【doc】幽门螺杆菌对胃上皮细胞系SGC—7901细胞生长的影响

【doc】幽门螺杆菌对胃上皮细胞系SGC—7901细胞生长的影响 幽门螺杆菌对胃上皮细胞系SGC—7901细 胞生长的影响 中华梢化杂志2001年2月第21卷第2期ChinJD,b~arv2001.v0l_21,N02 幽门螺杆菌对胃上皮细胞系SGC一7901细胞生长的 影响 扬艺邓长生姚学军刘汉燕陈默 研究证明.幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,f)是引起 慢性B型胃炎的病因,是消化性溃疡的重要致病因子,且与 胃癌发生有关….关于H卢引起胃黏膜病变的确切机制,尚 未完全明了.为了认识活体条件下Hp的发病机制.本研究 用体外细胞培养技术,观察了Up活菌对胃上皮细胞系生长 与增殖的影响 材料与方法 一 ,Up活菌悬液的制备 Up国际菌株NCTC11637接种于含5%羊血的厌 氧菌分离培养基平板,置于37?微需氧环境中(5%02,10% c,5%H2,80%N2)培养,3d后收集细菌,用PBS制成细菌 悬液,在分光光度计上确定nl,的浓度(1A660=1x106 cFunI),然后用含2%胎牛血清的RPMI1640作稀释液, 将Hp菌液作连续5倍稀释(1×10,32×10CFU/m1). 二,人胃腺癌细胞系SGC~7901的培养 人胃腺癌细胞系SGC7901贿自上海细胞生物研究所. 细胞培养在含l0%胎牛血清的RPM11640培养液中,置于 37?5%002的培养箱内培养,每2d传代1次. 三,nl,与细胞的共同孵育 细胞以5x10'/孔密度接种于40孔细胞培养板,置于 3TU5%0.2环境中培养24h后,弃去原有细胞培养液,加 人用RPMI1640(含2%胎牛血清)稀释的不同浓度的细菌 菌液,每个浓度重复4孔.对照孔不加细菌,只加含2%胎 牛血清的RPMI1640. 四,观察指标与结果判断 1.细胞计数:分别于nl,活菌加人细胞前(0h)及加人 后的24,48和72h计数细胞.按常规绘制细胞生长曲线. 2.MTT检测:在Hp与细胞共同孵育48h后,弃去培养 液,每孔加人5mg/mlMTT100.ul,于37"C5%002孵育4h 后去掉MTT,an--甲基亚砜lO0,30rain后在酶标仪上测 5701313"1处吸光度值(A). 3.Ki一67抗原的免疫组织化学检测:Ki67单抗及s_P试 剂盒均购自福州迈新公司.细胞以5×10'/孔接种在含小盖 玻片的24孔培养板中,24h后加人不同浓度Up,每种浓度 重复4孔.在加人nl,后48h取出小盖玻片,丙酮固定,按 试剂盒说明书进行染色,DAB显色,苏术精复染,常规脱水 作者单位:430071武汉,武汉大学中南医院消化科(扬艺,邓长 生)|武汉大学病毒研究所(娥学军,羽汉燕,陈默) 113 ? 论着摘要? 封片.用PBS代替第一抗体.作阴性对照,以已知的阳性标 本切片作阳性对照.胞棱中呈棕黄色颗粒的为一67阳性细 胞每张玻片任取5个视野进行细胞计数,至少计数1000个 细胞.Kj67抗原阳性率用阳性细胞数占同一视野细胞总数 的百分比示.每张玻片取不同视野阳性率的平均值. 4.统计学检验:多样本均数比较用单因素方差分析 (one-wayANOVA),多个实验组与一个对照组的两两比较 用最小显着差法(theleastsignificantdifference,LSD)分析. 结果 细胞计数,MTT检测及Ki一67抗原的免疫组化分析均 取得相同的结果:当怖浓度?1.6×10CFU/ml时,建但 进胃上皮细胞生长繁殖;而在?4×10CFU/ml旅度时.则 抑制细胞生长繁殖,且浓度越高抑制越显着(图1.表1). 时间 固1不同维度H活苗对SGC-7901细胞生长的影响 表1nl,与SGC一7901细胞共培养48h后的M1可检测与 Kt一67抗原阳性率 与对照组比较:P<005'.P<001 讨论 本实验运用细胞计数,MTT试验,Ki一67抗原检测三种 一一宴I1?鬻霉署 1】4中华消化杂志2001年2月第21卷第2期ChlaJDiR,February2001,Vol21,No2 不同的指标,同时测定了不同浓度产毒株NCTC11637 活菌,对体外培养人胃腺癌细胞系(SGC-7901细胞)形态与 生长的影响.结果非常一致:较低浓度的自不仅对细胞无 明显毒性,反而促进细胞生长繁殖;而在较高浓度时,f却 明显抑制细胞生长,且浓度越高,抑制作用越显着 本实验发现,较高浓度的H活菌对胃上皮细胞的生长 繁殖,与低浓度相反,具有抑制作用.Wanaer,Knipp等. 也观察到类似的结果.Wanger使用的也是活菌直接感 染胃上皮细胞模型,但他们的结果是较低浓度的Hp也抑制 细胞生长繁殖.导致这种不同结果的原因可能与所用的细 胞系和菌株不同有关.关于Hp抑制细胞生长繁殖的原因, Chen等1发现,功能诱导胃上皮细胞凋亡,且伴有BAK基 因表达增加. 在同一细胞系统,缘何低浓度Hp与高浓度Hp作用后 所出现的结果完全相反,这确是个值得深人研究的问题. Wanger等.的实验也观寨到类似互相矛盾的结果.他们发 现,低浓度的Hp即可诱导细胞凋亡,细胞增殖减步,但同时 DNA合成却趋向增加.究其原因,Hp可能同时具备与细胞 增殖和细胞捅亡相关的两类因子.当低浓度Hp作用于细 胞时,Hp的促细胞增殖因子发挥作用,而促细胞凋亡相关 因子的作用被细胞的代偿机制所对抗,表现为细胞的DNA 合成增加,细胞生长加速;但在高浓度时,Hp的促细胞凋亡 作用和致细胞空泡毒作用则占优势,表现为细胞增殖受到 抑制. Bax基因过表达诱导肝癌细胞凋亡 李江于欣欣杨新科葛蒙粱张杰王文亮 bet一2及其同源类似物是捅亡调节因子中最重要的家旅 之一.bcl一2家旅蛋白能通过多种方式调节细胞死亡途径: (1)与其他bcI一2家旅成员二聚化形成同源或异源二聚体,且 可能通过相互作用改变细胞生与死平衡;(2)与非同源性蛋 白结合;(3)形成离子通道或孔洞….Bax基因是bd2家旅 中的一员,与bet一2家旅其他成员的氨基酸同源性主要表现 在高度保守的BH.和B结构域.人Bax基因位于第19 号染色体,q133,q134内J.Bax过表达能对抗bcl-2抑 制细胞死亡的活性,在促凋亡因素刺激下.bet2/Bax比值将 决定细胞的死活l】].我们旨在研究Bax基因转染HCC-9204 细胞是否可以诱导该细胞发生凋亡,从而探索Bax基因成为 肿癌基因治疗靶基因的潜在可能性. 作者单位:710032西安,第四军医大学病理教研室(李江,王文 亮);中国顼防医学科学院病毒基因工程国家重点实验室(于欣欣,杨 新科,葛繁集);军事医学科学院放射医学研究室(张杰) Hp活菌作用于胃上皮细胞的这种矛盾的"剂量教 应关系,也可用以部分解释人体感染Hp后所表现出的不 同结果:当机体短期内大量Hp感染时,其细胞毒作用及诱 导细胞凋亡作用,可能使胃黏膜出现损伤,导致胃炎或溃疡 发生;相反,在小剂量Hp感染时,其促细胞增殖因子可能使 胃上皮细胞生长增殖,若长期反复作用,可能导致肿癌发生. 人体感染m后,机体与Hp之间的相互作用非常复杂,还 涉及炎症,免疫等多方面因素.但是Hp感染剂量的不同, 可能起着非常重要的作用. 参考文献 1WatanabeT.MayatmiT,NaziH,etHeli~6acter iafectioniaducegastriccE~tlcerinm?IangerbilsGastroen— t~mlogy,1998,115:642—648 2Wao~erS,Bei]W,Wezte~nJ.etalRegula6~oigastric epithetla[cellgrowthbyHelicobacter灿:ofMenceforar0r roleap.ptGastroentem]ogy,1997,113:1836—1847. 3KnippU.BirkhotzS,KaupW.eta__Partialcharacterizationofa cdlproliferationinhibitingproteinproducedbyHelicobacter InfectIr?.1996.64:3491-3496 4ChenG,SordUloEM.R~leyWG,etApoptosisinga~tric epithe]bdceilsisindncedbyHelicobacterp2Coriaadaccompaniedby increased~press[onoiBBi~hemBiophysResCo~un, 1997.239:62632. (收稿日期:1999.10.14) (本文编辑洗洁) 材料和方法 一 ,细胞系和细胞培养 人肝癌细胞系HCC-9204由我室建立.在含50m】/L胎 牛血清的Eagle'5培养液中培育,p53基因已发生突变. 二,质粒构建和DNA转染 人BaxcDNA(pBluesciptKBax)由ThomasChittenden 赢赠.eDNA插人为张杰(军事医学科学院放射医学研究 所)构建的MT—II可诱导性表达载体(pMD-neo).目的基因 表达是在MT—II启动子和SV-40polyA控制下进行,通过外 加锌离子诱导目的基因表达.绿色荧光蛋白(GFP)作为该 系统的报告基因.先构建pMD-GFP.用Not[消化质粒 DGfeenLantenvl产生0.7kb片段,再连接Notl消化的 pMDiqeO,并确定正确的连接方向;再构建pMI~Bax,pBlue— scriptK&x被BamH1和EcoR1消化产生06kb片段,再 与BamH1和EcoR1消化的pM~3-neo连接.转染试剂