胆汁酸合成增加与肝D-双功能蛋白表达增强、活性升高的相关性-临床医学论文

胆汁酸合成增加与肝D-双功能蛋白达增强、活性升高的相关性-临床医学论文 【摘要】 目的:观察胆汁酸合成增多时，DBP的表达和活性的 改变，从整体水平上探讨DBP在胆汁酸合成中的作用.方法:给 C57BL/6J小鼠T0901317及给Wistar大鼠饲喂高胆固醇食物，两条途 径激活肝X受体(LXR)，上调CYP7A1的表达增加胆汁酸的合成后， 用全自动生化分析仪测定粪胆汁酸，用RT-PCR的方法测定LXR的 下游基因胆汁酸合成限速酶CYP7A1，以及DBP的mRNA水平;用 WesternBlot测定DBP的蛋白水平;用分光光度法测定DBP活性.结 果:LXR被T0901317或高胆固醇食物激活后，CYP7A1的mRNA 增加(P<0.05)，导致粪中胆汁酸排出增加(P<0.05)的同时，小鼠、 大鼠肝DBP的mRNA水平、催化活性以及小鼠的DBP蛋白水平也 随之增加(P均小于0.05).结论:DBP在整体水平参与了胆汁酸合 成并发挥重要作用. 【关键词】D-双功能蛋白胆汁酸类和盐类/生物合成肝X受体胆固醇 7α-羟化酶 【Abstract】 AIM:ToinvestigatethephysiologicalroleofDBPinbileacidbiosynthesisthroughdeterminingthechangeofitsexpressionandactivitywhenbileacidbiosynthesisincreases.METHODS:ToactivateLXRandincreasebileacidsynthesis,C57BL/6JmicewerefedT0901317for7dandWistarratswerefedahigh-cholesteroldietfor2wk.Fecalbileacidwasmeasuredbyauto-biochemical-analysisapparatus.TheexpressionofCYP7A1andDBPmRNAwasanalyzedbyRT-PCR.DBPprotEinwasestimatedbyWesternBlot.DBPactivitywasmeasuredbyspectr ophotometry.RESULTS:Fecalbileacids(P<0.05),themRNAexpressionofCYP7A1(P<0.05)andDBP(P<0.01),andactivityofDBP(P<0.05) inliverofC57BL/6JmicetreatedwithT0901317andWistarratsfedhigh-cholesteroldietwerehigherthanthatinthecorrespondingcontrolgroups.TheliverprotEInlevelofDBPinmicetreatedwithT0901317alsoincreased(P<0.05).CONCLUSION:DBPisinvolvedinthebileacidbiosynthesisinvivo. 【Keywords】DBP;bileacidsandsalts/biosynthesis;LXR; cholesterod7-alpha-hydroxylase 0引言 胆固醇由限速酶,胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)催化，生成7 α-羟胆固醇，进而生成胆汁酸前体三羟或二羟胆甾烷酰辅酶 A(THC-CoA或DHC-CoA)后，经过氧化物酶体β,氧化生成胆汁酸. 但β,氧化中加水、再脱氢两步反应由何酶催化,知之甚少.我们发 现,过氧化物酶体内D-3-羟脂酰辅酶A脱水酶,D-3-羟脂酰辅酶脱氢 酶，简称D-双功能蛋白(DBP),1-2,，能在体外催化胆汁酸前体脱 水与脱氢,3-4,.但在体内DBP是否与胆汁酸合成有关有待确定我们 用T0901317和高胆固醇分别激活C57BL/6J小鼠和Wistar大鼠肝 LXR,5-6,，上调其靶基因CYP7A1的表达，增加胆汁酸的合成后， 观察DBP表达和活性改变，进一步确定DBP在体内胆汁酸合成中的 作用. 1材料和方法 1.1材料20只8,10周龄成年雄性C57BL/6J小鼠由北京实验动物中心提供，20只10周龄成年雄性Wistar大鼠由河北医科大学实验动物中心提供;T0901317为Cayman公司产品;(?)-3-羟基癸酰酸、,S,-,-,-α-苯乙胺、辅酶A(HS-CoA)，L-乳酸脱氢酶(LDH)为sigma公司产品;异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、RT试剂盒为Promega公司产品;TaqDNA聚合酶为鼎国化学试剂公司产品.PCR引物由上海捷倍思基因技术有限公司合成.其他常规试剂均为进口分装或国产分析纯. 1.2方法 1.2.1动物分组及取材将小鼠随机分为对照组和激动剂组，每组10只.两组均给予普通小鼠饲料.激动剂组用LXR激动剂T0901317灌胃(20mg/kg?d)，对照组只给予T0901317的溶解剂，连续灌胃7d.灌胃第7日时，将小鼠单笼饲养，收集24h粪便，用于粪便胆汁酸测定.灌胃第8日，小鼠麻醉后，迅速取出肝脏，置液氮中，用于总RNA提取、DBP蛋白量及活性测定. 将大鼠随机分为两组，每组10只，高胆固醇组，给以高胆固醇饲料(100g高胆固醇饲料中含有2g胆固醇，10g玉米油，88g标准饲料)喂养;对照组，给以标准饲料喂养.饲养至第2周.尾静脉取血，确认CH组血胆固醇(2.729?0.757)mmol/L高于对照组(1.426?0.257)mmol/L后，麻醉大鼠，迅速取下肝脏，置液氮中，用于总RNA 提取及DBP活性测定.处死大鼠前1d单笼饲养收集24h粪便，用于粪便胆汁酸测定. 1.2.2肝脏DBP活性测定按参考文献,1,的方法制备肝匀浆，按参考文献,7,的方法制备D-(-)-3-羟辛酰辅酶A.本实验以D-(-)-3-羟辛酰辅酶A为底物用分光光度法测定肝匀浆中DBP的活性,4,.酶活性单位用kat/kg表示.蛋白质采用改良Lowry法定量,8,. 1.2.3肝组织CYP7A1和DBPmRNA水平测定采用异硫氰酸胍一步法提取肝组织总RNA,9,.以β-actin为内参照，RT-PCR法测定CYP7A1，DBPmRNA的相对表达量.用凝胶成像分析系统分析经琼脂糖凝胶电泳分离的扩增产物的灰度值.相对表达量以目的基因与β-actinmRNA的灰度值之比表示.DBPPCR引物:5′AAGTGATGAAGACTGGGATA3′，5′TGTAGGCAAACAGGAGAA3′，产物793bp;大鼠CYP7A1引物:5′GCCGTCCAAGAAATCAAGCAGT3′，5′TGTGGGCAGCGAGAACAAAGT3′，产物305bp;C57BL/6J小鼠CYP7A1引物:5′CTGCTACCGAGTGATGTTTG3′，5′ACTTCTTCAGAGGCTGCTTT3′产物423bp;β-actinPCR引物:5′GAGACCTTCAACACCCCAGCG3′，5′TCGGGGCATCGGAACCGCTCA3′，产物404bp. 1.2.4肝组织DBP蛋白水平测定采用Westernblot法测定肝组织DBP蛋白水平.取C57BL/6J小鼠肝组织制成匀浆，4?离心后取上清，用改良Lowry法进行蛋白总量测定.SDS-PAGE电泳的蛋白上样量为 220ug.经过转膜和封闭处理后，对PVDF膜加入DBP一抗(兔抗人)，室温静置过夜，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔).最后用4-氯-1萘酚显色液显色，凝胶成像分析系统照相并分析每个条带的积分光密度值. 1.2.5粪胆汁酸的测定参照文献,10,的方法，用无水乙醇分别从C57BL/6J小鼠和Wistar大鼠干燥至恒重的粪便中提取胆汁酸.用OlympusAu2700型全自动生化分析仪测定胆汁酸，以每克干燥粪便中含有胆汁酸的微摩尔数表示粪中胆汁酸含量(μmol/g). 统计学处理实验数据以x?s表示，用SAS软件进行统计学处理.两组均数间比较采用t检验，两变量间相关性采用直线相关分析.以P<0.05为有统计学意义. 2结果 2.1胆汁酸水平激动剂组C57BL/6J小鼠和高胆固醇组大鼠的粪便胆汁酸量(μmol/g)均高于各自的对照组〔(1.323?0.277)vs(1.008?0.205)，(5.539?1.710)vs(0.575?0.125)〕. 2.2肝脏CYP7A1,DBPmRNA水平激动剂组C57BL/6J小鼠(图1A，表1)和高胆固醇组大鼠(图1B，表1)肝CYP7A1，DBPmRNA表达量均高于各自的对照组. A:小鼠;B:大鼠. 图1肝CYP7A1和DBP的RT-PCR扩增产物电泳(略) 表1小鼠和大鼠肝CYP7A1和DBPmRNA的表达(略) aP<0.05,bP<0.01vs对照 2.3肝脏DBP活性的改变激动剂组C57BL/6J小鼠和高胆固醇组大鼠肝脏的DBP活性(mkat/kg,n=10)均高于各自的对照组(0.25?0.045)vs(0.185?0.04)，(0.193?0.032)vs(0.147?0.042). 2.4C57BL/6J小鼠肝脏DBP蛋白量的改变激动剂组C57BL/6J小鼠的DBP蛋白表达量(12?1.0，n=8)高于对照组(10.75?0.866，n=8，P<0.05,图2). 图2Westernblot分析C57BL/6J小鼠肝DBP的蛋白表达量(略) 2.5肝脏DBP与CYP7A1mRNA水平的相关性经直线相关分析，C57BL/6J小鼠肝脏DBPmRNA与CYP7A1mRNA的表达量呈正相关(r=0.6555，P,0.05);大鼠DBPmRNA与CYP7A1mRNA的表达量也呈正相关(r=0.74,P<0.05). 3讨论 胆固醇转化为胆汁酸是机体胆固醇排出体外的主要途径.胆固醇向胆汁酸的转化除了与其合成的限速酶CYP7A1的活性有关外，还涉及胆固醇侧链在过氧化物酶体中的氧化缩短过程.本实验用LXR人工合成配体T0901317和高胆固醇饮食两条途径激活LXR，增强其下游基因CYP7A1的表达后，微粒体内生成增加的7α-羟胆固醇经羟化、连接辅酶,等反应转变成27碳的胆汁酸前体THC-CoA或 DHC-CoA.后者再经过氧化物酶体β-氧化缩短侧链后转变成胆汁酸，导致粪便胆汁酸生成增多.与此同时，过氧化物酶体β-氧化途径中催化第二步水化反应和第三步脱氢反应的D-双功能蛋白的mRNA和蛋白表达增强，并与CYP7A1mRNA表达呈正相关.表明:LXR激活后，胆汁酸生成增多不仅与胆汁酸合成的限速酶CYP7A1的表达增强有关，还与过氧化物酶体β-氧化途径中的D-双功能蛋白表达增强、活性升高有关.结合我们以前的实验结果:?DBP在体外能将胆汁酸前体24-烯-THC-CoA催化生成24-酮-THC-CoA,3-4,.?DBP表达及活性升高，可促进胆汁酸合成,10,.?DBP缺陷患者的血清中有大量的不成熟的27碳胆汁酸堆积,11,，提示DBP在整体水平参与了胆汁酸的合成并发挥重要作用. CYP7A1是胆汁酸经典合成途径的限速酶，DBP是过氧化物酶体β-氧化过程中的重要酶蛋白.激活LXR，上调其下游基因CYP7A1表达的同时，DBP是通过什么机制被上调,DBP与CYP7A1在基因表达的调节机制上是否存在一定的联系,需要进一步证实. 随着人们生活水平的提高，高胆固醇血症的发病率日益上升，已严重威胁了人类的身心健康.DBP在胆汁酸合成过程中发挥重要作用的发现，将为通过胆汁酸的生成降低血胆固醇提供一个新研究靶点. 【参考文献】 ,1, JiangLL,KobayashiA,MatsuuraH,etal.PurificationandpropertiesofhumanD-3-hydroxyacyl-CoAdehydratase:Mdium-chainenoyl-CoAhydrataseisD-3-Hydroxyacyl-CoAdehydratase,J,.JBiochem,1996,120(3):624-632. ,2, JiangLL,MiyazawaS,HashimotoT.PurificationandpropertiesofratD-3-hydroxyacyl-CoAdehydratase:D-3-hydroxyacyl-CoAdehydratase/D-3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenasebifunctionalprotEin ,J,.JBiochem(Tokyo),1996,120(3):633-641. ,3, KurosawaT,SatoM,JiangLL,etal.Stereospecificformationof(24R,25R)-3alpha,7alpha,12alpha,24-tetrahydroxy-5beta-cholestan-26-oicacidcatalyzedwithaperoxisomalbifunctionalD-3-hydroxyacyl-CoAdehydratase/D-3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenase,J,.BiolPharmBull,1997,20(3):295-297. ,4, JiangLL,KurosawaT,SatoM.PhysiologicalroleofD-3-hydroxyacyl-CoAdehydratase/D-3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenasebifunctionalprotEIn,J,.JBiochem(Tokyo),1997,121(3):506-513. ,5, LehmannJM,KliewerSA,MooreLB,etal.ActivationofthenuclearreceptorLXRbyoxysterolsdefinesanewhormoneresponsepathway ,J,.JBiolChem,1997,272(6):3137-3140. ,6, StulnigTM,SteffensenKR,GaoH,etal.NovelRolesofLiverXReceptorsExposedbyGeneExpressionProfilinginLiverandAdiposeTissue,J,.JMolPharmacal,2002,62(6):1299-1305. ,7, KobayashiA,JiangLL,HashimotoT.Twomitochondrial3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenasesinbovineliver,J,.JBiochem(Tokyo),1996,119(4):775-782. ,8, MarkwellMA,HaasSM,BieberLL,etal.AmodificationoftheLowryproceduretosimplifyproteindeterminationinmembraneandlipoproteinsamples,J,.AnalBiochem,1978,87(1):206-210. ,9, ChomczynskiP,SacchiN.Single-stepmethodofRNAisolationbyacidguanidiniumthiocyanate-phenol-chloroformextraction ,J,.AnalBiochem,1987,162(1):156,159. ,10,石如玲，赵朝贤，朱海暴，等.大鼠肝脏D,双功能蛋白 活性增加与胆汁酸合成的关系,J,.中国医学科学院学报， 2005,27(3):321-324. ,11, SuzukiY,JiangLL,SouriM,etal.D-3-hydroxyacyl-CoAdehydratase/D-3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenasebifunctionalproteindeficiency:Anewlyidentifiedperoxisomaldisorder,J,.AmJHumGenet,1997,61(5):1153-1162.