兔颈总动脉狭窄后脑缺血再灌损伤对VEGF及Akt表达的影响及意义

兔颈总动脉狭窄后脑缺血再灌损伤对VEGF及Akt表达的影响及意义 兔颈总动脉狭窄后脑缺血再灌损伤对VEGF及Akt表达 的影响及意义 分类号 密级 编号 中南大学 硕士学位 论文题目: 学科专业: 研究生姓名: 鲎噩 导师姓名及其 专业技术职称: 中 南大学 年月分类号 密级 编号 硕士学位论文 兔颈总动脉狭窄后脑缺血再灌损伤对及表 ‘ 达的影响及意义 。 ’如拶 . 作者姓名: 张丽婷 学科专业: 神经病学 学院系、所:湘雅三医院 指导教师: 范学军副教授 答辩委员会主席 中 南大学 年月原创性声明 本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名:兰纽丝 日期:堑 年』月巫日 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文, 允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内 容,可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》, 并通过网络向社会公众提供信息服务。 日期:??年罗月,日 作者签名:芗加历 导师签名钰中文摘要 中南大学硕士学位论文 摘要 目的:本实验通过建立颈动脉狭窄模型,研究颈动脉狭窄后兔脑 局灶性缺血再灌注损伤对血管内皮生长因子及丝氨酸/苏氨 酸蛋白激酶表达的影响及意义。 方法:应用只新西兰兔随机分组:正常对照组组,, 假狭窄组组,,狭窄组组,;狭窄假缺血组 组,,缺血再灌注组组,,狭窄缺血再灌注组组, ,、组根据再灌注时间等分为个小组,即再灌小时、 小时、小时、小时及小时组。、、组行“针控线栓法’’ 建立双侧颈总动脉中度狭窄,组行假狭窄以及、、组狭窄术 后的实验动物恢复正常喂养天,、组再予以右侧大脑中动脉闭 塞 甜巧,制作局灶性脑缺血再灌 注模型。狭窄后动物进行血管超声检查证实血管狭窄程度。分别采用 %氯化三苯四唑染色法观察梗死面积;行病理学检查;胍 原位杂交法观察脑缺血侧海马区细胞凋亡的情况,并计算阳性细胞 数;应用免疫组织化学法脑缺血侧海马区及川表达情 . 况,分别计算?值,进行组间比较及相关性。 结果:.肥检测:、、、组偶见凋亡细胞,、 组凋亡细胞数量较、、、组增加尸.,再灌注小时 后凋亡细胞数量升高,于小时后达高峰,对应时间点组凋亡细胞 数量较组少.。:免疫组化结果:、组极少 量表达,、组表达高于、组.,、组高 于、组?恤表达户.;、组各时间点、表 中文摘要 中南大学硕士学位论文 达朋值有统计学差异尸.,、组间朋值比较有统计学意 义尸.。 结论: .双侧颈动脉中度狭窄可一定程度上减轻兔脑局灶性缺血再灌 注损伤的程度。 .?揽参与缺血神经细胞内信号转导,并可能通过上调的 表达,而起到增强缺血耐受的作用。 关键词:颈总动脉狭窄, 局灶性缺血再灌注, 缺血耐受,凋亡, ,觚 ?中南大学硕士学位论文 英文摘要, : 巧 、 . 血/ 姑. : : ,,锄 , , 伊 ,; , ,如 , ,如 ,;, , 锄, , , ? ,. ?巧 , 玛叮, ,铲 劬,, .研 巧 .. 巧.% 衍 印 缈 姗 印 ?, , 英文摘要 中南大学硕士学位论文 ? 觚 也 巧,认. 锄 、 . :.肥,, 印 : 吐 , ,, . . 向,., 证 : . ..拶锄 ,,铲 曲 , 铲刽隐 ., , 氏., 厨吣. ,,“ 、 眦 俨. . : .. 砂 . ,? . . : , 巧 , , ?, ?向, 印 ?目录 中南大学硕士学位论文 目录 第一章前言. 第二章材料与方法?.. .材料.. ..实验动物?,..主要试剂与药品?. ..主要仪器与设备?. .方法.. ..动物模型制备..动物一般行为及神经功能缺损体征评分.., ..相关试剂配制..相关器皿的处理? ..石蜡切片制作?一 .. 染色 ..脏染色. ..尼氏体染色??. .. 原位杂交? .. 、的免疫组织化学染色法..图像处理及朋值. ..统计学处理第三章结果. .颈动脉狭窄模型制备结果. ..颈动脉狭窄模型手术结果?. ..颈总动脉内径测量结果.缺血再灌注模型结果?.. .组织形态学变化 ..缺血再灌注后病理学变化?. .. 染色 .. 结果??. .免疫组化结果.. .. 的表达.. 的表达??. .. 与相关性分析?.. 目录 中南大学硕士学位论文 .附图?...统计图.. ..颈动脉造模图?.. .. 染色 .. 结果??. ..免疫组化结果 ..免疫组化结果. 第四章讨论. .兔颈动脉狭窄模型的评价. .缺血再灌注模型评价?.. .脑缺血再灌注后凋亡细胞的动态变化 .脑缺血再灌注的表达及意义? .脑缺血再灌注的变化及意义?. . 与在脑缺血中的作用?. 第五章‘结论.. 综苤 致谢 攻读学位期间主要的研究成果?.. ?’ 英文缩写注释 史堕奎兰堡士学位论文 英文缩写注释 缩写 英文全称 中文全称 础 动脉粥样硬化颈动脉粥样硬化 队 仃短暂性脑缺血发作啪 缺血耐受 缺血预处理. 血管内皮细胞生长因子 / 蛋白激酶 . 曲 磷脂酰肌醇.激酶 硎. 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白激酶巧 颈总动脉哆 颈内动脉巧 颈外动脉 ,,一埘啪 氯化,,一三苯四氮唑 伍玎 磷酸盐缓冲液 ?. 血脑屏障 中南大学硕士学位论文 第一章前言 第一章前言 脑血管疾病是现代社会三大死亡原因之一,随着社会进入老龄化阶段,脑 血管病已成为当今社会各类死亡疾病原因之首,尤以缺血性脑血管疾病为多, 对 于该病的预防与治疗仍然是人类社会面临的~大挑战。缺血性脑卒中是各种 原因 导致脑动脉血流中断,局部脑组织发生缺血缺氧而出现相应神经功能缺损的 病理 生理过程。缺血性脑卒中具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率的 特点, 是人类主要的死亡和致残原因之一。该病不但给病人和家属带来痛苦和沉重的经 济负担,也给国家带来巨大的经济损失。在脑卒中患者中部分人存在基础动脉病 变,主要为动脉粥样硬化,导致动脉狭窄,尤以颈动脉粥样 硬化 ,为主。颈动脉粥样硬化致使血管狭窄,引起 脑血流动力学改变,导致短暂性脑缺血发作位 仕,,甚 至出现脑梗死。认本身据统计有约%一%患者在年内将产生严重的脑梗死。 发病机制至今仍未完全明确,现有以下几种学说:?血流动力学改变学说; ?血管内痉挛学说;?微栓子学说;?动脉受压学说;?盗血综合症学说?炎 症学说一。其中的血流动力学改变学说认为队是在血管本身病变狭窄的基础 上,机体的某些因素引起了血压降低,使病变血管区域血液供应显著下降,从而 发作。当血管轻度狭窄时对脑供血影响较小,当狭窄?%甚至%以上,会 明显影响血液动力学,严重时导致低灌注性发生。特别是当全身血液发生 再分配,严重狭窄部位的血流会更少,就会反复发作, 严重时可发展为脑 梗塞“。。国外已有众多学者研究发现多数的患者都伴有不同程度或不同部 位的脑部供血血管狭窄,欧美学者报道颅外段狭窄较多,日本学者报道则以颅内 段动脉狭窄居多,国内对于用检查认患者的报道不多,且多为小样本 量研究阳’,但可以认为颅内外血管狭窄作为病因之一在发病机制中占有重 要地位。近年来以寻找神经保护方法为目的的缺血耐受机制的研究成为热点。 缺血耐受? ,是飚切唔等首先提出的,认为短暂的 亚致死性脑缺血可诱导海马神经元对随后致死性缺血耐受明显增强。关于缺血耐 受的机制目前仍不清楚,动物实验提示缺血耐受的产生分为个阶段,即早期相 预处理数分钟内和延迟相预处理数天内。早期相主要通过血流量和细胞代谢中南大学硕士学位论文 第一章前言 介导缺血耐受;延迟相是缺血耐受的主要阶段,目前已认识到它是预处理刺激后 始动因子促发的多细胞因子和蛋白质参与的一个复杂过程,但其确切机制仍不被 了解担。随的临床研究中发现发病前有过同侧队的患者发生缺血性脑 血管病其预后好于未发生过认的患者;?的研究也发现首次发生脑梗 塞的患者与发病前有多次认发作的患者相比较,后者劳动能力的保留程度及 生活质量都明显高于前者,尤其与脑梗塞是在同一侧脑区者,这说明执 对随后的脑梗塞可能具有保护作用。 目前针对颅内外血管狭窄与脑组织缺血缺氧耐受能力关系的研究尚少。缺 血后受累损伤脑组织局部血流量减少,如不及时恢复血氧供应,由缺血缺氧 触发 的一系列瀑布样病理反应,最终将导致神经细胞坏死。只有及时部分或全部恢复 缺血脑组织的动脉血流供应,才可能将神经系统功能损伤的程度降到最低限度。 然而,恢复血液供应即缺血后再灌注也有其不利的一面,当组织、器官在缺血一 段时间后假使恢复血流,其缺血组织损伤有时并不减轻,反而加重,甚至可能会 使可逆性损伤转变为不可逆性损伤,这种在原有缺血性损伤基础上因再灌注后继 发的损伤即为缺血再灌注损伤。脑组织因各种原因缺血后再灌而注引起的继发性 损伤,即为脑缺血再灌注损伤。 由此看来,一切能减轻神经细胞缺血再灌注损伤程度的方法便可作为提高 缺血耐受能力的方法。缺血性脑血管病患者多可见颈动脉粥样硬化斑块形成,部 分患者发生认,最终导致脑卒中。既往对于脑缺血耐受的研究多以急性缺血预 处理后行再灌注损伤为主,很少有学者对长期缺血状态下再灌注损伤进行研究, 并认为缺血预处理增加了对缺血的耐受性。对于患者而言,长期的动脉基础 病变 对于脑缺血损伤的影响目前大多数认为加重病情,然而在实际工作中我们观察到 部分伴有动脉基础病变患者脑缺血后的神经功能较之为好。本实验试图通过建立 颈动脉狭窄模型,观察颈动脉狭窄对脑缺血耐受的影响。 脑缺血再灌注损伤后造成神经细胞凋亡,在细胞凋亡一系列反应中凋亡调控 基因相互作用。凋亡调控基因包括促凋亡基因和抗凋亡基因。脑缺血后,颅内神 经细胞内外的环境均发生改变,细胞内外出现的凋亡诱导因素如氧自由基、钙超 载、?的释放等均可激活相关凋亡调控基因进而启动细胞凋亡过程。凋亡是 缺血一再灌注损伤导致缺血脑区迟发性神经元死亡的主要形式 ’。是一 中南大学硕士学位论文 第一章前言 类普遍在于中枢神经系统的生长因子,在脑缺血早期蛋白表达上调不明 显,但是缺血中或晚期局部组织的蛋白表达则有明显上调,一般情 况下内源性表达增高是脑缺血后神经元对抗损伤的一种保护性反应。有学者研究 认为是通过减少缺血半暗带一蛋白的表达从而抑制神经细胞凋 亡, 以达到脑保护作用别; 也有学者发现与受体 ?,’结合后可促进半暗带区血管的再生,有助于半暗带侧 支循环的建立,对脑缺血后半暗带神经细胞功能发挥一定的作用。 ,,是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 脂又称蛋白激酶? 主要通过磷脂酰肌醇激酶激活,并通过相关底物的磷酸化而发挥广泛的生物 学 效应,包括抗凋亡增强细胞存活功能引。触通过磷酸化删尸的,.位点, 一/通路参与的神经保护及影响血脑屏障通透性。削是一种/ 蛋白激酶,它是最主要的靶酶 。当上游信号刺激细胞膜表面时,在磷脂 酰肌醇依赖的蛋白激酶的协同作用下、卯和尸、、尸,卯可与 结合,导致其从胞浆转位到质膜,并促进的。眙厂和砌,.位点磷酸化。 ,.和或刀,.位点的磷酸化是激活的必要条件,而激活是其发挥促 细胞生成功能的重要前提羽。激活的?撇主要通过促进卜家族、、 .、糖原合酶激酶一一等下游底物磷酸化而发挥广泛的生物学效 应,包括抗凋亡、促细胞生存等功能。 本实验通过建立兔颈动脉中等程度狭窄模型,并在此基础上行缺血再灌注损 伤,通过比较有无动脉狭窄对局灶性缺血再灌注损伤存在影响,并检测、 削隐的表达进一步验证动脉狭窄后血流动力学对颅内缺血损伤的影响。中南 大学硕士学位论文 第二章材料与方法 第二章材料与方法 .材料 ..实验动物 健康雄性新西兰大白兔只,清洁级,由中南大学湘雅三医院动物实验中 心提供,体重.一.千克。所有实验动物均单笼饲养,自由饮水进食,昼夜 规律单笼喂养,适应性喂养后用于实验。 ..主要试剂与药品 试剂和药品 供应厂商 鼠抗兔单克隆抗一 北京博奥森公司 鼠抗兔单克隆抗体 美国锄公司 脱氧核糖核苷酸末端转移酶 美国公司 脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛 美国公司 一? 美国公司 抗 一. 廿犯啪 美国公司 美国公司 一一一?一卜 一美国公司 北京化学试剂厂 戊巴比妥钠粉剂 免疫组化试剂盒 美国公司 美国公司 显色试剂盒 强 美国公司 %马血清 美国公司 湖南化学试剂厂 中性树胶 青霉素万单位/支 华北制药有限公司 华北制药有限公司 肝素钠注射液 武汉博士德生物工程有限公司 枸橼酸抗原修复液一 美国公司 硫化钠 天津大茂 中南大学硕士学位论文 第二章材料与方法 多聚甲醛 天津科密欧 氢氧化钠 天津恒兴 叠氮化钠 湖北福鑫化工 无水乙醇 汕头西陇化工 异丁醇 天津科密欧 正丁醇 上海国药集团 二甲苯 上海国药集团 %过氧化氢液 江西德成 ..主要仪器与设备 主要仪器与设备 制造公司 电子天平 梅特勒.托利多仪器公司 【 彩色超声诊断仪 ,.. 头皮针.号 上海宏联医学仪器发展有限公司 三运电热恒温水箱 天津泰斯特仪器有限公司 电热恒温干燥箱 上海跃进医疗机械厂 生物光学显微镜 生物显微镜 显微镜 日本 图像分析系统 .软件控温磁力搅拌器一 江苏金城国胜实验仪器厂包埋机 上海徕卡仪器有限公司 洲切片机 上海徕卡仪器有限公司上海徕卡仪器有限公司 展片仪上海徕卡仪器有限公司 烤片仪 脱色摇床一 常州澳华仪器厂 , , 超纯水器?中南大学硕士学位论文 第二章材料与方法 .方法 ..动物模型制备 ...狭窄管及线栓制作 狭窄管制作 参考郑冲四等的实验研究,结合本实验目的,使用.号针头,并使针尖 变钝,以便模型制作时避免刺伤血管,造模前消毒备用。 线栓制备 参考孔令琦等的研究将号钓鱼线剪成长约的线段,在一端涂布硅 胶形成约.舢的线栓头,量取距离线栓头端及米处以红、黑颜色标志, 线栓制备后垂直悬挂晾干,消毒后并肝素化备用。 ...动物分组 只健康雄性新西兰大白兔随机分为组: 组正常对照组:普通喂养,不干预; 组 假狭窄组:行双侧颈总动脉狭窄假手术,术后饲养天; 组 狭窄组:行双侧颈总动脉针控线栓法狭窄术,术后饲养天; 组狭窄后假缺血手术组:行双侧颈总动脉针控线栓法狭窄术,术后饲 养天,再行局灶性缺血再灌注假手术操作; 组 缺血再灌注组:只动物分别行大脑中动脉闭塞 ,局灶性脑缺血小时,依不同的再灌注时间再等 分为个组,即再灌注小时,、再灌注小时组,、再 灌注小时组,、再灌注小时组,、再灌注小 时组,; 组 狭窄缺血再灌注组:只动物全部行双侧颈总动脉针控线栓法狭 窄术。术后恢复正常饲养天,分别行局灶性脑缺血小时,依 不同的再灌注时间再等分为个组,即再灌注小时组,、再灌注 小时组,、再灌注小时组,、再灌注小时组 ,、再灌注小时组,。 ...颈动脉超声检查 在造模前随机抽取只正常实验动物进行颈动脉超声检测,使用%戊巴比 中南大学硕士学位论文 第二章材料与方法 妥钠 /麻醉后,仰卧固定,使用脱毛剂去除正中颈部兔毛,用超声探头 沿血管走行轻放于气管旁,在环状软骨下处可查看到颈动脉,深度约为 .。由超声科高年资医师操作,测量颈总动脉内径并记录。 造模后动物喂养天后再随机选取只动物行超声检查,操作同前,测定 颈总动脉狭窄后颈部血流情况,测量结扎处血管内径,并测定狭窄长度,记录 结 ’ 果并采集图像。 ...狭窄模型制备 实验动物常规禁食不禁饮小时,称重,术前常规肌注青霉素万, 用%戊巴比妥钠/行腹腔注射,待痛觉减退麻醉满意后固定于手术台, 暴露前颈部,使用脱毛剂脱毛,生理盐水冲洗后,采取颈部正中切口,常规消 毒 铺巾,切开皮肤,尽量避开术野血管,小心分离皮下组织,暴露气管,游离出右 侧颈动脉鞘,小心分开迷走神经避免牵拉,并游离右侧颈总动脉 巧,长约,根据郑冲等的方法用号无菌缝线与狭窄管平行紧密 结扎四道见图,抽出狭窄管,调整缝线间的距离,形成狭窄处内径相当于相 应狭窄管的外径。左侧颈总动脉同右侧方法制造狭窄。各层皮下组织复位,观察 无出血点后,再次消毒手术区皮肤,并予以缝合见图。狭窄后动物普通喂 养,术后三天青霉素抗感染。假狭窄手术组同狭窄组动物常规术前禁食不禁饮, 术前仍肌注青霉素,常规麻醉后固定、褪毛、消毒、铺巾,仍取前颈正中切口切 开皮肤,逐层分离,直至暴露游离两侧颈总动脉后放置缝线及狭窄管,并抽离两 者行假狭窄术,并复位皮下各层组织,再次消毒后缝合皮肤,麻醉清醒后恢复普 . 通喂养,术后三天肌注青霉素抗感染。 ...缺血再灌注模型制备 根据孔令琦【刀等方法行将实验动物行脑缺血再灌注,仍常规完善术 前准备,用%戊巴比妥钠/腹腔麻醉后,固定,颈部去毛,仍采取颈部 正中切口,逐层分离皮下组织,仔细暴露右侧颈总动脉及颈动脉分叉,并尽量向头侧分离颈外动脉 ?和颈内动脉 吼 。在发出第一分支处将其结扎,而后使用微动脉夹暂时夹闭和 ,在结扎处的近端将其离断并反折,使残端与颈内动脉呈一直线。 ? ‘ 第二章材料与方法 中南大学硕士学位论文 将线栓自残端向颈内动脉缓缓插入,遇到上的动脉夹后就去掉动脉夹 继续插线。直到感觉到轻微的阻力不能进线时停止插线,且观察线栓进入颈 内动 脉长度大于,则将残端及线栓一同结扎,记录时间做为动脉阻塞开始时 间,并逐层缝合颈部切口。线栓堵塞小时后按组分别退出线栓至,并注 意有无出血,分别实现再灌注小时、小时、小时、小时、小时。 ..动物一般行为及神经功能缺损体征评分 方法对其神经 实验动物缺血再灌注后?小时后开始苏醒,并按 功能进行评分。 神经功能缺损级评分: ’分:实验动物无各种神经功能缺损症状体征。 分:实验动物舒醒后出现左侧前肢屈曲不能伸直、右侧霍纳征,表现 为提颈时左前肢向下、上抬无力。 分:实验动物舒醒后向外侧转圈大部分向左,小部分向右。 分:实验动物造模舒醒后行走时向左侧倾倒。 分:实验动物造模后意识丧失,无自发行走,。 实验动物造模后均行神经功能评分,评分为卜分者纳入实验组别,分、 分予以剔除。若实验动物符合评分但评分后非正常死亡者作为缺失值,予以 剔 除,在后续实验中补足。 ..相关试剂配制 脱毛剂%硫化钠溶液配制: 硫化钠 去离子水 麻醉剂%戊巴比妥钠溶液配制: 戊巴比妥钠 灭菌注射用水 ?避光保存 厶 \.、\, . 磷酸盐缓冲液配制: . 袋 磷酸盐缓冲液 去离子水 中南大学硕士学位论文 第二章材料与方法 ?保存 姗/溶液配制: . 去离子水 %多聚甲醛溶液固定剂配制: 多聚甲醛 . 磷酸盐缓冲液 置于通风柜中使用磁力搅拌器加热不超过?搅拌至乳白色悬液 / 溶液变清亮,自然冷却,过滤,?保存 保存液.%叠氮化钠配制: 叠氮化钠 . . 磷酸盐缓冲液 摄氏度保存 %乙醇溶液配制: 无水乙醇 . 去离子水%乙醇溶液配制: 无水乙醇 去离子水 %乙醇溶液配制: 无水乙醇 . 去离子水 、, 溶液配制去离子水 现配现用 抗原修复液配制: 一 第二章材料与方法 中南大学硕士学位论文 去离子水 现配现用 封闭液%马血清配制: 纯马血清 一 .% ? . 磷酸盐缓冲液 “ 现配现用 .%.缓冲液配置: 酸液体中浸泡小时,自中南大学硕士学位论文 第二章材料与方法 来水冲洗遍,再放入双蒸水浸泡漂洗干净后放置于?恒温箱中烘干,置 入清洁柜中备用。 所有实验过程中使用的载玻片均放置于浓硫酸液体中浸泡小时,自来水 冲洗遍,再入双蒸水浸泡、漂洗干净后于?恒温箱中烘干,再入明胶溶 液中浸泡,摄氏度恒温箱中烘干备用。 所有实验过程中使用的盖玻片均放置于浓硫酸中液体浸泡小时,自来水 冲洗遍,再入双蒸水浸泡、漂洗干净,%酒精浸泡大于小时,取出擦 干备用。 ..石蜡切片制作 过量%戊巴比妥钠/处死实验动物,快速打开胸腔,暴露心脏, 并延续打开腹腔暴露腹主动脉,用血管钳夹住腹主动脉,注射器针头刺入左 心室, 眼科剪在右心耳处剪破右心室,用加药器抽取?生理盐水约经心脏灌注, 然后用?%的多聚甲醛液约灌注固定后快速断头取脑。脑组织标本置入 %中性甲醛固定液中固定小时。随后室温下依次经过%乙醇分钟、% 乙醇.小时、%乙醇小时、%乙醇、各分钟、%乙醇/异丁醇 :配置分钟脱水。%异丁醇摄氏度过夜。之后入石蜡熔点 ?分钟、石蜡熔点?分钟浸蜡、包埋。修块后摄氏度保存。 切片时蜡块一?预冷分钟,用石蜡切片机对组织标本以海马区为中心进行 肛厚连续切片,放入?水浴箱内溶液中充分展开蜡片,捞片、贴片, ?烤干,放入?恒温箱烘烤过夜,而后切片?保存备用。 .. 染色 实验动物以%戊巴比妥钠过度麻醉处死后,快速断头取脑,脑组织置于一 ?冰箱中冷冻分钟,以视交叉平面为中心冠状面切取厚度为聊脑片张, 切片避光浸入%溶液,置入?恒温水浴箱孵育分钟,继以%多聚甲 醛缓冲液后固定小时后观察组织切片。经染色的脑组织厚片,正常脑组 织呈红色,梗死组织呈苍白色。 .. 染色 脱蜡水化:将石蜡切片放在?恒温箱中分钟脱去切片组织中的蜡,然 后依次放入二甲苯溶液、、及%、%、%、%乙醇分钟’ 中南大学硕士学位论文 第二章材料与方法 下行至双蒸水分钟。 苏木素染色:苏木素染色液中浸泡分钟,自来水冲洗,使组织发蓝,然 后入.%盐酸液分色数秒钟,在光学显微镜下见胞核蓝色,胞质和结缔组织 无色。 伊红染色:组织切片浸入蒸馏水中约分钟以上,入伊红染色分钟,然 后%乙醇分色,在光学显微镜下胞质及结缔组织被染成红色为宜。 分色后的组织切片过夜风干,然后经浸入%乙醇、各分钟进行 脱水,浸入二甲苯、各分钟透明,滴加水溶性封片剂,盖玻片覆 盖,普通指甲油点涂盖玻片边缘固定,自然晾干。 在光镜下观察组织标本的细胞形态。 ..尼氏体染色 脱蜡水化:将石蜡切片放在?恒温箱中分钟脱去组织中的蜡,然后 依次放入二甲苯溶液、、及%、%、%、%乙醇溶液分 钟。 浸入双蒸水分钟; 浸入尼氏体染色液分钟 双蒸水冲洗两遍各分钟’ 浸入%乙醇溶液分钟 浸入%乙醇溶液分钟分色,显微镜下观察尼氏体染色呈清晰蓝紫色后 即将切片取出; 分色后的切片风干过夜,再经过%乙醇、各分钟脱水,浸入二 甲苯液、各分钟透明,最后中性树胶封片。 光镜下观察细胞尼氏体 .. 原位杂交 石蜡切片于?恒温箱中分钟脱蜡,然后用二甲苯、、、% 乙醇、、%乙醇、依次各分钟,接着%乙醇、%乙醇各 分钟进行水化。 . 磷酸盐缓冲液漂洗分钟×次。 ? 中南大学硕士学位论文 第二章材料与方法 恒温?水浴箱内的枸橼酸抗原修复液中浸分钟进行抗原修复。稍冷却 一下后用. 磷酸盐缓冲液漂洗分钟×次。 . .浸泡?分钟。 蛋白酶肛‖?干液蛋白酶 室温下孵育分钟 .蚝, . 洗分钟×次 缓冲液分钟 . 杂交:在每张切片上滴加杂交液将.一 微摩尔稀释在缓冲液,覆以蜡膜,?小时. 洗片:室温下复温分钟后依次×、.×、.×缓冲液各 洗分钟; %/.瞄缓冲液孵育分钟. 滴加抗地高辛.抗血清碱性磷酸酶复合物以“缓冲液与% .% :稀释?孵育小时 ., 啊缓冲液洗分钟×次 显色:玻片上滴加显色剂..在缓冲液避光显色 显微镜下检测凋亡细胞核呈现紫蓝色反应 将玻片置于而缓冲液中一分钟以终止反应 .水溶性封片剂封片,显微镜下观察拍片统计结果。 .. 、的免疫组织化学染色法 石蜡切片常规脱蜡,取切片置于?恒温箱中分钟脱蜡,然后用二甲苯 溶液、、、%乙醇溶液、、%乙醇溶液、依次 各分钟,接着%乙醇溶液、%乙醇溶液各分钟进行水化。 .磷酸盐缓冲液漂洗分钟×次。 恒温?水浴箱内的枸橼酸抗原修复液中浸分钟进行抗原修复。稍冷却 后用.磷酸盐缓冲液漂洗分钟×次。 %室温孵育分钟以清除内源性过氧化物酶,然后用.磷酸 盐缓冲液漂洗分钟×次以洗去。 每张切片加入封闭液?,室温下封闭分钟。 每张切片分别滴加一抗溶液,配置比例分别为::, :,阴性对照每种检测指标均从、组中再随机选取张切片作 为阴性对照以. 磷酸盐缓冲液代替一抗溶液,置于?冰中南大学硕士学位论文 第二章材料 与方法 箱孵育夜。 复温后滴加.%.缓冲液冲洗分钟×次;.缓冲液冲 洗分钟×次。 每张切片滴加抗二抗“,室温小时。 %.缓冲液冲洗分钟×次;.磷酸盐缓冲液冲洗分 钟×次。 加入生物素/卵白素结合试剂即液提前分钟配好,室温下 放置小时。 .磷酸盐缓冲液冲洗分钟×次。 滴加显色液进行显色,光镜下观察染色程度染至棕黄色满意后滴加 . 磷酸盐缓冲液冲洗分钟×次,终止显色。 蒸馏水冲洗,浸入苏木素溶液中迅速复染后浸入自来水中浸泡分掉多余染 料。 晾干后依次入%乙醇溶液、%乙醇溶液、%乙醇溶液、、% 乙醇溶液、各分钟快速脱水。再入二甲苯溶液、中各 分钟进行透明。 中性树胶及盖玻片封片同前。 ..图像处理及值 所有切片在尼康荧光显微镜下进行观察并采集放大倍时图像, 、劁艮阳性表达为细胞内棕褐色或棕黄色、淡黄色颗粒。图像采用 .软件测量阳性细胞髓值,?值为阳性细胞累积光密度值 . 伊 以值与面积的比值乘以。髓值越 大,表示阳性反应强度越强;反之,阳性反应越弱。小染色切片采用 阳性细胞计数法。每组各只兔子,每只兔子每各指标选取张海马区切片 选取不重叠个视野,每组共个视野,免疫组化切片检测厨值,并取其 平均值为每组标本的值进行分析,切片计算阳性细胞数,并取其 平均阳性细胞数值进行分析。 ..统计学处理 本实验数据以工士表示,先对每个样本均数行正态性及方差齐性检验。两 侧颈动脉内径比较采用配对,检验,满足方差齐性用和锄. 检验,不满足方差齐性时采用非参数检验妇.甜 检验和 检验。两变量间相关性分析采用线性相关分析,所有统计分析及统计图表 中南大学硕士学位论文 第二章’材料与方法 均由.完成,相关系数用,.表示,.?,?,,.值为正表正相关,,.值 为负表负相关。取检验水准.,.表示差异有统计学意义。? 中南大学硕士学位论文 第三章结果 第三章结果 弟二早三石禾 .颈动脉狭窄模型制备结果 ..颈动脉狭窄模型手术结果 颈动脉狭窄造模后造成颈总动脉狭窄见图。实验过程中操作行开始时, 因麻醉过深死亡只动物,由备用实验动物补上;在狭窄模型制作后亦死亡一 只 动物原因不明,狭窄手术操作中及后期喂养、检查阶段无动物死亡,颈动脉 狭窄造模成功率.%。 ..颈总动脉内径测量结果 双侧颈总动脉在彩色超声所得内径值,经配对检验得出两侧颈总动脉内径 差别无明显统计学意义见表?,适于动物模型的制作。 表.正常雄性新西兰兔两侧颈总动脉内径检测结果士侧别 ;坷衄 .?. 左侧 .?. ?. . 右侧 造模后测量平均狭窄处血管内径约.毫米造成中度狭窄见图?,坌 扎线栓总跨度为.毫米左右见图?,右侧颈总动脉结扎处血流通畅未 附壁血栓及局部闭塞见图?,提示造模成功。 . .缺血再灌注模型结果 组缺血再灌注死亡动物由预备动物补足。分别于缺血小时后再灌注歹 同时间段麻醉苏醒后进行神经功能评分,从而判定缺血再灌注模型是否制备成 功。、、、组均无神经功能损伤症状体征。、组均有不同程度的神丝 功能缺失,根据评分细则缺血小时再灌注后观察可见明显的偏瘫体征,表现多 左侧前肢屈曲、不能伸直、右侧面部霍纳征,行走时向左侧倾倒、向外侧转圈 提颈时左侧前肢屈曲不能上抬等。评分为卜分,纳入实验进入下一阶段;分 分予以剔除,并随机补充。在此之前死亡的动物均为缺失值处理,从各组中夏 除。神经功能缺损评分总体趋势为:症状随脑缺血再灌注时间延长而有减轻趋势 中南大学硕士学位论文 第三章结果 评分下降 、驯。满足神经功能评分后纳入实验。 表?缺血再灌注模型制各结果 .组织形态学变化 ..缺血再灌注后病理学变化 、、、组脑组织大体观颜色形态正常,无脑组织肿胀;染色 可见、、、组光镜下神经元及组织结构无明显异常,神经细胞密集,细 胞排列整齐,胞浆丰富,色淡染,核居中,核仁明显,胶质细胞结构完整,排列 紧密,核仁清晰,胞浆无红染,细胞周围间隙致密无水肿,毛细血管形态正常, 结构完整;尼氏体染色、、、可见神经元胞质中满布着深蓝色呈颗粒状 或块状的尼氏体。、组兔脑组织大体上可见右侧脑组织颜色改变,缺血再灌 注小时脑沟仍明显,梗死灶颜色变浅;小时后脑组织肿胀,脑沟脑回不明显; 至小时后脑组织肿胀达高峰,并压迫对侧脑组织,可见坏死灶。染色和尼 氏体染色组小时镜下可见神经细胞变性,细胞周围轻度水肿,胞质内尼氏 体着色浅淡,并有不同程度的脱失。再灌注小时镜下可见缺血区皮层神经元数 目减少,排列紊乱,神经元颜色深染、核固缩或破碎,神经纤维走行不清或消失, 组织内可见软化灶,尼氏体颜色进一步变浅,海马区可见神经细胞水肿。再灌注 中南大学硕士学位论文 第三章结果 小时可见大量深染的神经元核固缩,胞浆嗜酸性增加,坏死中心区可见神经元 坏死,胞浆空泡样变性,坏死灶内可见胶质细胞增生,周围可见少量炎性细胞 浸 润,尼氏体消失。再灌注小时神经细胞水肿进一步扩大,缺血灶周围小胶质 细胞大量增生,炎性细胞浸润增多。再灌小时以后可见软化灶内及周围大量 胶质细胞增生形成斑痕,并可见炎性细胞浸润。 .. 染色 染色后、、、组兔脑组织由于线粒体琥珀酸脱氢酶正常而染色 呈红色,未见白色梗死灶组织;、组染色可见右侧兔脑损伤组织因缺乏 线粒体琥珀酸脱氢酶呈现大小不一致的苍白色梗死组织,而左侧脑组织呈红色无 苍白色组织,且观察到缺血灶的范围随再灌注时间的延长而扩大到直至整个右侧 大脑中动脉供血区。脑梗死体积大小与神经功能评分缺损的高低有相关性,即缺中南大学硕士学位论文 第三章结果 高见图。、组对应时间点组阳性细胞数水平高于组,组间差别有 统计学意义.。见表? .. 的表达 脂主要在大脑皮质的神经细胞和胶质细胞中表达,以胞膜及胞核表达明 显,阳性反应为细胞浆出现棕褐色颗粒。见图、组在组脑组织的 神经细胞中呈极弱阳性表达,偶可见阳性细胞。、组表达升高,与组 有统计学差异尸.。、组:缺血再灌注小时后?撇组免疫组化染色 阳性表达增多,随着缺血再灌注时间延长,呈升高趋势,小时达高值见图, 不同时间点的各组之间的阳性细胞尉值有统计学差异尸.。小时阳性 细胞数与组无明显差异性,小时、小时、小时、小时阳性细胞 值组与组统计学差异尸.。见表? .. 与相关性分析 组与进行相关性分析,呈正相关,组产.萨.; 组严.矿.,如图图及图所示。 ‘ 第三章结果 燮学堕主学位论奎 表?各组凋亡细胞数,、四值统计结果工士 注:与组比较:口表示尸.,口表示.;组与组间比较: 口表示.,?表示.:组本组前后时间点比较:?表示尸., 组与组对应时间点比较:?表示尸.。中南大学硕士学位论文 第三章结果 .附图 ..统计图 时一 图 组凋亡细胞动态变化 图 组明值变化 图 组纠值变化 黑.簟霄 图 组与相关分析 图 组与相关分析 中南人学硕士学位论文 第三章结果 ..颈动脉造模图 一了 将直径.注射嚣针头与颈总动脉平行放置 .无菌号尼龙线将注射器钟头与颈总动脉平行紧密结扎 .小心抽出注射器针头 图颈总动脉“针控线栓法狭窄术操作示意图瞳妇 ;一 嗡一 厂,蜃%; 图?示游离颈总动脉 图?示狭窄后颈总动脉 图“针控线栓”法颈总动脉狭窄手术前后示意图 图?示颈总动脉狭窄后内径 图?示颈总动脉狭窄跨度 图?示狭窄后动脉血流 图 狭窄后颈总动脉超声图中南大学硕士学位论文 第三章结果 .. 染色 图一 组 图? 组 图. 组 图 组 图. 组 图 染色图片中南人学硕士学位论文 .. 结果 组海马区木 组海马区:: 组海马区木 组海马区半 组海马区木 图 腿凋亡细胞第三章结果 中南大学硕学位论文 誊一 ;?;。 一; 。 ??。 ..;.. “ ’貔 《 ?,。 、、. 、 。 。 、.口 一 ?‘;三. 雹 ~’ 。’鹣 。,,?.? 多。。 敷。:?,,~二西汹 组海马区木 . 、 ? . 。, 、 。,? 奄 ’ 。。?、。:嘉 溺 蔓 釜 、。。, 二。 一,。”:。 ?,。:?。。二”? 蘧 己。 二?。 ?,?‘,曼 。:。?一 。 。 。一一 。, ,、勰 ’ . ,。鬟 毫 隧:己:,’乏琴竭 . 一. ’。 ‘’。‘: %‖。”? 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