白花蛇舌草研究论文

白花蛇舌草研究论文 - 目录 中文摘要 .................................................................. 2 英文摘要 .................................................................. 3 第一章 绪论 ............................................................... 4 1.1 白花蛇舌草的研究概况 .................................................. 4 1.1.1 白花蛇舌草的化学成分 ............................................ 4 1.1.2 白花蛇舌草的药理作用 ............................................ 4 1.1.3 白花蛇舌草的临床应用 ............................................ 6 1.2 中草药中蒽醌类化合物的研究现状 ........................................ 7 1.2.1 蒽醌化合物在中草药中的分布 ...................................... 7 1.2.2 蒽醌化合物的性质 ................................................ 7 1.2.3 天然蒽醌化合物的生物活性 ........................................ 8 1.3 本论文的研究思路 ...................................................... 9 第二章HPLC法测定不同产地药材中2种蒽醌化合物的含量 ...................... 10 2.1 仪器与试剂 ........................................................... 10 2.2 药材来源 ............................................................. 10 2.3 方法与结果 ........................................ 1错误～未定义书签。1 第三章GC法测定白花蛇舌草药材中2种蒽醌的含量 ............................ 15 3.1 仪器和试剂 ......................................... 错误～未定义书签。15 3.2 方法与结果 ......................................... 错误～未定义书签。15 第四章 讨论 .............................................................. 19 参考文献 ................................................................. 24 致谢 ..................................................................... 26 . - 摘要 白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草的全草，具有清热解毒、利湿消肿、活血化瘀之功效，现代多用于治疗恶性肿瘤、阑尾炎、黄疸型肝炎、肠炎、肺炎等疾病。随着现代药理及活性成分的研究，白花蛇舌草日益引起国内外药学工作者的关注。 建立了HPLC法同时测定12个不同产地药材中2种蒽醌的含量。采用Diamonsil -1 C色谱柱，以甲醇-水(62:38，v/v)为流动相，流速1.0 mL?min，检测波长267 nm，18 柱温为室温。在单因素考察确定用乙醇加热回流进行提取的基础上，采用正交试验优选样品提取方法，确定了最佳提取条件。 建立了GC法同时测定不同产地药材中2种蒽醌的含量。采用HP-5弹性石英毛细管柱( 30 m× 0.32 mm× 0.25 μm)，进样口温度为250 ?，检测器温度260 ?，柱温228 ?，分流比为20?1，载气为氮气，流量为50 mL/min。 对比两种方法表明:两种方法均准确可靠，重复性好，所测得的含量结果一致。与HPLC法相比，采用GC法时，样品处理方法更简单，而且分析时间短、分析效率更好。 关键词:白花蛇舌草，2-甲基-3-羟基蒽醌，2-甲基-3-羟基-4-甲氧基蒽醌 . - Abstract Hedyotis diffusa Willd. belongs to rubiaceous family, possessing activities that clear away the heat-evil, expel superficical evils, activate blood circulation to dissipate blood stasis, promote urination and clear intumesce. Now it is widely used to cure maliglant tumor, appendicitis, icteric hepatitis, enteritis, pneumonia and so on. With the development of modern pharmacology and activity study, Hedyotis diffusa Willd. increasingly attracts the attention of pharmaceutical researchers all over the world. In this paper, four kinds of components including two kinds of anthraquinones, scopoletine and ursolic acid were isolated from Hedyotis diffusa Willd. and identified by physicochemical property and spectroscopy analysis; HPLC and GC methods were developed and compared for simultaneously quantitative determination of two kinds of athraquinones in raw materials of Hedyotis diffusa Willd. from different sources; HPLC-UV method has been developed for the determination of 2-methyl-3-hydroxyanthraquinone in rat plasma and applied to a pharmacokinetic study in rats after intraperitoneal injection of 2-methyl-3-hydroxyanthraquinone. After the optimization of extraction condition using orthogonal experimental design based on extracting under reflux with alcohol, an HPLC method was developed. The analytical column was Diamonsil Cwith MeOH-HO(62:38, v/v) as mobile phase, at 18 2 -1 flow rate of 1.0 mL?min, peaks were detected at 267 nm, column temperature was room temperature. A GC method was developed for the determination of two kinds of anthraquinones in Hedyotis diffusa from different sources for the first time. The separation was performed on the HP-5 elastic crystal Capillary column( 30 m× 0.32 mm× 0.25 μm) equipped with FID detector at split of 20?1 and the column temperature was maintained at 228.?The carrier gas is Nitrogen and flow rate is 50 mL/min. The methods are accurate, reproducible for determination of two kinds of anthraquinones in Hedyotis diffusa Willd. Compared to HPLC, the sample treatment is easier, the analysis time is decreased in GC method. Keyword: Hedyotis diffusa Willd.， 2-methyl-3-hydroxy-4-methoxyanthraquinone, 2-methyl-3-hydroxyanthraquinone, pharmacokinetics . - 第一章 绪论 恶性肿瘤是目前危害人民生命和健康的严重疾病之一，而化学合成的抗癌药会对人体正常细胞产生毒副作用，因此从中药中筛选有效的抗肿瘤新药前景广阔，也是目前国内外研究的热点。白花蛇舌草是我国传统中药，临床上广泛用于多种癌症的治疗，但由于成分复杂，其抗肿瘤的活性成分尚未确定。其中所含有的蒽醌类化合物，是许多中草药的有效成分，但关于白花蛇舌草中蒽醌类化合物深入研究的文献却极少。本文对白花蛇舌草中的2种蒽醌化合物进行了一系列研究，为阐明白花蛇舌草抗肿瘤有效成分，提供一定的科学依据。 1.1 白花蛇舌草的研究概况 白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd. [Oldenlandia difusa (Willd.) Roxb.]的干燥全草，为一年生草本植物。主产于我国长江以南浙江、江西、福建、湖北、广东及西南等地。白花蛇舌草性寒、味酸，归胃、大肠、小肠经，具有清热解毒、利湿消肿、活血止痛之功效，可用于毒蛇咬伤、臃肿疔疮等症，现代多用于恶性肿瘤、阑尾炎、黄疸型肝炎、肠炎、肺炎等疾病的治疗。 1.1.1 白花蛇舌草的化学成分 迄今为止已经从白花蛇舌草中分离得到蒽醌类、环烯醚萜苷类、三萜类、黄酮 [1]类、甾醇类、香豆素类、烷烃类、挥发油、多糖类;周建波对白花蛇舌草所含无机元素也进行了分析，结果表明本品含有Fe，Ti等元素。 1.1.2 白花蛇舌草的药理作用 抑菌活性 蒋丹等人以大肠埃氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌为供试菌株，对22种中草药的抑菌活性进行了筛选，结果发现白花蛇舌草对三种菌种都表现出较强的抑菌活[2]性。 对免疫功能的影响 白花蛇舌草可使炎症区淋巴细胞增多，并可增强中性白细胞吞噬功能，其水提物能明显促进刀豆蛋白A和细菌脂多糖对小鼠脾细胞的增殖反应，药物本身对脾细胞具有丝分裂原样作用，能明显增加小鼠脾细胞对羊红细胞的特异抗体分泌细胞数，. - 增强异型小鼠脾细胞诱导的迟发型超敏反应及细胞毒性T淋巴细胞的杀伤功能，具有增强机体免疫功能的作用。 较高剂量的白花蛇舌草(相当于生药300mg/鼠)可显著减少初次免疫小鼠脾细胞中特异玫瑰花结增生数，反映出本品对特异性免疫反应前期的抑制作用，但较低剂量(60mg/鼠)时得到的结果正好相反。故可认为本品对免疫功能的影响与剂量有关，在较高剂量下本品可抑制小鼠脾抗原结合细胞数，在较低剂量下则可增强体 [3]液免疫和细胞免疫。方晓立等认为以上现象与本品所含的特意结构的免疫多糖有关。 抗化学诱变作用 白花蛇舌草具有明显的抗诱变活性，对黄曲霉素B(AFB)及苯并芘(BaP)11 引起的沙门菌属TA的染色体突变回复有明显抑制作用，并能抑制AFB与DNA的1001结合，抑制AFB及BaP的生物转化，其中对AFB代谢的抑制途径是通过抑制细胞色1 1 素P相关酶(aminopyrine N-demetylase,APDN)的活性，抑制CY B介导的AFB4503 1生物转化，对BaP的代谢抑制途径是通过抑制细胞色素的PIAL相关酶450(ethoxyresorufin O-deethylase, EROD)活性而产生的，且白花蛇舌草的抗诱变作用有一定的两效关系。 抗肿瘤作用 以上白花蛇舌草的促进免疫作用及抗诱变作用，提示其具有抗肿瘤活性。有文 [3]献报道白花蛇舌草在体外(相当于生药6g/mL)对急性淋巴细胞型、粒细胞型、单核细胞型以及慢性粒细胞型的肿瘤细胞有较强抑制作用。谭宁化等发现白花蛇舌草的乙醇提取物对结肠癌、黑素瘤和乳腺癌细胞株有活性，特别是对乳腺癌细胞株活 [4]性更强。赵浩如等研究了白花蛇舌草不同提取工艺对抗肿瘤活性的影响，结果发 [5]现白花蛇舌草的脂溶性部位和多糖对S-180肿瘤细胞具有显著的抑制作用。LiRui等检测了白花蛇舌草的水溶性提取物的抗肿瘤活性，发现其水溶性提取物能显著抑 [6]制小鼠移植性S-180实体瘤的生长。另有试验显示白花蛇舌草对恶性植入皮下肿瘤 [7][10具抗癌活性且对全身照射后放射性诱导的造血器官损伤有保护作用。Ferguson等证明了对香豆酸具备抗氧化活性、抗DNA和染色体断裂的活性，它能抑制同致癌作用相关酶的活性，包括降低CYP450 1A酶的活性，抑制COX-2酶的表达。同时在对. - 比试验中证明了对香豆酸的抗癌活性等同于或者优于抗癌药物姜黄。 抗炎作用 通过临床验证白花蛇舌草能治疗阑尾炎、盆腔炎，还能提高小鼠肝脾网状内皮 [9]系统吞噬功能。姚育修进一步通过动物实验阐明，本品的抗炎功能是外因通过内因，动员机体的防御机制，刺激网状内皮系统增生，加强吞噬细胞的功能，促进抗体形成，同时刺激嗜银物质倾向致密化改变，从而达到消炎的目的。 保肝利胆作用 白花蛇舌草保肝方面有显著作用，能显著抑制四氯化碳引起的谷丙转氨酶升高，加速肝组织损伤的恢复。 其它药理作用 大剂量的白花蛇舌草煎剂对兔离体肠呈现显著抑制，并可对抗乙酰胆碱或肾上腺素引起的肠肌兴奋或抑制。小鼠腹腔注射本品0.46 g，能明显降低胸腺重量，提示有增强肾上腺皮质功能，该皮质激素样功能与白花蛇舌草中含有类固醇成分相吻合。熊果酸有安定、降温作用，给小鼠腹腔注射白花蛇舌草溶液可呈现镇痛、催眠、镇静等作用。β-谷甾醇有镇咳、祛痰作用，并有降低胆固醇作用。 1.1.3 白花蛇舌草的临床应用 治疗癌症 [12]白花蛇舌草复方治疗晚期肺癌30例，呼吸系统症状完全缓减率达71.6%;多篇 [11-13]报道表明白花蛇舌草对消化系统癌症，如:中晚期食道癌，晚期胃癌和直肠癌 [14][15]等，均有治疗作用;对慢性再生障碍性贫血和慢性粒细胞白血病的有效率达 [16-19]89%以上;另有研究表明，白花蛇舌草对恶性淋巴瘤、鼻咽癌、胰腺癌肝转移和宫颈癌等均有治疗作用。 治疗消化道疾病 [20]牛金仓等采用白花蛇舌草、沙参等治疗萎缩性胃炎56例，总有效率96.5%。杨 [21][24]承第等用蛇舌草延胡汤治疗慢性浅表性胃炎82例，有效率达96.3%。孙雪梅采用以白花蛇舌草为主的中药复方治疗糜烂性胃炎20例，有效率达80%以上。 治疗肝脏疾病 [25]夏正飞采用清热利湿汤(白花蛇舌草、垂盆草等)治疗急性病毒性肝炎45例，. - [44]总有效率100%。莫激勤用自拟蛇参虎溪汤(白花蛇舌草、虎杖、溪黄草等)治疗 [25]乙型肝炎68例，总有效率达83.8%。邱根全自拟乙肝饮(板蓝根、茵陈、白花蛇 [28]舌草、贯众等)治疗慢性乙肝50例，总有效率92.0%。程为平等用白花蛇舌草中药复方治疗丙型病毒性肝炎13例，其中8例HCV抗原转为阴性。 治疗肾脏疾病 [27-30]研究表明白花蛇舌草中药复方治疗急性肾炎44例，治愈率88.63%;慢性肾炎47例，有效率91.5%;激素不敏感或激素依赖型难治性肾病综合症28例，缓减率71.4%;小儿急性肾炎25例，治愈率80%以上。 治疗妇科疾病 [31,32]曾有用白花蛇舌草复方治疗慢性盆腔炎，有效率大于97%;治疗乳房囊性 [31]增生病，总有效率85%。 治疗性病 [34]宋文英报道马齿苋合剂加减(马齿苋、紫草、白花蛇舌草、毛冬草等)降低 [35]尖锐湿疣的复发率，且与干扰素功效相近。何霖强报道，用白花蛇舌草治疗慢性 [36]淋病有效。秦雪峰以白花蛇舌草中药复方治疗急性淋病120例，有效率95.9%。李 [37]爱梅用白花蛇舌草复方洗剂治疗顽固性外阴湿疹62例，100%有效。 治疗其它疾病 白花蛇舌草配伍其它中草药还可治疗腮腺炎、带状疱疹后遗症、声带白斑病、寻常痤疮等疾病。 1.2 中草药中蒽醌类化合物的研究现状 1.2.1 蒽醌化合物在中草药中的分布 醌类化合物是许多中草药中含有的有效成分，包括苯醌(benzxxtuinone)、萘醌(naph-thoquinone)、菲醌(phenanthraquinone)和蒽醌(anthraquinone)(其中蒽醌及其衍生物的种类、含量最多，在自然界植物中分布广，如百合科的芦荟，豆科的决明子、番泻叶，茜草科的茜草、鼠李，蓼科的大黄、虎仗、何首乌、拳参中常含有蒽醌类成分。除高等植物以外，蒽醌化合物还存在于低等植物地衣和菌类的代谢产物中。 1.2.2 蒽醌化合物的性质 物理性质 天然中草药中蒽醌化合物母核上一般都有酚羟基助色基团，因此绝. - 大多数蒽醌化合物都是有色晶体，取代的酚羟基越多，颜色越深，有黄、橙、棕红色以至紫红色等。游离的蒽醌衍生物极性较小，一般溶于乙醇、乙醚、苯、氯仿等有机溶剂，不溶于水;而与糖结合成甙后极性显著增大，易溶于甲醇、乙醇、热水中，在冷水中溶解度大大降低，几乎不溶于苯、乙醚、氯仿等极性较小的有机溶剂[45]中。 酸性 蒽醌化合物多带有酚羟基，故具有一定的酸性，可溶于苛性碱溶液中而显红色或紫色，加酸酸化后被游离又可重新沉淀析出(蒽醌化合物的酸性强度与其分子中酚羟基的数目及结合的位置有一定关系(一般带有α-位酚性羟基酸性较弱，不溶于碳酸钠水溶液，只能用氢氧化钠水溶液才能溶解，β-位酚羟基的化合物酸性较强，能溶解于碳酸钠溶液中，也能与重氮甲烷反应生成相应的甲醚，如果分子中带有多个β-位酚羟基，则酸性更强，甚至可溶于碳酸氢钠中(常常利用这种酸性强度不等的性质自中草药中提取并分离混合羟基蒽醌成分。 颜色反应 蒽醌化合物具有一些重要的颜色反应，可以作为中草药中这类成分的检识用。 (1)Bornträger反应 中药中所含的蒽醌衍生物多带有酚羟基，羟基蒽醌的衍生物包括蒽醌甙，遇碱显橙、红、红紫、青紫和蓝色，此反应是检识中草药中羟基蒽醌类成分存在的最常用方法之一，但蒽醌的还原衍生物如蒽酚、蒽酮、二蒽酮类化合物则需要氧化形成羟基蒽醌类化合物以后才能显色。 (2)Feigl反应 在碱性条件下，蒽醌化合物经加热能迅速与醛类及邻二硝基苯反应生成紫色化合物。 1.2.3 天然蒽醌化合物的生物活性 泻下作用 一些泻下性中草药的有效成分是蒽苷类，游离的蒽酚衍生物较其相应的苷类泻下作用为弱，蒽苷中以番泻苷类的作用最强。 抗菌作用 蒽醌类化合物大多具有一定的抗菌活性，苷元的活性一般比苷类强。 抗肿瘤作用 有些蒽醌类化合物如对小鼠黑色素瘤、大鼠乳癌及艾氏腹水癌有明显的抑制作用;对cAMP磷二酯酶有显著的抑制作用;对异常高的免疫反应有强 [41]烈的抑制作用。天然蒽醌化合物的抗肿瘤作用机制包括诱导肿瘤细胞凋亡，逆转肿瘤细胞多药抗药性作用，酶抑制剂，影响肿瘤细胞的增殖及细胞周期，抑制肿瘤. - [64]细胞的代谢，对肿瘤细胞的杀伤作用，抗诱变作用等。 其它作用 除上述生物活性外，蒽醌类化合物还具有广泛的其它方面的生物活 [45]性。例如金丝桃素具有中枢神经的抑制作用和补效等。 1.3 本论文的研究思路 综上所述，本研究采用的基本研究思路如下: 建立HPLC和GC法测定白花蛇舌草药材中蒽醌化合物的含量，对不同产地药材中蒽醌化合物的含量进行测定，并对两种分析方法进行分析比较。 . - 白花蛇舌草中蒽醌类化合物含量测定方法研究 蒽醌类化合物是许多中草药中均含有的活性成分，有泻下、抗菌、降压降脂、 ,47,抗癌、抗病毒、凝血等功效，应用前景非常广阔。目前临床上常用的抗肿瘤药物阿霉素及米托蒽醌的基本母核亦是蒽醌结构,提示具有蒽醌类母核结构的化合物可 ,42,能具有抗肿瘤活性。白花蛇舌草中亦含有多种蒽醌类化合物。本章首次建立了HPLC法和GC法同时测定了不同产地白花蛇舌草药材中两种蒽醌类化合物—2-甲基-3-羟基-4-甲氧基蒽醌(?)和2-甲基-3-羟基蒽醌(?)的含量。并对两种测定方法及结果进行了分析比较。 第二章 HPLC法测定不同产地药材中2种蒽醌化合物的含量 2.1 仪器与试剂 (1)仪器 LC-10A型液相色谱仪 日本岛津公司 SPD-10A型紫外检测器 日本岛津公司 ANASTAR色谱工作站 天津奥特赛恩斯仪器有限公司 METTLER TOLEDO 电子天平 梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司 (2)试剂 2-甲基-3-羟基蒽醌(对照品) 自制(纯度 98.2%) 2-甲基-3-羟基-4-甲氧基蒽醌(对照品) 自制(纯度 96.3%) 重蒸水 自制 无水乙醇(分析纯) 天津百世化工有限公司 甲醇(色谱纯) 山东禹王化学试剂厂 2.2 药材来源 本文共收集了12个产地的白花蛇舌草药材(采收期为8~10月)，经沈阳药科大学孙启时教授鉴定为白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd. [Oldenlandia diffusa (Willd.) Roxb.]，见表3-1。 . - Tab.3-1 The origins of Hedyotis diffusa Willd 样品编号 产地 样品编号 产地 (sample No.) (origins) (sample No.) (origins) 1 Ningbo Zhejiang 7 Jiujiang Jiangxi 2 Guangdong 8 Yujiang jiangxi 3 Longyan Fujian 9 Shaxian Fujian 4 Jian’ou Fujian 10 Shaowu Fujian 5 Tianshi Jiangxi 11 Hubei 6 Shangcai Henan 12 Quanzhou Fujian 2.3 方法与结果 (1)溶液的制备 对照品溶液 精密称取?和?对照品适量，用流动相溶解稀释，分别制成?浓 -1-1度为100 ,g?mL和?浓度为200 ,g?mL的对照品储备液。 精密量取?和?对照品储备液各1 mL，置于同一100 mL量瓶中，用流动相稀释 -1-1制成含?和?分别为1 ,g?mL 和2 ,g?mL的对照品溶液。 供试品溶液 取药材粉末(过40目筛)约3 g，精密称定，加15倍量无水乙醇，85 ?水浴加热回流提取2次，每次1.5 h，过滤，合并滤液，减压蒸干，用流动相溶解转移至50 mL量瓶并稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即得。 (2)色谱条件及系统适用性试验 采用Diamonsil C色谱柱(200 mm×4.6 mm，5 ,m),以甲醇–水(62?38，v/v)18 -1为流动相，流速1.0 mL?min，检测波长267 nm，柱温为室温。 分别取对照品溶液和供试品溶液20 ,L，在上述色谱条件下进样，记录色谱图，见图3-1。两种蒽醌及其与相邻色谱峰之间分离度大于1.5，以2-甲基-3-羟基蒽醌和2-甲基-3-羟基-4-甲氧基蒽醌峰计算理论塔板数不低于4500。 . - A B Fig.3-1 Chromatograms of reference substance solution(A) and sample solution(B) 1. 2-methyl-3-hydroxy-4-methoxyanthraquinone,(?) 2. 2-methyl-3-hydroxyanthraquinone,(?) (3)线性关系的考察 分别精密量取?、?的对照品储备液各10 mL置于同一100 mL量瓶中，加流动 -1相稀释至刻度，摇匀，得分别含?, ?10，20 ,g?mL的混合对照品溶液。精密吸取上述对照品混合溶液0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5 mL至10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度， -1摇匀。在上述色谱条件下进样20 ,L，以浓度C (,g?mL )为横坐标，峰面积(A)为纵 -2。计算，得回归方程为: 坐标，绘制曲线，如图3 53A = 1.054×10 C- 2.150×10 r = 0.9999 ?? 52A = 1.761×10 C- 7.973×10 r = 0.9999 ?? . - Fig.3-2 Standard curves of 2-methyl-3-hydroxy-4-methoxyanthraquinone(?) and 2-methyl-3-hydroxyanthraquinone(?) -1-1表明?浓度在0.1,5.0 μg?mL、?浓度在0.2,10.0 μg?mL范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系。 (4)精密度试验 取供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，记录峰面积，?和?峰面积的RSD分别为2.2%和2.6%，表明本法精密度良好。 (5)重复性试验 精密称取浙江宁波产白花蛇舌草3 g，按供试品溶液制备项下方法平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，计算含量，?和?的平均值分别为4.32%、5.09%，RSD分别为2.5%和2.1% ，表明本法重复性良好。 (6)稳定性试验 取同一份供试品溶液，室温放置，分别在0，2，4，8，12，24 h进样分析，记录峰面积，?和?峰面积的RSD分别为1.7%和1.9%，表明供试品溶液至少在24 h内稳定。 (7)回收率试验 . - 分别精密称取已测知含量的浙江宁波产白花蛇舌草药材粉末(过40目筛)1.5 g, 精密加入?对照品储备液0.66 mL，?对照品储备液0.38 mL。按“3.1.3”项下供试品溶液制备方法操作 (n =6)，在上述色谱条件下测定，?和?的平均回收率分别为99.2% (RSD =1.9%)和99.8% (RSD =2.3%)。结果见表3-2和表3-3。 Tab.3-2 Recovery of? in Hedyotis diffusa Willd (n=6) NO. Added(μg) Found(μg) Recovery(%) Mean(,) RSD(,) 1 66.0 68.0 102.3 2 66.0 65.0 97.8 3 66.0 65.8 98.9 99.2 1.9 4 66.0 64.4 96.8 5 66.0 66.4 99.8 6 66.0 66.1 99.4 Tab.3-3 Recovery of ? in Hedyotis diffusa Willd (n=6) NO. Added(μg) Found(μg) Recovery(%) Mean(,) RSD(,) 1 76.0 77.0 100.4 2 76.0 76.8 100.2 3 76.0 75.0 97.8 99.8 2.3 4 76.0 74.8 97.6 5 76.0 76.1 99.2 6 76.0 79.6 103.8 (8)含量测定 取不同产地白花蛇舌草药材，按“3.1.3”项下供试品溶液制备方法操作制备供试液。分别取供试液和对照品溶液在上述色谱条件下进样测定，按外标法以峰面积计算含量，结果见表3-4。 . - Tab3-4 The contents of two kinds of anthraquinones in Hedyotis diffusa Willd. of different sources(%, n =3) ? ? Total Contents Origins Contents RSD Contents RSD (mg/g) (mg/g) (%) (mg/g) (%) zhejiangningbo 4.43 2.3 5.12 2.2 9.55 guangdong 4.50 0.76 11.2 1.1 15.7 fujianlongyan 0.821 1.8 2.83 1.9 3.65 fujianjian'ou 0.927 0.42 3.70 1.1 4.63 jiangxitianshi 0.516 0.16 3.08 0.38 3.60 henanshangcai n.d - n.d - n.d jiangxijiujiang 1.97 1.3 7.73 2.0 9.70 jiangxiyujiang 1.69 1.2 6.27 2.2 7.96 fujianshaxian 4.29 2.3 0.960 1.5 5.25 fujianshaowu 1.26 2.5 4.56 1.2 5.82 hubei 1.70 0.79 4.91 0.91 6.61 fujianquanzhou 0.450 0.73 0.961 0.58 1.41 n.d: not detected . - 第三章GC法测定白花蛇舌草药材中2种蒽醌的含量 3.1 仪器和试剂 Agilent-6890毛细管气相色谱仪 美国安捷伦公司 氢火焰离子检测器(FID) 同上 HP CORE色谱工作站 同上 无水乙醇(分析纯) 山东禹王化学试剂厂 3.2 方法与结果 (1)溶液的制备 对照品溶液 精密称取?对照品1.02 mg，?对照品2.04 mg，分别置于两个10 -1-1mL的量瓶中，加乙醇溶解，制成?浓度为102 ,g?mL和?浓度为204 ,g?mL的对照品储备液。 吸取?和?对照品储备液各0.1 mL，置于同一10 mL量瓶中，用乙醇稀释精密 -1-1制成含?和?分别为1.02 ,g?mL 和2.04 ,g?mL的对照品溶液。 供试品溶液 取药材粉末(过40目筛)约3 g，精密称定，加15倍量无水乙醇，85 ?水浴加热回流提取2次，每次1.5 h，过滤，合并滤液，转移至50 mL量瓶并用乙醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，即得。 (2)色谱条件及系统适用性试验 采用HP-5弹性石英毛细管柱( 30 m× 0.32 mm× 0.25 μm)，进样口温度为250 ?，检测器温度260 ?，柱温228 ?，分流比为20?1，载气为高纯氮，流量为50 mL/min。 分别取对照品溶液和供试品溶液，在上述色谱条件下进样1 μL，记录色谱图，见图3-3。2种蒽醌及其与相邻色谱峰之间分离度大于1.5，以2-甲基-3-羟基-4-甲氧 5基蒽醌和2-甲基-3-羟基蒽醌峰计算理论塔板数不低于10。 2 A 1 . - B 2 1 Fig.3-3 Chromatograms of reference substance solution(A) and sample solution(B) 1. 2-methyl-3-hydroxy-4-methoxyanthraquinone，(?) 2. 2-methyl-3-hydroxyanthraquinone，(?) (3)线性关系的考察 分别精密量取?、?对照品储备液各5 mL至同一50 mL量瓶中，加无水乙醇稀 -1-1释至刻度，摇匀，得分别含?10.2 ,g?mL, 含?20.4 ,g?mL的对照品混合溶液。精密吸取上述对照品混合溶液0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5 mL至10 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻 -1度，摇匀。分别吸取20 ,L，在上述色谱条件下进样，以浓度C (,g?mL )为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，计算，得回归方程为: A = 34.41 C– 0.2634 r = 0.9999 ?? A = 31.80 C+ 1.242 r = 0.9999 ?? Fig.3-4 Standard curves of 2-methyl-3-hydroxy-4-methoxyanthraquinone(?) and 2-methyl-3-hydroxy-4-methoxyanthraquinone(?) -1-1表明?浓度在0.102,5.10 μg?mL、?浓度在0.204,10.2 μg?mL范围内与色. - 谱峰面积呈良好的线性关系。 精密度试验 (4) 取供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，记录峰面积，?和?峰面积的RSD分别为2.4%和3.2%，表明本法精密度良好。 (5)重复性试验 精密称取浙江宁波产白花蛇舌草3 g，按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，计算含量，?和?含量的平均值分别为4.51%、5.32%，RSD分别为3.1%和2.6% ，表明本法重复性良好。 (6)稳定性试验 取同一份供试品溶液，室温放置，分别在0，2，4，8，12，24 h进样分析，记录峰面积，?和?峰面积的RSD分别为1.2%和0.90%，表明供试品溶液至少在24 h内稳定。 (7)回收率试验 分别精密称取已测知含量的浙江宁波产白花蛇舌草药材粉末(过40目筛)9份，每份1.5 g，分别按约药材含量的80%、100%、120%量，精密加入?和?对照品储备液。按“3.2.2”项下供试品溶液制备方法操作，在上述色谱条件下测定，回收率结果见表3-5和表3-6。 Tab3-5 Recovery of? in Hedyotis diffusa Willd (n=3) Added(μg) Found(μg) Recovery(%) Mean(%) RSD(%) 51.8 101.6 51.0 48.5 95.1 49.1 96.3 62.4 102.0 61.2 57.7 94.3 98.1 2.7 59.7 97.5 70.5 98.7 71.4 69.8 97.8 71.3 99.8 . - Tab3-6 Recovery of? in Hedyotis diffusa Willd (n=3) Added(μg) Found(μg) Recovery(%) Mean(%) RSD(%) 57.9 94.6 61.2 61.8 101.0 59.2 96.7 84.7 103.8 81.6 78.8 96.6 97.8 2.9 79.5 97.4 98.3 96.4 102.0 100.6 98.6 97.5 95.6 (8)含量测定 取不同产地白花蛇舌草药材，按“3.2.2”项下供试品溶液制备项下方法操作，制备供试品溶液。分别取供试液和对照品溶液在上述色谱条件下进样测定，按外标法以峰面积计算含量，结果见表3-7。 Tab3-7 The contents of two kinds of anthraquinones in Hedyotis diffusa Willd. of different sources(%, n =3) ? ? Total Contents Origins Contents RSD Contents RSD (mg/g) (mg/g) (%) (mg/g) (%) 4. 73 2.9 4.58 2.4 9.31 zhejiangningbo 3.97 2.5 9.93 1.3 13.9 guangdong 2.26 3.2 6.99 1.7 9.25 jiangxijiujiang 第四章 讨论 (1)提取溶剂的选择 分别取白花蛇舌草药材粉末3 g(过40目筛)，精密称定，分别加入氯仿、乙酸乙酯、无水乙醇各45 mL，加热回流提取2次，每次1.5 h，过滤，合并滤液，蒸干，加入适量流动相溶解，转移至50 mL容量瓶中并定容至刻度，过滤，在上述色谱条件下进样测定。结果表明提取溶剂为无水乙醇时提取效率最高。 (2)提取方法的选择 取白花蛇舌草药材粉末约3 g(过40目筛)，精密称定，以无水乙醇45 mL为提取溶剂，采用超声法提取2次，每次1.5 h，过滤，合并滤液，蒸干，加入适量流动. - 相溶解，转移至50 mL容量瓶中并定容至刻度，过滤，在上述色谱条件下进样测定, 与加热回流提取结果比较，表明提取方法选择加热回流法时提取效率高于超声波提取法。 (3)提取条件的优化 取同批药材粉末3 g(过40目筛)，精密称定，以每克药材中2种蒽醌的含量作为考察指标，在选择加热回流法作为提取方法的基础上，选择乙醇浓度、提取时间、 4提取次数和加醇量作为考察因素，每个因素取3个水平，选用L(3)进行正交试验。9 正交试验设计因素水平见表3-8。按正交试验设计测定药材中?的含量结果见表3-9和表3-10;?的含量结果见表3-11和表3-12。 Tab.3-8 Factors and levels of orthogonal test 因素 水平 A乙醇 浓 度(,) B 提 取 时 间(h) C 提 取 次 数(次) D加 醇 量(倍) 1 70 0.5 1 10 2 95 1.5 2 15 3 100 2.0 3 20 . - 4Tab.3-9 L (3) Arrangement and results in orthogonal test 9 ?含量(μg/g)Number A B C D 1 1 1 1 1 9.62 2 1 2 2 2 12.5 3 1 3 3 3 13.9 4 2 1 2 3 16.8 5 2 2 3 1 18.8 6 2 3 1 2 16.9 7 3 1 3 2 16.6 8 3 2 1 3 19.3 9 3 3 2 1 20.3 12.01 14.34 15.26 16.22 17.48 16.87 16.54 15.35 18.72 17.01 16.41 16.64 R 6.713 2.668 1.271 1.298 j :水平的综合平均值，:水平的综合平均值，:水平的综合平均值，R:第j列j 因素的极差。 Tab.3-10 Variance analysis of the results (α=0.10) Source significance SS DF F P * A 76.48 2 3.200 3.110 B 13.53 2 0.566 3.110 C 2.949 2 0.123 3.110 D 2.633 2 0.110 3.110 Error 95.59 8 SS:偏差平方和 DF:自由度 F:方差比 P:临界值 . - 直观分析:从表3-9中R值的大小可以看出，各因素对试验结果的影响顺序为 水平组合为ABCD A>B>D>C, 最佳3323 方差分析:由表3-10可知，A因素即醇浓度对指标有显著性影响。 4Tab.3-11 L (3) Arrangement and results in orthogonal test 9 ?含量(μg/g)Number A B C D 1 1 1 1 1 42.6 2 1 2 2 2 67.2 3 1 3 3 3 52.8 4 2 1 2 3 72.2 5 2 2 3 1 61.9 6 2 3 1 2 65.1 7 3 1 3 2 59.4 8 3 2 1 3 60.4 9 3 3 2 1 79.6 54.20 58.05 56.02 61.34 66.40 63.14 72.99 63.89 66.44 65.84 58.03 61.81 R 12.24 7.787 16.97 2.544 j :水平的综合平均值，:水平的综合平均值，:水平的综合平均值，R:第j列j因素的极差。 . - Tab.3-12 Variance analysis of the results (α=0.10) Source significance SS DF F P A 298.6 2 1.300 3.110 B 93.81 2 0.408 3.110 C 515.6 2 2.244 3.110 D 11.01 2 0.048 3.110 Error 919.0 8 SS:偏差平方和 DF:自由度 F:方差比 P:临界值 直观分析:从表3-10中R值的大小可以看出，各因素对试验结果的影响顺序为C> A> B> D, 最佳水平组合为ABCD。 3322 方差分析:由表3-12可知，没有因素对指标有显著性影响。 综合分析 ?的提取条件最佳水平组合为ABCD，?的提取条件最佳水平组合为3323 ABCD。醇浓度对?的提取量有显著性影响，提取时间、提取次数和加醇量对23322 种蒽醌提取量均没有显著性影响。为节省时间和试剂，最后确定白花蛇舌草药材的提取条件为ABCD即加入15倍量的无水乙醇，提取2次，每次1.5 h。 3222 , 验证试验 -1 重复最佳条件ABCD进行试验，结果为:?的含量为20.1 μg?g，?的含量3222 -1为75.6 μg?g。 (4)HPLC流动相的选择 选择甲醇,水(65:35，v/v)作流动相时，2种蒽醌化合物不能达到完全分离，以甲醇,水(60:40，v/v)作流动相，两成分之间及其与杂质峰能完全分离，但分析时间相对较长;选择甲醇,水(62:38，v/v)作流动相能使分析时间缩短，又能使2种蒽醌及与杂质峰完全分离，因此选择甲醇,水(62:38，v/v)作为同时测定药材中2种蒽醌含量的流动相。 (5)HPLC检测波长的选择 由蒽醌?和?的紫外吸收光谱图(见附图25，26)，可以看出二者均在267 nm处有最大吸收，因此选择267 nm作为?和?的检测波长。 . - (6)GC色谱条件的选择 采用DB-17弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，在恒定柱温条件下，两种蒽醌化合物保留时间短，不能完全分离;而在程序升温条件下，色谱图基线漂移，两种蒽醌化合物在16 min以上才能达到完全分离，且2-甲基-3-羟基蒽醌色谱峰(化合物?)拖尾严重。由于2种蒽醌极性都较小，改用弱极性的HP-5弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度为250 ?，检测器温度260 ?，柱温228 ?，分流比为20?1，载气为高纯氮，流量为50 mL/min时进样分析，两种蒽醌在7 min之内即能完全分离，且基线稳定，色谱峰形对称。 (7)两种分析方法的比较 对比两种分析方法表明:同时测定2-甲基-3-羟基-4-甲氧基蒽醌和2-甲基-3-羟基蒽醌，两种分析方法均准确可靠、重复性好，所测得的含量结果无显著性差异;与HPLC法相比，采用GC法时，样品处理简单，两主成分色谱峰之间的分离度更大，而且分析时长也大大缩短。 (8)不同产地药材中2种蒽醌的含量比较分析 对来自国内12个产地药材含量的测定结果分析表明，不同产地白花蛇舌草中?和?含量差异很大。其中广东产药材中?和?含量最高，而在河南上蔡产药材中没有检测到?和?。除了采收期的差异外，各产地气候、土壤等环境条件是影响?和?含量的重要因素。 参考文献 [1] 周建波，龙斯华，黄存礼. 白花蛇舌草的微量元素分析.中国中药杂志，1990,15(2):36 [2] 蒋丹，王关林(22种中草药抑菌活性的研究[J].辽宁高职学报,2003(4):140-141,146 [3] 江苏新医学院.中药大辞典.上海:上海人民出版社.1977:754-755 [4] 谭宁华,王双明,杨亚滨 等.白花蛇舌草的抗肿瘤活性和初步化学研究.天然产物研究与开发, 2002,14(5):33-36 [5] 赵浩如,李瑞,林以宁 等.白花蛇舌草不同提取工艺对抗肿瘤活性的影响.中国药科大学学. - 报,2002,33(6):510-513 [6] Li R, Zhao H, Lin Y. 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