成纤维细胞培养草案

成纤维细胞培养草案 选取原因:人体真皮组织的损伤导致瘢痕增生,它是生物对组织创伤的一种修复反应,但同时也引起一系列的后遗症。瘢痕的形成主要是成纤维细胞(fibroblast,FB)与细胞外基质胶原作用的结果。瘢痕疙瘩和硬皮病等真皮纤维化疾病以胶原为主的细胞外基质成分在真皮内过度积聚为特征,成纤维细胞是真皮纤维化的效应细胞。 目的:中药在瘢痕的治疗中已取得了很好的疗效。用槌果藤提取物对体外培养的人FB生长和胶原形成的影响,探讨其在瘢痕治疗中的作用。 一、取材:瘢痕组织、人正常皮肤。(限定为16,40岁、无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病、未系统应用皮质类固醇激素及其它可能影响结缔组织代谢药物的汉族人个体。根据目前公认临床特点确定瘢痕疙瘩临床诊断并经组织病理学检查证实。选择近1年内未接受局部外用药物、注射药物和放射治疗并处于活跃增生阶段的瘢痕疙瘩用于研究。) 二、药物处理:槌果藤甲醇、乙酸乙脂提取液置沸水浴中，挥尽 乙醇、乙酸乙脂浓缩至稠膏状。用适量二甲基亚砜 (DMSO，)将其溶解，并调整质量浓度 0为1g/ml，-20C保存备用。临用时用ph=7.4 PBS 稀释至设定浓度。 三、培养方法:1、组织块法原代培养: 所用DMEM培养液内含10%胎牛血清、,,,,干粉10,/ ,、,,,,,2 4, /,、碳酸氢钠1 5,/ ,、青霉素100, /,,、链霉素100μ,/ ,,。成纤维细胞培养:在手术无菌条件下，将手术切下的组织进行修剪，去除 3皮和皮下组织，用含有抗生素的PBS反复漂洗后，在超净工作台上将组织块剪成约1mm的小块，接种于培养瓶壁上，组织块间距0.3-0.5mm，轻轻的翻转，瓶底朝上，置入95%空 002气、5%CO，35C-37C的CO培养箱中留置培养2h，加入DMEM培养液慢慢覆盖附于瓶底2 上的组织小块，继续静置培养。以后每3-5天换液一次。当单层成纤维细胞相互融合出现密集的细胞集落或成纤维细胞基本上铺满瓶底时。弃去培养瓶中的培养基，加入D-Hank‘s液冲洗两遍，加入0.25%的胰蛋白酶溶液消化3-5min。显微镜下发现有细胞质回缩，细胞间隙增大现象时，中止消化。用吸管吸取培养瓶内的培养液，反复吹打瓶壁细胞，使细胞脱离瓶壁，形成细胞悬液。按1:3的比例分别接种在新的培养基瓶内传代。实验用第3,8代处于对数生长期的细胞. 2、胶元酶及胶元酶并用Dispase分离培养法: 用胶元酶或Dispase和胶元酶并用消化制备的成纤维细胞,以不同密度接种的方法和通过换液的方法可以除去未贴壁的表皮细胞和其他真皮细胞。以后每3d换液1次。1周左右铺满瓶底,传代培养。 四、成纤维细胞鉴定 1、应用组织块和酶消化法培养的成纤维细胞呈梭形,属纤维型细胞。经免疫组织化学染色,其95%以上细胞中间丝波蛋白呈棕色颗粒或棕色着染,即为阳性,而结蛋白抗体和第七 因子相关抗原均无棕色颗粒或棕色着染,为阴性。 2、细胞形态学观察及鉴定 将细胞进行常规苏木精、伊红染色后光镜观察。将细胞用丙酮室温固定30,,,,含0 25%双氧水的甲醇室温浸泡30,,,,滴加1?1000稀释的小鼠抗?型胶原一抗37?60,,,,0. 01, ,,,漂洗后滴加入1?400稀释的生物素化羊抗鼠二抗37?30,,,,0 01,,,,漂洗后,,,显色20,,,,光镜下进行观察和鉴定培养细胞为成纤维细胞及其纯度。 五、观察指标: 1、药物对,,生长的作用的影响:,,是胶原合成的主要细胞,其在线粒体的粗面内质网将氨基酸装配成胶原蛋白的前体多肽链,进入内质网腔内结合成3股螺旋的前胶原蛋白分子,由高尔基复合体运出细胞外转变为原胶原,再按一定极性排列并聚合成胶原原纤维,而后进一 4-1步聚合成胶原纤维。随着瘢痕的成熟,,,含量明显减少。 将细胞稀释至3×10?,,,取96孔板,每孔加入100μ,稀释好的细胞混悬液,37?,5%,,2温箱中过夜;去培养基,换用含槌果藤的培养基,并设定浓度,以不含槌果藤的培养基为空白对照组,每孔加100μ,,在37?,5% -1,,2恒箱中放置48,;在每孔中加10,,?,,的四甲基偶氮唑盐(,,,)10μ,,在同样条例下保温4,;取出后每孔加入100μ,的二甲亚砜,混匀放置1,;在96孔酶标仪上测定570,,的吸收值。 2、、药物对,,胶原合成的影响:羟脯氨酸为胶原蛋白的特征性氨基酸,其含量可表示胶原含量,测定增生性瘢痕中羟脯氨酸的含量明显增加,表示胶原含量增多。 调节细胞浓度为1 5-1,×10?,,培养接种于50,,培养液瓶内,48,后换用含槌果藤的培养液, 并设定浓度，以不含槌果藤参为空白对照组,再过48,后取细胞上清液各50μ,作胶原测定。用羟脯氨酸 -1比色法, ,上清液在6,,,?,,,,130?水解3,,在70?水浴中蒸干,溶于2,,蒸馏水, -1加0 05,,,?,氯胺,1,,摇匀,于20,25?室温中放置20,,,。加3 15,,,?,-1过氯酸1,,,摇匀,放置5,,,。加10%对二甲氨基苯甲醛1,,充分摇匀,60?水浴中放置20,,,,冷却后,在560,,比色。同时配制不同浓度的羟脯氨酸液,测得560,,处吸光度,通过对比即得细胞上清液中羟脯氨酸含量。 3、 四甲基偶氮唑盐 (MTT)比色试验测定中药提物对人皮肤FB生长活力的影响:用含 0.02%EDTA的0.25% 胰酶消化 80% 融合的单层培养的FB接种于96 孔培养板中，每孔 33*10 个细胞，每孔体积100ul。向 96 孔板中分别加入设定浓度的中药提取物PBS 溶液。 每个浓度 3孔，以不加药物的培养物为实验的对照组，同时每种药物的每个浓度均设无细胞 00对照孔。37C，5%CO条件下培养72h，每孔加入 MTT溶液(5mg/ml)10ul，37C 继续培2 养，4h(，弃去孔内养液。每孔加入 100ul 的 ,DMSO，振荡 10min，使结晶充分溶解。波长 490nm，在酶联免疫检测仪上以各自的对照孔调零，测定各孔吸光度值。实验结果以细胞增殖率表示:细胞增殖率=实验组A值 / 对照组 A值 *100% ，同时比较半数抑制浓度并观察细胞形态。 4、生长曲线法测定: 提取物对人皮肤 Fb生长状况的影响:取生长达 80% 融合的 32Fb，用含0.02%EDTA 的 0.25% 胰酶消化，将细胞接种于24孔培养板中，2.5*10/cm个细胞，其中12孔加入含提取物PBS并设定浓度。每天或每隔1天消化加药孔和对照孔各两孔细胞进行计数，计算均值。隔天给未计数细胞换液，并加药。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线。计算药物对 Fb的生长抑制率和细胞倍增时间。药物对 Fb 生长抑制率 =(对照组细胞数 -加药组细胞数)/ 对照组细胞数*100% ，细胞倍增时间 = 培养时间 (d)*Log2/(Log起始细胞数-Log培养后细胞数)。 5、药物对成纤维细胞调亡的影响:用成纤维细胞凋亡流式细胞仪行细胞凋亡分析,计算对照组和空白组细胞调亡的百分率。