【doc】酶法检测大豆蛋白酶抑制因子的实验探讨

【doc】酶法检测大豆蛋白酶抑制因子的实验探讨 酶法检测大豆蛋白酶抑制因子的实验探讨 大豆蛋白酶抑制因子是大豆的 主要抗营养因子,约占大豆蛋白质的 6%.生大豆抗营养作用的40%是由蛋 白酶抑制因子引起的.大豆蛋白酶抑 制因子能抑制畜禽肠道内胰腺分泌 的蛋白水解酶,如胰蛋白酶,糜蛋白 酶和弹性蛋白酶等的活性,引起生长 停滞,胰腺增生和肥大等.这种作用 在幼年畜禽上尤为明显,减少了其饲 养价值,限制了大豆和豆粕作为主要 蛋白饲料的使用价值.因此,实际生 产中,获取不同品种的大豆及其加工 副产物中胰蛋白酶抑制因子的活性 范围,以确定大豆和豆粕在饲料中的 使用量,急需简便,快速,准确的胰蛋 白酶抑制因子活性测定方法. 但有关大豆蛋白酶抑制因子测 定方法方面的研究相对薄弱.目前饲 料工业和食品工业还只是用脲酶活 性间接表示大豆胰蛋白酶抑制因子 的失活程度,该法步骤繁琐,灵敏度 不高,结果变异性较大,难以满足实 际生产的推广.相比之下,酶化学方 法灵敏度高,特异性强,准确性好,简 便快捷.所以,本文主要推广介绍由 Kakada1974年创立的Kakada酶学检 测法和由Gabofit在1993年建立的微 量反应板法. 1Kakada酶学检测法 1.1测定原理 Kakade酶学检测法在1974年建 立的,其原理以苯甲酰一DL一精氨酸一 对硝基酰基苯胺(Benzoyl—DL— arginin-p-nitroanilide—hydrochliride, DL—BAPA)为底物,将样品加入 胰蛋白酶溶液,测定胰蛋白酶活性减 少的程度.然后以酶活性为纵坐标, 以加入的样品量为横坐标,作图得出 抑制曲线,根据此曲线求出待测样品 所含抑制因子能抑制的酶活性. 1.2适用范围 该方法适用于大豆鲜样品,各种 处理过的大豆样品及其制品,如:大 豆分离蛋白,大豆浓缩蛋白,全脂大 豆粉等. 1.3测定方法 1.3.1仪器设备:水浴锅,分光光度计, 带塞试管,磁力搅拌器,漩涡振荡器: 1.3.2试剂与溶液:含钙Tris一盐酸缓 收稿日期:2004—02—27 程志斌男,27岁,中国农业大学农业部饲料 工业中心,博士 酶法检测 大豆蛋白酶抑制因子的实验探讨 程志斌(中国农业大学农业部饲料工业中心,北京100094) 中图分类号:$816.32文献标识码:B文章编号:1008—0414(2004)09—0059—03 冲液(0.05mol/L,pH8.2):称取Tris6.05g (羟基甲基氨基甲烷)和氯化钙2.94g (CaCI2-HO),溶于900mL蒸馏水,调 节pH至8.2,然后定容至l000mL. 底物溶液:称取DL—BAPA40mg溶 于0.5mL二甲基亚砜,并用含钙Tris- 盐酸缓冲液稀释到l00mL:胰蛋白酶溶 液:4mg胰蛋白酶溶于200mLlmmol/L 盐酸溶液. 胰蛋白酶溶液:称取4mg胰蛋白酶 溶于200mLlmmol/L盐酸溶液中,使 用时保持在37?,现用现配: 醋酸终止液:30mL乙酸溶于70mL 蒸馏水. 1.3.3测定步骤:称取1.0g待测粉样(过 l00目)于l50mL三角瓶中,加50mL 0.0lmol/L氢氧化钠溶液,窒温搅拌3h, 形成悬浮液,pH保持在8.4,l0,0之间; 将悬浮液做适当稀释,使得lmL浸提 液中含的抑制因子对胰蛋白酶的抑制率 为40%,60%;分别移取0,0.6,1.0,1.4, l,8稀释后的待测样品悬浮液于试管中, 加水至2mL;加入2mL胰蛋白酶溶液, 置于漩涡振荡器上混和均匀,在37?水 浴10min;向试管中加入5mLDL-BA— PA溶液,混合均匀;准确维持在37?反 应10min,然后加入lmL30%的乙酸终 止液. 参照液:取水和胰蛋白酶溶液各 2mL于试管中混和均匀,加lmL30%乙 酸终止液,再加入5mL的DL—BAPA溶 液. 将试管内容物过滤,滤液在波长 410nm下比色. 1.3.4结果表示:定义1个胰蛋白酶抑制 因子单位(TrypsinUnit,TIU)为:在上述 反应条件下,波长4l0nm时每l0mL反 应混合物引起0.01个吸光度的改变 每毫升浸提液中胰蛋白酶抑制因 子活性: TIU/mL浸提液=(A对照一A样品) X】00 每毫克待测样品中胰蛋白酶抑制因 子活性: TIU/mL样品:TIU/mL浸提液/20 根据大量实验数据表明,该方法灵 敏度偏低,如果测定加热过度产品时,结 果变异性较大.而且,浸提液中除胰蛋白 酶抑制因子外,其它的成分,如植酸,单 宁,脂肪酸和皂化素也对胰蛋白酶的活 性有抑制作用,无法区分.为此,以后的 研究者对Kakada酶学检测法做了改进, 主要是针对浸提液和浸提条件这两方 面.Valdebouze等(1980)和Liu等(1989) 将待测样品的提取条件由碱性改为酸 性,使提取液中酚类化合物含量大大降 低,减少了测定干扰,提高了检测方法的 准确性.具体改进方法的对比,见表l. 2微量反应板法 对Kakada酶学检测法的改进,使该 检测方法更加敏感,步骤更简化,胰蛋白 酶抑制因子的活性检测值重复性好,但 是因为反应步骤比较复杂,费时,每次只 能检测l,2个样品.所以Gabofit(1993) 在Valdebouze改进法的基础上提出了 一 种在微量反应板上进行反应的改良方 法,提高了对大批量样品的检测速度: 2,1测定原理 与Kakada酶学检测法相同,是以苯 甲酰一DL一精氨酸一对硝基酰基苯胺 rBenzoyl——DL——arginin——P——nitroanilide——hy?- drochliride,DL—BAPA)为底物,将样品 加入标准胰蛋白酶溶液,测定胰蛋白酶 活性减少的程度.然后以酶活性为纵坐 标,以加入的样品量为横坐标,作图得出 抑制曲线,根据此曲线求出待测样品所 含抑制因子能抑制的酶活性= 2-2适用范围 该方法同样适用于大豆鲜样品,各 种处理过的大豆样品及其制品,如:大豆 分离蛋白,大豆浓缩蛋白,全脂大豆粉 等. 2.3测定方法 LIvEsTocl'ADPoULTRY|D研RY0,92oo毒 2.3.1仪器设备:微量反应板,酶标仪, 试管,磁力搅拌器,漩涡振荡器,微量 移液枪 2.3.2试剂与溶液:含钙Tris一盐酸缓 冲液(0.05mol/L,pH8.2):称取Tris6.05 g(羟基甲基氨基甲烷)和氯化钙2.94 g(CaC1?H:O),溶于900mL蒸馏水, 调节pH至8.2,然后定容至1000 mL. 底物溶液:称取DL—BAPA40mg 溶于0.5mL二甲基亚砜,并用含钙 Tris一盐酸缓冲液稀释到100mL.胰蛋 白酶溶液:4mg胰蛋白酶溶于200mL 1mmol/L盐酸溶液. 胰蛋白酶溶液:胰蛋白酶20mg 溶解到0.001mol/L盐酸溶液冰箱备 用,用时稀释,标准的胰酶溶液,即在 410nm波长下,每毫升溶液的咦酶活 性为0.4个吸光度.首先50L水,50 L标准胰酶溶液孵育10min,然后加 125txL,BAPNA溶解液,30min后用 30%25L乙酸终至在410nm处测 吸光度. 2.3.3测定步骤:待测样品准备:称取 0.1g待测粉样(过100目)溶于25mL 0.01mol/L盐酸溶液中,用磁力搅拌器 搅拌30min,pH保持在2.8-3.0,在4? 温度下离心15rain,取上清液待测;加样 顺序见表2. 2.3.4结果表示:根据加样量和吸光度作 出回归曲线,计算出斜率值(OL),胰蛋白 酶抑制因子是以每毫克样品中胰蛋白酶 被抑制程度表示. TUI/mg样品=(d/0.01)x(1/P)X (0.250/10) P:每毫升样品中样品的毫克数 d:斜率 0.250/10:是常数,Kakade酶分析法 TUI定义为4l0nm时每10mL反应混 合物引起0.01个吸光度的改变,本方法 最终体积为0.25mL.为了使rIJI测定结 果单位统一,特将结果折算为0.250mL/ l0mL. 微量反应板法的检测结果同 Kakade酶分析法相比最大的优点是可 以进行批量样品的检测,分析效率大大 提高. 表13种检测方法的差异比较 23456 样品(L) 水(ttL) 胰酶标准液(I-tL1 反应时间 BAPAN(ItI1 反应时间 乙酸(L) 总体积(ttL) lO 40 5O l25 25 250 在410nm波长下,嗣微量反应棱读数读数 3影响酶法检测的因素 影响酶法检测的因素很多,除了上 面提到的浸提液外,其检测结果还受其 他因素的影响. 3.1加样顺序 在所有的酶法检测中,对胰蛋白酶 抑制因子和胰蛋白酶的预孵育是最关键 的步骤,充分孵育可以提高测定的稳定 性.IJiu和Markakis(1989)在测定纯化的 KTI和BBI时发现,先孵育胰蛋白酶和 胰蛋白酶抑制因子再加底物(s—last)与 先孵育胰蛋白酶抑制因子和底物再加胰 蛋白酶(e—last)相比,前者的数值偏低. 进一步研究发现,上述反应顺序效 应的产生与反应时间相关.1986年 Laskowski提出了胰蛋白酶和其抑制因 子的反应模型,该模型认为在胰蛋白酶 抑制因子反应位点有一个胰蛋白酶敏感 键,该键在反应过程中容易断裂变性.尽 管天然和变性的胰蛋白酶抑制因子都能 和胰蛋白酶反应,但变性胰蛋白酶抑制 因子有两条肽链以二硫键的形式紧密联 接,因此反应速度缓慢.与e—last模式相 比,在s-last模式中,胰蛋白酶抑制因子 和胰蛋白酶的反应时间长,因此变性的 胰蛋白酶抑制因子较多,导致e—last模 式中测定的抑制因子值偏高. 3.2测定前的离心 样品液在测定吸光值之前是否离心 也会对测定结果产生影响.一般而言,与 不离心的测定结果相比,离心后的测定 结果数值偏低. 3.3酶的来源和纯度 不同来源和纯度的胰蛋白酶和胰蛋 白酶抑制因子的亲和常数不同,所以酶 的来源和纯度也会影响测定结果. 3.4底物 不同形式的底物对测定结果也有影 响,不同的底物灵敏度不同.测定蛋白酶 活性的底物可以分为蛋白质,合成氨基 酸酰胺和合成氨基酸酯.其中最常用的 合成底物是酰胺即DL—BAPA. 目前,各个实验室表达胰蛋白酶抑 制因子活性的单位各不相同,有Trypsin units【TU),Trypsininhibitorunits(rrIU), Trypsinunitsinhibited(TUI),Trypsinin. hibitoractivity(TIA),mgig样品,mg/g蛋 白质.其中TUI和rrIu相等,lg胰蛋 白酶抑制因子等于l,9TUI,测定结果使 用单位不统一,各个实验室之间可比性 差. 4小结 总体而言,酶化学方法灵敏度高,特 OO5 如 5O522 OOO5 如 4l5l22 oooc;如325l?322 5O加如? 5O 0 如如 异性强,准确性好,简便快捷,如果能 针对以上影响酶法测定胰蛋白抑制 因子的因素,深入研究,加以改进,最 后制定饲料行业统一的测定标准,相 信对饲料工业和养殖业有积极的作 用. 参考文献 【1】Gaborit,T.,L.Quillien,andJ.Gueguen. 1993.Determinationoftrypsininhibitor activityinseedsbyamicrotitreplate methods.In:A.F.B.VanderPoel,J. Huisman,andH.S,Saini(ed.1Recent AdvancesofResearchinAntinutritional FactorsinLegumeSeeds.PP9-30. WageningenPers,Wageningen,The Netherlands 【2】Kakade,M.L.,J.J.Rackis,J.E.McGhee, andG.Puski.1974.Determinationoftrypsin inhibitoractivityofsoyproducts:a collaborativeanalysisofanimproved procedure.CerealChem.51:376~382 【3】Liu,K.S.,andP.Markakis.1989.Trypsin inhibitionassayasrelatedtolimited hydrolysisofinhibitors.Ana1.Biochem.178: 159,l65 【3】Laskowski,M.Jr.1986.Proteininhibitors ofserinepreteinasesmechanismand classification.In:M.Friedman(ed.) Nutritionalandtoxicologicalsignificanceof enzymeinhibitorsinfoods.PP1-17.Plenum, NY 【41Valdebouze,P.,E.Bergeron,andJ. Delort—Lava1.1980.Contentanddistribution oftrypsininhibitorsandhemagglutininsin somelegumeseeds.Can.J.PlantSci.60: 695~701 新型饲料源野大豆草粉 吴立新(山东黄河三角洲国家级自然保护区,山东东营257509) 中图分类号:S816.35文献标识码:B文章编号:1008—0414(2004)09—0061—02 野大豆草粉是野大豆茎,叶和种子 配合加工制成的饲料.各种营养物质丰 富,是饲养畜禽的新型饲料. 1野大豆草粉资源情况 我国是世界大豆的起源地,野生大 豆资源也十分丰富,北起黑龙江,南至 长江流域都有分布:它具有耐旱,耐盐 碱,耐瘠薄,抗病,抗寒的高抗逆性,可 人工种植. 2野大豆牧草的营养特点 野大豆茎,叶和种子都含有极丰富 的粗蛋白,粗脂肪及各种营养物质. 2.1种子可食,种子油亦可食或供药 用.它具有滋补强身,利尿,平肝敛汗之 药效.全草及油饼可做肥料及饲料. 2.2野大豆的种子富含蛋白质,较栽培 大豆高得多.据大豆研究所3300份材 料测定(野大豆,栽培大豆各半),野大豆 平均含蛋白质46.8%,比栽培大豆高出 4.65%,有的野大豆蛋白质的含量高达 55%以上. 2_3野大豆生物量大,营养价值高:根 据其营养成分(野大豆与禾本科獐茅比 较,粗蛋白高出2.8倍,粗脂肪高出1.6 倍;与栽培豆科牧草沙打旺比,粗蛋白 质高出l_35倍,脂肪高出1.45倍.),适 口性,利用率和产草量划为优质饲草. 据山东省草场资源调查和中国农科院 畜牧所采样分析,其营养成分如表l 3野大豆草粉的饲用价值 根据野大豆茎,叶,种子的营养特 点,将野大豆全颗(带豆粒)刈割晒干,加 工制成草粉.1996年,经农业部饲料质 量监督检验测试中心对其营养成分检 验:粗蛋白14.5%,粗脂肪2.25%,钙 0.87%,磷0.18%,苏氨酸4800mr,/kg, 胱氨酸3900mr,/kg,蛋氯酸4800mr,/ kg,异亮氨酸3900mg/kg,色氨酸2200 mg/kg.其中,胱氨酸和蛋氨酸2种必需 氨基酸高于苜蓿草粉.胱氨酸,蛋氨酸和 赖氨酸远高于玉米.野大豆草粉可供给 胡萝卜素,维生素K,B和其它B族维 生素,黄色素等,是畜禽良好的维生素和 蛋白质补充饲料.可作为配制全价配合 饲料的原料,更显示出它的优越性.人工 干草粉维生素D很少,应注意D,的补 充.由于家禽消化纤维能力差,应选用优 质l级草粉.野大豆草粉在蛋鸡日粮中 添加量,6周前1%-2.5%,7周至产蛋期 2.5%-5%;肉种鸡控制体重视情况可添 加2.5%-7%野大豆草粉;肉仔鸡应控制 在1.5%-2.0%;蛋鸭和肉鸭野大豆草粉 用量与蛋鸡和肉鸡相似,但可略高些;火 鸡日粮野大豆草粉用量与蛋鸡和肉鸡相 似,但可略高些,可达5%以上,最高可 达25%.仔猪日粮一般不用野大豆草 粉,生长育肥猪可占日粮5%,l5%,母猪 可占日粮10%以上;兔饲料中野大豆草 粉配比可高达40%-70%;牛,羊日粮野 大豆草粉与尿素结合使用,可相互协同 作用,利用效果显着,野大豆草粉的含量 为50%-80%. 4野大豆草粉的加工 4.1适时刈割 野大豆的收割加工是一个非常重要 的技术问题,一般情况下应在野大豆花 期进行收割,以百株开花率在45%以上 为宜,这样的野大豆草经晾晒加工后其 粗蛋白质含量可达l8%以上: 4.2晾晒 目前,很多地区野大豆草刈割后多 采取田问自然干燥,在收割晾晒ld后, 当上层草含水量达到30%,40%左右时, 利用晚问或早晨的时间进行一次翻晒, 在晴天阳光下晾晒2-3d,当野大豆草 的含水量在l8%以下时,可在晚问或早 晨进行运输,以减少野大豆种子,叶片的 表1野大豆营养成分表% 收稿日期:2004—06—07