免疫荧光步骤

免疫荧光步骤 1. 用预温的PBS洗细胞两遍，可以不用摇; 2. 加入4%多聚甲醛固定，1ML/well,10min,固定的时间也可以适当的增 长;在固定之前的步骤其实都要尽量轻而快，保证细胞固定之后不会 缩太多，能够维持原有的细胞形态; (4%多聚甲醛:现用现配。0.4g多聚甲醛溶于9mlPBS中，加适量1M NaOH(~10微升)，可以在95?水浴中溶解，PH~7.2) 3. PBS洗至少4遍; 4. 加入TBST，20min;这个过程是使得细胞膜变通透，可以使得抗体更 好的进入细胞; (TBST配制:0.25% TritonX-100,150mM Nacl.50mM Tris-Hcl;) 例如:50ml TBST 配制方法:TritonX-100:125ul 5M Nacl:1.5ml 1M Tris-Hcl:2.5ml PBS :45.875ml; 5. PBS洗4遍至少; 6. 加入5% BSA封闭2小时;(5% BSA:0.5g BSA粉末，用9ml PBS 溶 解。4?存放。) 7. 加入一抗(用含4% BSA的TBST稀释溶解;)然后4?过夜，不要摇， 放着就好;抗体在配制的时候不用太多，可以盖住底下的凹槽就可以 了，体积大概200微升就够了; 8. 次日，用PBS洗至少5遍; 9. 加入二抗，配制方法和一抗相同，避光孵育1h; 10. 避光洗至少4遍;然后加DAPI,2min后用荧光拍照;