超声辅助热乙醇提取法测定浮游植物叶绿素a的方法优化

超声辅助热乙醇提取法测定浮游植物叶绿素a的方法优化 超声辅助热乙醇提取法测定浮游植物叶绿 素a的方法优化 第34卷第4期 2010年7月 水生生物 ACTAHYDR0B10L0GICASINICA VO1.34.NO.4 Ju1..2010 D0I:10.3724/SP.J.1035.2010.00856 超声辅助热乙醇提取法测定浮游植物叶绿素a的方法优化 梁兴飞郭宗楼 (浙江人学牛物系统1程与食品科学学院,杭州310029) OPTIMIZATIONOFTHEMETHoDONDETERMINATloNOFPHYTOPLANKTON CHLOROPHLLABYUSINGUIRASOUND.ASSISTEDHOT-ETHANOLEXTRACTI ON LIANGXing--FeiandGUOZong—Lou (SchoolofBiosystemsEngineeringandFoodScience,Zh~iangUniversity,Hangzhou3100 29) 关键词:超声辅助;热乙醇;叶绿索?;法优化 Keywords:Ultrasound-assisted;Hot—ethanol;Chlorophyll口:Methodoptimization 中图分类号:Q一3l文献标识码:A文章编号:1000—3207(2010)04—0856—06 浮游枘物长期以来一直被作为水质的指标生物,而 浮游植物的种群生物量(Phytoplanktonbiomass)是水生态 系统的一个重要指标….叶绿素a存在于所有浮游植物体 内,占细胞干重的1%一2%,因此浮游植物叶绿素a含量 成为浮游植物生物量的重要指标而被广泛应用j.日前, 浮游植物口r绿素a的测定力'法主要有高效液相色谱法,荧 光光度计法和分光光度计法.高效液相色谱法南于操作繁 琐,不适于样品的快速榆测口.而荧光光度计法虽然能 够较为快速测量叶绿素a的含量,但是南于一些降解产 物可对光谱产生十扰因而会造成误差….分光光度汁 法由于操作简单,准确可靠等优点成为了目前最普遍的测 定浮游植物叶绿素?的方法[11,12].分光光度计法又分为多 色法和单色法,多色法南于测量数据较多,误差大,已经 很少使用,目前大多采用的是以丙酮,乙醇等作为萃取溶 剂的单色法,丙酮法应用较早,目前际上仍在广泛使 用.近年来,从萃取效果,安全等考虑,逐渐采用乙醇作 为萃取溶剂来测定叶绿素a的含量,并有研究对热乙醇 法的误差进行_r探讨及比较r与丙酮法的差异l】J,而 关于热乙醇法的各个冈素对提取叶绿素a的影响尚未报 道.研究证实巾于超声波具有强人的机械传质作用以及空 化作用等系列效应,使得胞快速破碎,有利于溶剂浸 入细胞而可以提高目标成分的提取率lJ】.冈此,本研究 采用超声波细胞粉碎仪破碎细胞,用单因素试验和正交 试验确定热乙醇提取浮游植物叶绿素a方法中各因素的 影响并选择最佳条件,在此基础上对该力法的精密度进 行评价. 1材料与方法 1.1藻种及培养条件 铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)和鱼害微囊藻 fMicrocystisichthyoblabeKutz)(购白中同科学院水生生物 研究所淡水藻种库),培养基为BG11培养基,光照强度为 2500lx,温度为30.C,光暗周期为14h:10h,对数生长期 的藻液为实验材料. 1.2测定原理 存天然水体中,浮游植物中不仅存在着具有光合活 性的叶绿素a,而日.存在着没有光合活性的脱镁叶绿素a, 因此应用叶绿素a作为浮游植物生产量的主要指标时, 必须将叶绿素a与脱镁叶绿素a区分开来. 叶绿素经酸化处理后,镁原子被氢原子取代,叶 绿素a降解为脱镁叶绿素a.脱镁叶绿素a与等量的叶绿 素a相比,存665llm波长下,具有较低的消光系数 (1.0/1.7).故用酸化的'法,测定I1绿素前后光密度的 变化.如果天然水体中脱镁叶绿素相对含量较高,酸化处 收稿日期:2009—08—03;修订日期:2010—04—12 基金项目:水体污染控制与治理同家科技重大专项(2008ZX07421一OO1)资助 作者简介:梁兴飞(1983一),男,汉族,山西省晋中人;硕士研究生;主要从事生物控藻技术研究..E—mail:liangxingfei922@163.corn 通讯作者:郭宗楼,E-mail:zlguo@zju.edu.cn 4期梁兴飞等:超声辅助热乙醇提取法测定浮游植物叶绿素a的方法优化857 后光密度的变化就较小;反之,脱镁叶绿素的相对 靖越低,酸化处卵光密度的变化就越大【17]c,根据这个原 ,选J{j合适的汁算公式,就叮以汁算出叶绿素a与脱镁 叶绿素a的带. 测定过程中,凡参与计算的各光密度值都应减去 750nm处的光密度值,以消除悬浮物质的干扰.首先测 定酸化前和酸化后的光密度65b和E665a(酸化前测定的 光密度值用D665b,D750b表示,酸化后测定的光密度值用 D665a,D750a表/.). E665b=D665b—D750b E665a=D665a—D75oa 根据Lorenzen公式.汁算单位样品中fl绿素a含量 叶绿翱)= 其中,A一一不同萃取溶剂中叶绿素a的比吸光系数 K——常数,为纯叶绿素a酸化前的光密度与 酸化的后的光密度变化的比值 一一 提取液体积(mL) 一一 样品的体积(L) L一一比色杯光程长度(cm) 1.3超声辅助热乙醇提取法测定叶绿素a 取对数生K期生长的铜绿做瞧藻藻液10mL过0.45 pm的混合纤维素膜,将带藻细胞的膜冷冻过夜,取后 迅速川8mL热乙醇于热水浴中萃取2min,将萃取液声 破碎5—20min,于晴处静置2—6h,离一c~,(5ooor/min, 4.C)5min后取上清液3.5mL置于比色?『L中,于665nm和 750nm处测吸光值,然后滴加200uL的lmol/L盐酸酸 化,5min后于波长665nm和750nm处再测吸光值.采_L}J 热乙醇为萃取溶剂,A=11.5,K=2.43,比色nTL光程为1cm, 则公式(1)可简化为: 27— 叶绿素8(Bg/L):— .9X — (E— 66 _ 5b _ - E — 66— 5a)~/)(2) V 1.4单因素试验 由于叶绿素a在萃取2—6h内稳定,趟过6h则慢慢降 解,故单冈素实验中的萃取时问为4h研究表明藻类的细胞 壁在超声频率为20kHz,功率为4Ow时极容易破碎】,故 试验中采用的趟卢频率为20kHz,功率为40w. 试验冈素1:超声时间分别为1,3,5,10,15,20min, 乙醇浓度为80%,萃取温度80.C. 试验冈素2:萃取温度分圳为60.C,65.C,70.C, 75.C,80.C,超声时间为10min,乙醇浓度为80%. 试验冈素3:乙醇浓度分别为50%,60%,70%,80%, 90%,超卢时间10rain,萃取温度80.C 1.5超声辅助热乙醇提取法的正交优化试验 为了确定超声辅助热乙醇提取法测定浮游植物 叶绿素a的最佳条件,根据L大J素实验的结果,选 择对提取叶绿素含量a有意义的水平做正交试验, 采用L9(3)正交表,以萃取温度,萃取时间,乙醇浓 度,超声时间4个因素,选择个水平进行试验,实 验方案(表1). 1.6超声辅助热乙醇提取法测定浮游植物叶绿素a方法 评价 南正交优化试验得出超声辅助热乙醇提取法测定叶 绿素a的最佳条件,对该方法进行精密度实验,取同一藻 液进行5次分析,并计算结果的标准偏差,以评价该办法 的精密度. 1.7丙酮提取法测定叶绿素a 取藻液10mL(与超声辅助热乙醇提取法采用的藻液 为同一批)过0.45m的混合纤维素膜,将膜剪碎后存研 钵中加入8mL90%丙酮研磨,定量转移到刻度试管中 计』J口入90%丙酮使终体积为8mL,于暗处静置萃取12h, 离一C~,(5ooor/min,4.C)5min后取上清液3.5mL于波长665 nm和750nm处测吸光值,然后加入200laL的1mol/L 盐酸酸化,5min后于波长665rim和750nm处再测吸光 值.采用丙酮为萃取溶剂,A=11.2,K=2.43,比色m光程为 lcm,则公式(1)可简化为: 叶绿素n(g/L)=兰二笪(3) 2结果 2.1单因素试验 超声时间对叶绿素a提取的影响1表明,存 1一l0min『人J,随着超声时间的延K,藻细胞逐渐被破碎, 叶绿素a充分溶lLfJ,叶绿素a含量逐渐增加超声10min ,叶绿素a含量达到最大值,含量为282.72lag/L,超过 15rain,叶I绿素含量外始降低. 表1因素水平表 Tab.1Factor1evelchart 858水生生物34卷 Ultrasonictime(min) 1超声时间对叶绿素a提取的影响 Fig.1Effectsofultrasonictimeonextractionofchlorophylla 萃取温度对叶绿素口提取的影响罔2表明,随着 萃取温度的升高,叶绿素a的含量总体呈现上升趋势,超 过65.C则上升趋势变缓,在75.C时叶绿素a含量最大达 到260.40lag/L,之后略有下降. Extractiontemperature(?) 2萃取温度对叶绿素a提取的影响 Fig.2Effectsofextractiontemperatureonextractionofchloro— phylla 乙醇浓度对叶绿素a提取的影响网3表明,乙 醇浓度对叶绿素a含量影响很大.随着乙醇浓度的升高, 叶绿素a含量也逐渐升高,且当乙醇浓度超过60%时,叶 绿素?含量明显增加.当乙醇浓度达到90%时,叶绿素a 含量达282.72g,L. 0 Ethanolconcentration(%) 3乙醇浓度对叶绿素a提取的影响 Fig.3Effectsofethanolconcentrationonextractionofchloro— phylla 2.2超声辅助热乙醇提取法的正交优化试验 根据单因素实验的结果,采用L9(3)正交表,以萃取 温度,萃取时间,乙醇浓度,超声时间4个因素,选择三 个水平进行试验,试验结果(表2). 南表2极差分析可知,对于叶绿素a的提取,影响冈 素的主次是C>A>D>B.乙醇浓度是主要因素,萃取温度 是居中囚素,超声时问和萃取时间是次要因素,最优组 合为A3B】C3D2.对实验结果进行方差分析,,检验(表3). 南表3方差分析可以看出,超声时间因素的偏差平方 和之比为37.00>Fo05(2,2)=19.00,为显着因素,萃取温度和 乙醇浓度影响冈素的偏差平方和之比都大于 加】(2,2)=99.00,为极显着因素,而萃取时间则影响不显着. 表2正交试验结果 Tab.2Resultsoforthogonaltest 一,I/sT1一?_Iu一三u 4期梁兴琶等:超声辅助热乙醇提取法测定浮游植物叶绿素a的方法优化859 注:Foo5(2,2)=19.00,F00l(2,2)=99.00 2-3超声辅助热乙醇提取法测定浮游植物叶绿素a方法 评价 m正交优化试验得m趟声辅助热乙醇提取法测定叶 绿素a的最佳条件为:萃取温度80.C,萃取时问2h,乙醇 浓度90%,超声时间10min.取同一藻液进行5次分析,汁 算叶绿素a含量的标准偏差为0.00998,表明该方法具 有较高的精密度. 2.4与丙酮提取法的比较 分别用超声辅助热乙醇提取法和丙酮提取法对实验 室纯培养铜绿微囊藻藻液,鱼害微囊藻液(培养一周)以及 采白人湖的藻样进行叶绿素a含的测定,对结果进行 比较(4). 如陶4所示,对于同一类的样品,超声辅助热乙醇 提取法测定的11{'绿素a含明显高于丙酮提取法的含量, 日.前者的SD值均小于者,表明前者测定结果准确,而 日_具有更高的萃取效率. 3讨论 超声辅助热乙醇提取法测定叶绿素a含量的单冈素 实验表明,n绿素a的提取受到许多冈素的影响.其中乙 醇浓度x~11f绿素a的提取影响非常显着,在所采取的条 三 6 口Acetoneextractionmethod 件下,乙醇浓度越高,越容易引起细胞溶胀,使得叶绿素 a溶,冈而11-I一绿素a含量越高.温度x~11]一绿素a的提 取影响也很大,本实验表明,随着温度的升高,叶绿素a 的含量逐渐增大,但足温度过高,很容易破坏叶绿素a, 使得溶剂中叶绿素a含量下降.研究表明藻类的细胞壁在 超声频率为20kHz,功率为40w时极容易破碎【191,日.随 着超声时间延长,藻细胞被充分破碎,叶绿素a逐渐溶出, 超声10min,用血球计数板进行显微汁数发现,藻细胞 破碎比例达到98.3%,此时叶绿素a含髓达到最大值.超 过15min后,叶绿素a含量降低,这是由于超声时间过长 造成提取液局部温度上升,叶绿素开始降解.超声辅助热 乙醇提取法的正交优化试验表明,影响叶绿素a提取的 冈素主次顺序是:乙醇浓度>萃取温度>超声时间>萃取时 问,通过极差分析和力'差分析,结果都显爪乙醇浓度 是主要冈素,萃取温度是居中冈素,超声时间和萃取时 间是次要冈素,超声辅助热乙醇提取法测定浮游植物叶 绿素a的最佳方法为:温度80.C,萃取时间2h,乙醇浓度 90%,超声时间10min.对该方法进行精密度实验表明, 超声辅助热乙醇提取法具有较高的精密度. 本实验分别用超声辅助热乙醇提取法和丙酮提取法 对?种藻样进行叶绿素a含量的测定,对结果进行比较. MicrocystisaeruginosaMicrocystisichthyoblabeThealgaefromTaihuLake 4趟声辅助热乙醇提取法和丙酮提取法测定结果的比较 Fig.4Thecomparisonofresultsbetweentheultrasound?assistedhot— ethanolextractionmethodandacetoneextractionmethod ???????07654321 860水生生物34卷 对于同一类的样品,超声辅助热乙醇提取法测定的叶绿 素a含量明显高于丙酮提取法的含量,而对人湖藻样来 说两者差别更大,这很可能是南于太湖藻样中藻的种类 的不同造成1.与丙酮提取法相比,超声辅助热乙醇 提取法效率高,误差小,而且乙醇对人体健康的影响远 远小于丙酮,所以该法是一种更准确,安全的测定浮游植 物叶绿素a的力'法. 参考文献 [2】 [3] 【4】 [5] [6] 【7] [8】 JinXC,TuQYResearchcriterionofeutrophicationlakes [M].Beijing:ChineseEnvironmentalSciencePublishing Company.1990,268—270[金相灿,屠清瑛.湖泊富营养 化调查规范.北京:中同环境科学出版社.1990, 268—270] YangCGSongXH.SunBY.Comparisonofsimplemeth— odsforextractionandmeasurementofphytoplanktonic Chlorophyll—a【JJ.MarineScience,2007,37(1):6—9[杨彩 根,宋学宏,孙丙耀.浮游植物叶绿索a含请简易测定方 法的比较.海洋科学,2007,37(1):6—9] WuZB,ZhangBZ,ZhangLeta1.Highperformance liquidchromatographydetectionofchlorophylla,[~-carotene pheophorbidea【JJ.AnalytincalChemistry,2006,34(9): 1359[吴振斌,张兵之,张丽萍,等.叶绿素一a,13-胡萝h 素及脱镁叶绿素一a的高效液相色谱榆测.分析化学,2006, 34(9):1359] DaiRJ,TongB,HuangC,eta1.DeterminationofChloro— phyllsinDrinkingWaterbyHPLC【J】.TransactionsofBei— ringInstituteofTechnology,2006,26(1):87—89【戴荣继, 佟斌,黄春,等.HPLC测定饮用水中藻类叶绿素含量.北 京理T大学,2006,26(1):87—89] YoshidaE,NakamuraA,WatanabeReversed—phaseHPLC determinationofchlorophyllaandnaphthOquinOnesinpho— tosystemIofredalgae:existenceoftwomenaquinone一4 moleculesinphotosystemIofCyanidiumcaldarium[J1. 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