人工虫草菌丝及其组分对肝纤维化大鼠胆汁酸代谢的影响及其机制研究

人工虫草菌丝及其组分对肝纤维化大鼠胆汁酸代谢的影响及其机制研究 [摘要] 胆汁酸是胆固醇在肝中降解的代谢产物，在肝内蓄积可引起肝脏疾病，可造成肝损伤以致肝纤维化。实验采用二甲基亚硝胺(DMN)大鼠肝纤维化模型，分为正常组、模型组和4个给药组。造模4周，给药组分别灌胃给药2周，模型组与正常组同时给予等量灭菌水。实验以血清胆汁酸为标识物，通过检测并观察肝功能指标和胆汁酸代谢的变化，辨识与肝损伤相关的胆汁酸类靶标，首次从胆汁酸代谢水平人工虫草菌丝及其组分对肝纤维化大鼠逆转作用并探讨其可能的机制。主要研究内容和结果如下:对牛磺氨酸结合型胆汁酸、甘氨酸结合型胆汁酸和游离型胆汁酸共17种内源性胆汁酸进行了定量，结合血清生化指标检测、病理组织切片检查对模型进行了肝损伤评价。造模后ALT，AST活性和TBil含量都显著性升高，Alb含量显著降低。病理组织切片检查HE染色显示模型组正常肝小叶结构破坏，肝细胞水肿，汇管区结缔组织增生，给药组不同程度病理变化减轻。虫草菌丝及其组分可能主要通过激活与HDCA，TCA，TCDCA，TLCA，TUDCA，UDCA，THDCA代谢有关的受体或阻断相关的信号通路而影响大鼠体内胆汁酸的代谢。 [关键词] 肝纤维化;虫草菌丝;胆汁酸代谢 [收稿日期] 2013-05-06 [基金项目] 上海市科委自然科学基金项目(12ZR1431700);上海市卫生局中医药科研基金项目(2012J007A);上海市教育委员预算内科研项目(2010JW25);上海市教育委员会E研究院建设项目(E03008) [通信作者] 李风华，副研究员，硕士生导师，从事中药及其复方有效物质基础的研究，Tel:(021)51322391，E-mail:lfh@hotmail.com [作者简介] 张幸，助理研究员，Tel:(021)51322379，E-mail:celiazx87@126.com 胆汁酸是一类主要在肝脏中合成的代谢小分子物质，其功能主要有清除胆固醇、转运脂质物质、形成胆汁流、分泌胆汁磷脂以及负反馈调节胆汁酸合成等。在正常生理状况下主要局限于肠肝循环，当肝细胞的某些障碍使信号传导途径、细胞骨架、紧密连接蛋白、细胞内运输囊泡等受损时，膜转运蛋白将发生调节与表达缺陷，肠肝循环受到干扰，导致胆汁酸在肝脏中淤积[1]。胆汁酸在肝内蓄积可引起肝脏疾病，可造成肝损伤以致肝纤维化。作者在以往的研究发现虫草菌丝及其组分有显著的抗肝纤维化作用[2-3]，虫草菌丝的有效成分虫草多糖能调节胆汁酸的代谢[4]。超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)具有很高的灵敏度和分辨率，适合针对性的分析一类或几类预定的代谢物以阐明特定生物状态下某些代谢途径的变化，可用于疾病发生机制的研究[5-6]。本实验主要通过研究二甲基亚硝胺(DMN)肝纤维化大鼠体内17种胆汁酸代谢的变化及肝功能指标的改变，利用主成分分析寻找虫草菌丝及其组分影响DMN肝纤维化大鼠体内酸代谢的生物标志物，探讨虫草菌丝及其组分干预肝纤维化的作用机制和作用靶点。 1 材料 1.1 动物 Wistar雄性大鼠53只，体重170,190 g，由中国科学院上海实验动物中心提供，动物合格证号2008001613832，清洁级，上海中医药大学动物中心清洁级动物房饲养、造模与观察，室温23,25 ?，相对湿度50%,70%，自由进水及饮食。 1.2 药物与试剂 发酵虫草菌丝(Cordyceps sinensis BerK.Sacc，CsB)购自江西国药责任有限公司;虫草菌丝组分由中国科学院上海药物研究所提供。二甲基亚硝胺(DMN，批号KWM6890，Wako公司)。肝功能检测试剂盒包括:丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransamine，ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、白蛋白(albumin，Alb)均购自南京建成生物工程研究所(批号20111105)。胆酸(cholic acid，CA)、去氧胆酸(deoxycholic acid，DCA)、鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)、石胆酸 (lithocholic acid，LCA)、熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)、猪去氧胆酸(hyodeoxycholic acid，HDCA)、甘氨胆酸(glycocholic acid，GCA)、牛磺胆酸(taurocholic acid，TCA)、甘氨去氧胆酸(glycodeoxycholic acid，GDCA)、牛磺去氧胆酸(taurodeoxycholic acid，TDCA)、甘氨鹅去氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid，GCDCA)、牛磺鹅去氧胆酸(taurochenodeoxycholic acid，TCDCA)、甘氨熊去氧胆酸(glycoursodeoxycholic acid，GUDCA)、牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)、牛磺猪去氧胆酸(taurohyodeoxycholic acid，THDCA)、甘氨石胆酸(glycolithocholic acid，GLCA)和牛磺石胆酸(taurolithocholic acid，TLCA)均购于Sigma-Aldrich公司。 1.3 仪器 ASP300自动脱水机(LEICA公司);LEICA EG1160冷冻包埋机(LEICA公司);RM 2235切片机(LEICA公司);Leica SCN 400玻片扫描仪(徕卡仪器有限公司);2800 UV/VIS紫外-可见分光光度计[尤尼柯(上海)仪器有限公司];Waters Acquity UPLC 串联质谱仪(ZQ 2000，Water公司);MassLynx 4.1 工作站;QuanLynx计算软件。 2 方法 2.1 模型制备 大鼠DMN肝纤维化模型的制备参考Ala-Kokko[7]方法，生理盐水稀释DMN为0.5% (1?199生理盐水)浓度，以2 mL?kg-1剂量处理大鼠，腹腔注射，每周连续3 d，每天1次，共4周。 2.2 分组与给药 采用完全随机化的分组方法，将53只Wistar大鼠随机分成正常组和模型组。模型组用DMN造模2周，正常组自由进水及饮食。2周后，将模型组大鼠随机分成模型对照组、虫草菌丝1号组分治疗组、虫草菌丝2号组分治疗组、虫草菌丝3号组分治疗组及虫草菌丝4号组分治疗组。模型对照组和虫草菌丝组分治疗组继续用DMN造模2周，在造模的同时，治疗组分别灌胃虫草菌丝有效组分10 mL?kg-1(相当于成人临床剂量10倍)，模型对照组灌胃等量的蒸馏水。用药治疗2周后处死鼠取材。 2.3 样品的采集和处理 用药2周结束后，将大鼠用2%戊巴比妥钠以2 mL?kg-1剂量腹腔注射麻醉，仰卧位固定，打开腹腔，观察大体情况，肝脾的色、质、形态情况。经下腔静脉采血，留取肝组织-70 ?保存备用。 2.4 血清肝功能检测 按试剂盒书测定血清ALT，AST，赖氏法均采用卫生部上海生物制品研究所试剂盒说明书测定。 2.5 肝组织病理学观察 肝组织常规脱水、包埋、切片(4 μm厚)，作HE染色，检测指标:光镜观察肝组织病理学变化并拍照、扫描。 2.6 UPLC-MS法测定大鼠血清中17种胆汁酸的含量[8-14] 曲线的制备:精密称定相应的胆汁酸对照品， 用甲醇溶解制成质量浓度约2 g?L-1的溶液，分别吸取各胆汁酸对照品溶液50 μL制成100 mg?L-1的混合对照品溶液。用甲醇将浓度为100 mg?L-1的混合对照品溶液依次稀释成质量浓度分别为10，5，2，1，0.5，0.2 mg?L-1的溶液，用于绘制标准曲线。 样品处理方法:取100 μL血清，加300 μL甲醇，漩涡振荡1 min，2万×g离心10 min。取300 μL上清液，用35 ? N2吹干，用100 μL流动相复溶(A-B 55?45)，漩涡振荡1 min，2万×g离心10 min，取上清液2 μL进样分析。 色谱条件:ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 (2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱温45 ?;流动相A:甲醇，流动相B:含5 mmol?L-1醋酸铵和0.1%甲酸溶液。梯度洗脱程序为55%A (0,1.0 min)，55%,62%A (1.0,2.6 min)和62%,80%A (2.6,11.4 min)，进样量2 μL，流速0.3 mL?min-1。 质谱条件:电喷雾离子源，负离子模式扫描，选择性离子监测模式(SIM)检测，毛细管电压3.0 kV，锥孔电压55 V，离子源温度120 ?，溶剂化温度300 ?，去溶剂化气流700 L?h-1，锥孔气流50 L?h-1。 2.7 统计学方法 不同的资料采用不同的统计方法。计量资料采用?s表示，当资料满足正态分布且方差齐性时，采用单因素方差分析(One-factor ANOVA)的单向分类的方差分析(One-way classification ANOVA)，多个样本均数间的多重比较采用最小显著差异(least significant difference， LSD) t检验或SNK(Student-Newman-Keuls)检验;当资料不满足正态分布或/和方差不齐时采用Tamhane′s T2或Dunnett′s T3检验;等级分组资料采用Ridit分析;胆汁酸含量计算数据用MassLynx 4.1 软件采集和输出。所有数据统计、PCA分析、相关分析及判别分析均采用SPSS 11.5统计软件进行。 3 结果 3.1 肝组织形态学变化 肝组织HE染色显示，正常组大鼠肝组织完好，肝小叶结构正常，肝细胞索由中央静脉向四周呈放射状排列，肝细胞完整，胞浆着色均匀，细胞核清晰，中央静脉及汇管区清晰可见;模型组出现较广泛的肝细胞肿胀，伴随大量的炎细胞浸润，汇管区结缔组织有不同程度增生，肝小叶结构紊乱。虫草菌丝组分各治疗组上述病理变化较模型组显著减轻(图1)。 A.正常组;B.模型组;C.1号治疗组;D.2号治疗组;E.3号治疗组;F.4号治疗组。 图1 肝组织HE染色(×200) Fig.1 HE staining in hepatic tissue(×200) 3.2 大鼠血清肝功能变化 与正常大鼠比较，模型组大鼠血清ALT，AST，TBil均较正常组显著升高，ALT，AST，TBil(P 表1 各组药物对DMN肝纤维化大鼠血清肝功能的影响(?s) Table 1 Effects of cordyceps polysaccharide on serum ALT， AST， Alb and TBil in rats ?s) simulated by DMN( 存在差异(P [3] 李风华，刘平，熊卫国，等.虫草多糖逆转DMN诱导大鼠肝纤维化的作用及机制研究[J].中国中药杂志，2006，31(23):1968. [4] 刘同亭，王要军，刘世仁，等.复方冬虫夏草多糖脂质体口服液治疗肝炎后肝硬化的疗效[J].实用医药杂志，2005，22(4):309. [5] Plumb R S， Rainville P D， Potts W B 3rd，et al.Application of ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry to profiling rat and dog bile[J].J Proteome Res，2009，8(5):2495. [6] 杜振华，刘树业.乙肝病毒性肝硬化的血清代谢轮廓分析[D].天津:天津医科大学，2011. [7] Ala-Kokko L， Pihlajaniemi T， Myers J C， et al.Gene expression of type I， III and IV collagens in hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine in the rat[J].Biochem J，1987，244(1): 75. [8] Beger R D， Sun J C， Schnackenberg L K.Metabolomics approaches for discovering biomarkers of drug-induced hepatotoxicity and nephrotoxicity[J].Toxicol Appl Pharm， 2010， 243(2): 154. [9] Hagio M， Matsumoto M， Fukushima M， et al.Improved analysis of bile acids in tissues and intestinal contents of rats using LC/ESI-MS[J].J Lipid Res， 2009， 50(1): 173. [10] Iwaki T， Ishizaki K， Kinoshita S， et al.Protective effects of ursodeoxycholic acid on chenodeoxycholic acid-induced liver injury in hamsters[J].Word J Gastroenterol， 2007， 13(37): 5003. [11] Perwaiz S， Tuchweber B， Mignault D， et al.Determination of bile acids in biological fluids by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry[J].J Lipid Res， 2001， 42(1): 114. [12] Theodoridis G， Gika H G， Wilson I D.LC-MS-based methodology for global metabolite profiling in metabonomics/metabolomics[J].Trends Anal Chem， 2008， 27: 251. [13] 常雁， 再帕尔?阿不力孜， 王慕邹.串联质谱新技术及其在药物代谢研究中的 应用进展[J].药学学报， 2000， 35: 73. [14] 徐英，陈崇崇，杨莉，等.基于胆汁酸代谢网络分析中药黄药子的肝毒性[J].药学 学报，2011，46(1):39. [15] George J， Rao K R， Stern R， et al.Dimethylnitrosamine-induced liver injury in rats: the early deposition of collagen[J].Toxicology， 2001，156(2/3):129. [16] 田刚，甄乾娜，班艳娜，等.血清胆汁酸代谢轮廓分析在妊娠肝内胆汁淤积症诊 断中的应用[J].重庆医科大学学报，2011，36(5):586. [17] 张久聪， 聂青和.胆汁酸代谢及相关进展[J].胃肠病学和肝病学杂志， 2008， 17 (11): 953. Study on effect of artificial CsB and its components on bile acid metabolism in rats with liver fibrosis and its mechanism ZHANG Xing1， LI Feng-hua1*， LIU Ping2， LIU Jia2， WANG Shuang1 (1.Technical Experiment Center， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China; 2.Key Laboratory of Hepatic and Renal Diseases under Ministry of Education， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China) [Abstract] Bile acid is a type of metabolite degraded from cholesterol in liver.Its accumulation in liver could cause liver diseases， liver damage and liver fibrosis.In this experiment， dimethyl nitrosamine (DMN) liver fibrosis was established in rats.The rats were delivered into the normal group， the model group and four treated groups.After the four-week modeling， the treated groups were orally administered with drugs for 2 weeks， whereas the model and normal groups were given equal amount of sterile water at the same time.In the experiment， serum bile acid was taken the as marker， and liver function indexes and changes in bile acid metabolism were detected and observed to identify liver damage-related bile acid targets.It was the first time to evaluate the reverse effect of artificial CsB and its components on liver fibrosis in rats with bile acid metabolic level， and discuss its potential mechanism.The main study contents and results are as follows: a quantitative analysis was made on totally 17 endogenous bile acids， including taurocholic acid conjugated bile acid， glycine conjugated bile acid and free bile acid， and a liver damage evaluation was made for the model according to the detection of serum biochemical indexes and the pathological biopsy.After modeling， ALT， AST activity and TBil content significantly increased， whereas Alb significantly decreased.According to the pathological biopsy HE staining， the model group showed damage in normal hepatic lobule structure， liver cell edema and connective tissue proliferation in portal area; The treated groups showed mitigation in pathological changes to varying degrees.Cordyceps sinensis and its components may impact the bile acid metabolism in rats by activating HDCA， TCA， TCDCA， TLCA， TUDCA， UDCA， THDCA metabolim-related receptors or blocking relevant signaling pathway. [Key words] liver fibrosis; CsB; bile acid metabolism doi:10.4268/cjcmm20132229 [责任编辑 张宁宁]