克隆 提取杂交瘤细胞总RNA后,反转录得到 cDNA,PCR扩增后经1%琼脂糖凝胶电泳得到一条 分子量约330bp的目的条带(图1),未见其它非 特异性产物,与预计的抗体轻链可变区基因分子量 大小相符.将凝胶纯化的PCR扩增产物与pGEMT. easy载体16?连接12h后,转化JM109,挑取白色 单个菌落制备质粒,经PCR,酶切鉴定片段大小与 预期结果相符. 2000 1000 750 500 250 1OO 图1单抗9F12V基因的PCR扩增电泳图谱 2.2V基因核苷酸序列的测定及分析 用BigDyeTeminatorv3.1CycleSequencingKit,对 9F12的v基因核苷酸序列进行了测定(图2).与 Kabat数据库中已发表的鼠抗体可变区序列进行比 较分析,v.基因v.基因片段隶属于抗体.c轻链2O 家族,全长336bp,可编码112个氨基酸.经与 NCBIGenBank作Blast对v.基因进行同源性分析表 明,所得到的v基因符合小鼠抗体可变区框架结 构,有明确的4个FR区和3个CDR区. 3小结和讨论 随着Ig基因结构与功能研究的不断深入,已 经知道k基因由三组不连锁的基因群控制,分别 为重链基因,轻链基因和轻链基因.在未分化 的胚系B淋巴细胞和其他有核体细胞的染色体中, 编码IgV区和C区各部位的基因节段是相互分离 的.轻链v区基因由v,J两组基因节段构成,在 B细胞分化发育过程中,通过一部分基因节段相互 连接,基因重排,形成功能性v区基因,由于v, J基因段组合性连接的多样性,构成了抗体的多样 性.利用基因工程从分泌单抗的杂交瘤细胞中分离 和克隆抗体可变区基因是构建基因工程抗体的途径 之一,其关键是抗体可变区基因的获得,抗体基因 的正确拼接及有生物活性的抗体分子表达.其中抗 体可变区基因的获得是至关重要的第1步,它必须 解决v.基因PCR扩增引物正确设计的问题.我们 宋帅,等:抗0型口蹄疫病毒单克隆抗体轻链可变区的克隆及序列分析 ATGACACAGTCTCCACTCATTTTGTCGGTTACcATTGGACAATCAGCCTCCA TCTCTTGC60 MTQSPLILS,rTIGQSASISC CDR1 从GTC从GTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACA G120 KSS0SLLDSDGKTYLNWLLQ CDR2 AGGOCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGAC TCTGGAGTC180 RPGQSPKRLIYLVSKLDSGV CCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTG240 PDRFTGSGSGTDFTLKISRV CDR3 GAGGCTGAGGATTTGGG从TTTAmTTGCTGGc^_^GGTAcAcATTTTCCGTTCGGTGGT300 EAEDLGIYYCWQGTHFPFGG GGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGATGGTGGA336 GTKLELKRADGG 图2轻链可变区基因序列及推导的氨基酸序列 应用随机引物寡聚核苷酸逆转录合成第1链cDNA, 它能够保持编码区及5端序列的完整性.依据 Odandi【6等对复杂多变的抗体基因序列进行计算机 分析得出的在各种抗体v区FR15端和FR43端的 核苷酸序列有极高同源性的特征,针对V区FR15 端和FR43端最保守序列设计了扩增v..的PCR引 物.应用设计合成的引物V.For,V.Back以9F12 第1链为模板进行PCR扩增,分离克隆了目的基 因V对重组质粒9F12pGEMT.easy—VI.用EcoRI 酶切能切出目的条带v说明所设计的这一套引 物适用单抗9F12V..基因的克隆.尽管难以证实所 用引物序列与单抗9F12V.的FR15端和FR43端 序列完全匹配,但即使少数几个碱基不严格配对, 由此造成的突变也不会影响克隆到的v.基因表达 的抗体片段结合抗原的活性.本试验克隆的v. 经测序表明,v.基因由336bp组成,计算机分析 结果表明克隆的v.基因符合小鼠抗体可变区特征, 为功能性重排的抗体可变区基因.这就进一步证明 本试验成功克隆了单抗9F12V.基因,也为通过基 因重组技术构建抗FMDVscFv奠定了良好的基础. 与单抗比较基因工程抗体的生产具有操作简便,表 达量大,成本低廉的特点,用克隆的V区基因 可产生与抗原特异性结合的抗体片段,利用基因 突变技术改变抗体的某些结构可提高抗体的亲和 力,延长其半衰期n.可以预测,作为被动免疫 抗体的抗FMDVscFv的构建和应用将有助于我国对 FMDV的防制. 参考文献: 谢庆阁.口蹄疫[M].北京:中国农业出版社,2004:16一 l7. 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