临床医学论文-螺旋腺瘤临床病理分析螺旋腺瘤临床病理分析

临床医学论文-螺旋腺瘤临床病理螺旋腺瘤临床病理分析 临床医学论文-螺旋腺瘤临床病理分析螺旋腺瘤临床病理分 析 【摘要】 目的:研究高密度壳聚糖:high density chitosan,HDC:对小鼠L929细胞的毒性,以期为其临床安全应用提供依据。方法:观察不同浓度HDC浸提液对体外培养L929细胞形态的影响,四甲基偶氮唑蓝:methlthiazolyl tetrazolium,MTT:实验HDC对L929细胞生长和增殖的影响,流式细胞术:flow cytometry,FCM:检测HDC浸提液对L929细胞凋亡的影响,单细胞凝胶电泳:single cell gel electrophoresis,SCGE:检测不同浓度HDC浸提液对培养的L929细胞DNA分子损伤的影响。结果:HDC浸提液对体外培养的L929细胞形态无明显影响,对细胞生长和增殖无明显抑制作用,不同浓度材料浸提液的细胞毒性均为01级;FCM示凋亡率随浸提液浓度升高而升高,但不明显;SCGE结果显示HDC对L929细胞的DNA无明显损伤作用。结论:HDC具有良好的细胞相容性和分子相容性,可为临床的安全应用提供依据。 【关键词】 高密度壳聚糖 分子生物相容性 单细胞凝胶电泳 壳聚糖是一种可被降解吸收、具备良好生物相容性的高分子材料,具有多种作用[12]。其衍生物高密度壳聚糖:high density chitosan,HDC:由于还可被应用于填补骨缺损、治疗骨折及具比壳聚糖更明显的降血脂等作用而受到重视,并成为医学工作者研究热点之一,但其相容性评价鲜见报道。随着生物材料相容性研究逐渐向分子水平的迈进,生物材料评价逐渐进入整体、细胞和分子水平的全面评价阶段。为确保生物材料临床应用的安全性,本研究拟通过形态学观察、四甲基偶氮唑蓝:methlthiazolyl tetrazolium,MTT:实验、流式细胞术:flow cytometry,FCM:检测和单细胞凝胶电泳:single cell gel electrophoresis,SCGE:来研究HDC浸提液对L929细胞的影响,进而评价HDC毒性、细胞相容性和分子相容性,期望能为其临床安全应用提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料 HDC(上海优品生物有限公司提供,脱乙酰度90%),L929细胞株(购自中科院上海细胞研究所),RPMI 1640培养基:GIBCO公司提供:,MTT:美国 SIGMA公司提供:,低熔点琼脂糖:南京生兴生物技术有限公司提供:,荧光显微镜:日本Nikon公司提供:。 1.2 实验方法 1.2.1 HDC浸提液制备和实验分组 1.2.1.1 HDC浸提液制备 HDC经紫外照射灭菌后,按试样0.15 g?ml-1的质量浓度,在37?、72 h条件下,浸提后过滤除菌保存备用,浸提介质为含10%小牛血清RPMI 1640培养基。 1.2.1.2 实验分组 (1)阴性对照组,RPMI 1640培养液组;(2),(5)25%、50%、75%、100% HDC浸提液组;(6)阳性对照组,0.7%聚丙烯酰胺单体(PVC):SCGE实验阳性组为0.01 mol?L-1 H2O2组:。 1.2.2 HDC的毒性研究 1.2.2.1 细胞形态观察 0.25%胰酶消化对数生长期的L929细胞,传代后用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液及不同浓度(25%、50%、75%、100%)HDC浸提液培养细胞,然后分别于12、24、72 h倒置显微镜下观察细胞形态、细胞贴壁情况并拍照。:1:无毒:细胞形态正常,贴壁生长好,细胞呈梭形或不规则三角形。:2:轻度毒性:细胞贴壁生长好,但可见少数细胞圆缩,偶见悬浮细胞。:3:中度毒性:细胞贴壁生长不佳,细胞圆缩较多,达1/3以上,见悬浮死细胞。:4:重度毒性:细胞基本不贴壁,90%以上为悬浮死细胞。 1.2.2.2 MTT实验 实验以RPMI 1640培养液稀释100%浸提液至所需浓度。将L929细胞复苏、传代后,于对数生长期经胰蛋白酶消化制成6×104 ml-1的细胞悬液,接种于96 孔培养板,24 h后换液,72 h 后加入MTT,4 h后加入二甲基亚砜(DMSO),震荡10 min后在免疫酶标仪上测定493 nm处光密度(optical density,OD)值。计算细胞增殖率(relative growth rate,RGR或proliferation rate,PR)。RGR(%)=实验组OD均值,阴性对照组OD均值×100%。根据RGR 进行细胞毒性分级:99?RGR?100时,细胞毒性为0 级;75?RGR<99时,细胞毒性为1 级;50?RGR<75时,细胞毒性为2级;25?RGR<50时,细胞毒性为3 级;1?RGR<25时,细胞毒性为4 级;0?RGR<1时,细胞毒性为5 级。0 级和1 级被认为没有细胞毒性,2 级为轻度细胞毒性或结合细胞形态综合评价,3 级和4级为中度细胞毒性,5 级为明显的细胞毒性,35级为不合格材料。 1.2.2.3 FCM检测细胞凋亡 收集处理过的细胞,PBS洗涤2次,70%冰乙醇4?固定24 h以上。检测前用PBS洗涤2次,碘化丙啶染色,FCM检测分析。 1.2.2.4 SCGE检测DNA损伤 在培养的L929细胞中加入不同浓度HDC浸提液后,继续在CO2培养箱中培养6 h和48 h,收集细胞。采用自制磨毛载玻片制三明治胶,每组平行做胶板2张。第1、3层为0.75%的正常熔点琼脂糖,第2层为含处理后细胞的浓度为0.6%的低熔点琼脂糖。经裂解、电泳、中和、染色后,在24 h内荧光显微镜下放大200倍观测记数。镜下每组观察100个细胞,根据细胞的损伤情况将细胞分成5级:0、1、2、3、4级(1,4级为损伤细胞),计算彗星率:彗星率=彗星细胞数/100×100%:。 1.3 统计学处理 实验差异显著性采用t检验和χ2检验,以P，0.05为差异具有统计学意义。 2 结 果 2.1 形态观察 倒置显微镜下观察发现,不同浓度HDC浸提液组及阴性对照组,12 h时细胞已贴壁,细胞突舒展,24 h时细胞充分展开;而阳性材料组细胞大多呈悬浮状,很少贴壁。72 h时HDC及阴性材料组细胞明显增多,排列规则密集,细胞呈梭形、三角形或不规则形,偶见圆形细胞;阳性组大部分细胞呈圆形、核固缩,仅仅少数细胞贴壁,死亡细胞数明显增多。 2.2 MTT检测 25%、50%、75%、100%HDC浸提液组增殖率依次为85.58%、88.50%、97.13%、94.47%,依不同浓度HDC浸提液细胞毒性级数01级,属无毒范畴,为合格生 物材料:1:。表1 MTT法检测的L929细胞增殖率、抑制率和毒性分级 1)与阴性对照组比较,P，0.05;2)与阳性对照组比较,P，0.05 2.3 FCM检测凋亡结果 L929细胞经处理48 h后,25%、50%、75%、100%HDC浸提液组凋亡率依次为0.02%、1.42%、1.47%、1.91%、2.39%和69.33%:图1:。 2.4 SCGE检测 阴性对照组,25%、50%、75%、100%HDC浸提液组及0.01 mol?L-1H2O2组处理L929细胞6 h和48 h后,彗星细胞数依次为3、2、3、3、5、80和3、3、3、5、6、100。χ2统计分析示同浓度组不同时间点比较、同时间点不同浓度组比较,均P，0.05,无显著性差异;不同时间点不同浓度各组与阳性对照组比较,均P，0.01,有显著性差异。 3 讨 论 生物材料是指其与生物系统相作用,对人体组织、血液不产生副作用的材料。生物相容性指生物材料与人体组织接触后,在材料与组织界面发生一系列作用后被人体组织所接受的性能。生物材料由于要应用于人体组织,所以一直备受关注和重视。 A.阴性对照组;B,E.依次为25%、50%、75%、100% HDC浸提液组;F. 阳性对照组 图1 FCM检测细胞凋亡结果 生物材料应用于临床必须具备良好的生物相容性,生物相容性研究也一直是生物材料应用的中心话题。目前认为其检测主要包括体内实验和体外实验。体外实验较体内实验具有许多优点[34],如可快速有效地进行毒性筛选,在评价材料对细胞生长、代谢及增殖影响时具有实验条件易于控制、可标准化、可定量、重复性好和明显缩短研究周期等优点,而体内实验由于存在许多混杂因素的影响和干扰,加上个体差异,很难获得客观、准确的实验资料。生物材料中所含成分对材料本身的生物相容性也存在影响[56]。Ioletti等[7]认为,体外材料与细胞共培养时,一旦材料有毒物质释放,细胞的增殖和形态就会发生改变,同时可直接观察到细胞在材料表面的黏附情况及界面反应,从而为材料的细胞相容性提供最直观的证据。本研究中,我们采用体外实验方法,用材料浸提液培养细胞,观察细胞形态、数量改变同时结合能量化细胞毒性方法即MTT实验结果初步判断材料是否具有毒性。MTT实验于1983年由Mosroam提出,其原理是活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能催化MTT形成紫色结晶物,该结晶物形成数量的多寡与活细胞数量和功能状态呈正相关,该方法能灵敏可靠地反映材料对细胞造成的毒性损害程度。通过实验发现在显微镜下L929细胞形态舒展,呈梭形、三角形或不规则形,贴壁生长良好,与阴性对照组无显著差别,参照形态分析标准,HDC无细胞毒性。MTT结果显示不同浓度HDC浸提液对细胞增殖无明显影响,RGR>75%,参照细胞毒性评价标准,细胞毒性分级为01级, HDC无细胞毒性。从而在形态学上和细胞增殖上证实HDC对L929细胞生长、增殖和代谢具有良好的细胞相容性。 凋亡[8]作为生物相容性评价的一个重要领域,是由基因调控的细胞主动结束生命的过程。当毒性材料作用于细胞后可引起细胞凋亡率的改变,因此可通过 材料作用细胞后的细胞凋亡率改变来反映该材料的毒性。不同浓度HDC浸提液处理L929细胞后其凋亡率与阴性对照组比较,虽随浸提液浓度升高而轻度升高,但无显著差异,而与阳性对照组比较有显著差异,提示HDC无明显的致凋亡作用。 DNA分子损伤检测是遗传毒性研究的重要领域,也是生物材料分子生物相容性检测的一个重要内容。迄今为止,检测DNA损伤最灵敏的终点是检测DNA的断裂。我们选用了SCGE来检测HDC浸提液对L929细胞DNA分子的损伤影响,该方法的原理是将经DNA损伤剂处理后细胞DNA损伤形成链缺口,经电泳后产生典型的“慧星”图像,其拖尾的长度和密度与损伤程度呈正相关。我们采用了计算有尾细胞百分率的方法,研究了HDC对L929细胞DNA的损伤作用,发现HDC对L929细胞DNA无明显损伤作用,从而显示了HDC无明显的遗传毒性作用。 综上所述,本次实验结果显示,HDC作用于L929细胞后,细胞生长良好,细胞增殖率高,对L929细胞凋亡率无明显影响,对L929细胞DNA分子无明显的损伤作用,从而表明HDC是一种无毒材料,具有良好的细胞相容性和分子相容性,可为临床安全应用提供理论依据。 生物材料应用于临床必须具备良好的生物相容性,其检测主要包括体内实验和体外实验。体外实验较体内实验具有许多优点[34],生物材料中所含成分对材料本身的生物相容性也存在影响[56]。Ioletti等[7]认为,体外材料与细胞共培养时,一旦材料有毒物质释放,细胞的增殖和形态就会发生改变,同时可直接观察到细胞在材料表面的黏附情况及界面反应,从而为材料的细胞相容性提供最直观的证据。本研究中,我们采用体外实验方法,将材料浸提液培养细胞, 观察细胞形态、数量改变同时结合能量化细胞毒性方法即MTT 实验结果初步判断材料是否具有毒性。通过实验发现在显微镜下细胞形态舒展,贴壁生长良好,与阴性对照无显著差别,参照形态分析标准,HDC无细胞毒性。MTT结果显示不 75,参照细胞毒性评价标准,同浓度HDC浸提液对细胞增殖无明显影响,RGR(%)> 细胞毒性分级为01级,HDC无细胞毒性。从而在形态学上和细胞增殖上证实HDC对L929细胞细胞生长、增殖和代谢具有良好的细胞相容性。 凋亡[8]作为生物相容性评价的一个重要领域,是由基因调控的细胞主动结束生命的过程。当毒性材料作用于细胞后可引起细胞凋亡率的改变。因此可通过材料作用细胞后的细胞凋亡率改变来反映该材料的毒性。不同浓度HDC浸提液处理L929细胞后其凋亡率与阴性组相比,虽随浸提液浓度升高而轻度升高,但无显著差异,而与阳性组比有显著差异,提示HDC无明显的致凋亡作用。 DNA分子损伤检测是遗传毒性研究的重要领域,也是生物材料分子生物相容性检测的一个重要内容。我们选用了SCGE 来检测HDC浸提液对L929细胞DNA分子的损伤影响,其方法原理是将经DNA损伤剂处理的细胞经电泳后产生典型的“慧星”图像,其拖尾的长度和密度与损伤程度呈正相关。我们采用了计算有尾细胞百分率的方法,研究后发现HDC对L929细胞DNA无明显的损伤作用,从而显示了HDC无明显的遗传毒性作用。 综上所述,本次实验结果示HDC作用L929细胞后,细胞生长良好,细胞增殖率高,对L929细胞凋亡率无明显影响,对细胞DNA分子无明显的损伤作用,从而表明HDC是一种无毒材料,具有良好的细胞相容性和分子相容性,可为临床安全应用提供理论依据。 【参考文献】 [1]MAESA Y,KIMNRA Y.Antitumor effects of various lowmolecular weight chitosans are due to increased natural killer activity of intestinal intraepithelial lymphocytes in sarcoma 180bearing mice [J].J Nutr,2004,134(4):945501. 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