低强度红激光局部照射抑制血管成形术后血管重塑的？…

低强度红激光局部照射抑制血管成形术后血管重塑的？… 低强度红激光局部照射抑制血管成形术后 血管重塑的,… 岭南心血管病杂志2【xl0年8月第6卷第3期 一 一g?’-/ 低强度红激光局部照射抑制血管成形术后 血管重塑的可能机制 耿庆山冯建章陈纪言周颖玲李光陈颜芳林秩雄 【摘要】目的观察低强度红激光照射(LowpowerRed LaserIrradiation,CPRU)后局部血管组织I型胶原(ColI) mRNA,细胞间黏附分子一1【ICAM-1)的达和血管平滑肌细 胞(VSMC)凋亡,探讨LPRL1抑制动脉粥样硬化兔血管成形术 后收缩性血管重塑的可能机制.建立动脉粥样硬化 兔的血管损伤模型.1?只新西兰白兔随机分为单纯血管拉 伤组和单纯拉伤+激光照射组.对术后3天,1周,2周,4 周,8周动物组织提取总RNA,半定量RT-PCR观察ColImR- NA表达和免疫组织化学,LSAB法测定ICAM-1,n53,bcl-2/ bax=Tt咖1L法检测VSMC捅亡并计算凋亡指数.结果? ColImRNA的表达:术后3天,两组均可见到CMImRNA的 表达,但无统计学意义{术后第1,4周,ColImRNA的表达 LPRLI组明显低于对照组;第8周,两组ColIA的表达 均减弱,组间无统计学差异.?IcAM一1的表达:免疫组织化 学检测术后3天即可看到ICA-M一1的表选.LPRLI组明显低于 195 ? 基础研究? 』?州5 对照组;第1周到第4周,LPRLI组的ICAM一1虽然逐渐增强, 但仍然显着低于对照组,并可见到血管外膜明显表达ICAM- 1,LPRLI组位于外膜的ICAM-I的表达受到明显抑制.? vsMc凋亡的检测:我们用”IENEL法检测了位于损伤血管内 膜和中膜的VSMC的凋亡,结果发现术启3天至1周两组间 掏亡指数无统计学意义;术后2周至4周,LPRLI组VSMC的 凋亡指数明显大于对照组;第8周两组问无统计学意义 3,bel-2/bax三个凋亡相关基因的检测组间未发现明显统 计学差异.结论?LPRLI可以抑制ColImRNA的表达;? LPRLI抑制炎症反应可能是通过抑制IcAM.1的表选来实现; ?删可以诱导损伤血营VSMC凋亡并且与n53,l~]-2/bax 三个凋亡相关基因的表达无关.LPm/诱导VSMC捅亡的确 切机制尚需进一步研究.以上三个结论可能成为LPRLI抑 制损伤血管收缩性重塑的重要机制. 【关键词】塾堂笪重望平滑肌细胞 Thepotentialmecban-啪 sofLPRLIattenuatesthe?vevas~~ularrmtodainglifterb~fllooniqiuryin atheroseleroticrabbits&Qingshan,Jia~hang,ChertJ,eta1.Departmert tofCardiology,C.tza~g- 幽gCard~utarInstitute,C.ua~u510100 【Abstract】ObjectiveInthisstudy,weinvesti— gatodwhetherLPRU(LowPowerRodLaserIrradiation) couldattenuatetheexpressionsofColImRNA,ICAM一1, p53,bcl-2/baxandinduceapoptosisofVSMCinthetab? bitalxtmninaiaortainurvmode1.MethodsWeestab. ?shodatherosclemticarterialstenosismodelssuccessfully. 100maleNewZealandwhiterabbitswererandonfizedinto twogroups:ballooninjurygroupandballooninjuryplus laserirradiationgroup(totalirradiationdensity.:0.9J/ c).After3days,1week,2weeks,4weeks,8 weeks,abdominalaortaswereharvestodforreversetran— scription-polymerasechainreaction(RT-PCR)studies andimmtmohistoehemiealstudiesontheexpressionsof ColImRNA,ICAM-1,p53,bcl-2/b,~LX.Thepresenceof 作者单位:510100广州市广东省心血管病研究所心内科 apoptoticVSMC岫demonstratodbytennlnaldeoxTnu. cleotidyltrmasfemse—mediateddI仃PIlicklendlabeling (TuN?)method.Results?TheexpressionofColI mRNAat3rddayafterballoonmjury,thetwogroup*s (LPRL[groupvscontrolgroup)didnotskowasi~nifi- candydifiereoee[(114?24)cpm(1l8?l1)cmp,P >0.051.from1stweekto4thweek.theexpressionsof ColImRNAshowedasignifieamlydifference.1heden. sitometricdataofRT-PCRinLPRLIgroupwa8lowerthan thecontrolgroup[(760?119)cpm(879?121) cpm,P<0.05;(1l20?300)cpm(1409?297) c/~rn,P<0.05;(9l8?180)cpm(1109?l17) cpm,P<0.05];?1heexpressionofICAM.1flora3rd dayto4thweek.theexpressionsofICAM一1inLPRLI groupw?significanflyreducedbothattheintimaandad? 196 ventitia[(0.90?0.48)w(1.79?0.91),P<0.05; (1.41?0891)(346?I.57),P<0.OI;(2.60? 0.91)(3.51?0.99),P<0.05;(2.31?1.O0)? (2.57?1.2.),P<0.05].?ApoptosisofVSI~IC. Thesestudiessuggestedthattherewerehistocheraicalevi一 &neeofapoptoslsinalloftheinjuredvessels.There Werenoquantitativedirericesi13theamountofLPRLI andContro]vesselsat3days.1weekand8weeksBut theIeweremarkeddre/icesbetwe肌thetwogroups. eindexofapoptoticVSI~ICinIPHIJgroupwashi目 thancolnlro1groups(51?1929?ll,P<0.0l;36? 1226?8.P<0.05).N0signlfieantlydifferencesof SouthCtdnaJoumalofCardiology,Au~tst2OO0,Vol6,No.3 apoptoticrelatedgeneexpressionwerefoundinthetwo groupsincludep53,bcl一2/bax.ConclusionThesepre— limnaaryfindingssuggestthatLPRLIpreventsvascularle— sionfom:tationafterballooninjurybyreduc/ngtheexpres— sionsofColImRNAandI(M一1.Inaddition.IPRLI maycontributetoinducetheapoptosisofVSI~IC.|I11ere— su]tsofthisstudysupportthatLPRLIisaveryuseful techniqueincontrollingtheconsUictivevascularremodel— byreductionofvesselconstrictionandinhibiti012ofin— flammatoryreaction.Itshouldattractattentionasapos,si. bleapproachtoreducecoronaryrestenosis. 【Keywords】rVasculariemodelingApoptosisVSNC 血管重塑(vasculariemodeling)是血管受血流动 力学和体液因素的影响使其形态结构和功能发生适 应性改变的过程.血管重塑在再狭窄的发生和发展 中起重要作用.低强度红激光照射(LowPowerRed IdserIrradiation,IPRLI)在球囊成形术后通过抑制病 理性重塑来预防再狭窄的发生已被大量临床研究和 实验研究所证实,本文在充分肯定LPRLI这一序效 的基础上,试图从IPRLI对血管损伤后所发生的非 特异性炎症反应,胶原代谢,VSNC增殖和凋亡等方 面探讨LPRLI影响球囊成形术后血管重塑的可能机 制 材料与方法 1.实验动物处理与取材:雄性新西兰白兔100 只,随机分为单纯球囊拉伤组和球囊拉伤+激光照 射组,每组按实验终点(3天,I周,2周,4周,8周) 的不同随机分为5个亚组,从术前1周开始给予高 脂饮食至实验终点.用PIcA球囊导管拉伤右髂动 脉和腹主动脉各20into,建立动脉粥样硬化兔的血 管损伤模型.激光照射组于球囊拉伤后应用C1obal Therapeutic公司生产的激光球囊导管(1aserballoon 3.0x如mm)和激光发生器(He.Nelaser)经光导纤维 向血管内导人低强度红激光,对损伤血管进行局部 照射,激光发生器输出功率l0mw,照射时间ln x3次,每次间隔1min,光斑面积1.884c,能量密 度0.9J/?.于各实验终点处死动物,留取拉伤段 腹主动脉和邻近正常血管. 2.损伤血管I型胶原(collagentypeI,c0lI)基 因表达的检测:?血管总RNA的提取:提取试剂盒 为QIAGEN公司产品,具体步骤省略;?逆转录多聚 酶链式反应(RT-PCR):参考有关文献_】合成本实验 所用基因引物序列(见附表).逆转录及扩增条件为 6ooc逆转录如min一94oc1miI1—55oc1m一72oc 1min,共39个循环,最后一次循环在72oc停留7 rain,以保证引物继续延伸.反应完毕取反应产物行 1.5%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE),在凝胶成像分析 仪中观察分析. 附表RT—PCR靶基因引物序列 3.损伤血管细胞问黏附分子(ICAI~I一1)表达的 检测:损伤血管I?m一1表达的检测采用免疫组织化 学.LSL~B法,试剂盒为丹麦DAKO公司产品.第一 抗体的稀释滴度为1:5?对照切片包括以正常兔 I代替第一抗体进行孵育的替代对照和不加第一 抗体的空白对照.ICAN.1的检测结果根据染色强 度进行积分:?0分,即细胞中无棕色的ICAN一1颗 粒;?1分,阳性细胞数?25%;?2分,阳性细胞数 26%一50%;?3分,阳性细胞数51%75%;?4 分,阳性细胞数>75%. 4.VSI~IC凋亡及其凋亡相关基因的检测:采用 末端转移酶介导的dIJTP切VI末端标记法,试剂盒 为德国BochringerNannheim公司产品.用免疫组织 岭南心血管病杂志200O午8月第6卷第3期 化学.LSAB法检测p53,bc1.2/b,~x三个凋亡相关基 因,方法同上. 5.统计学处理:所有数据均均数?标准差表 示.两组数据之间的比较用检验,ICAM.1免疫组 织化学检测结果的比较用秩和检验,P<0.05为差 异具有显着性. 结果 1.损伤血管I型胶原mRNA表达的动态变化: 本研究用RT-PCR法观察了血管损伤后第3天至第 8周ColImRNA的变化,结果术后3天,两组均可见 到ColImRNA的表达,但无统计学意义[(1I4?24) cpmw(118-t-11)epm,P>005].术后第1—4周, ColImRNA的表达LPRLI组明显低于对照组[(760 ?1I9)cpmw(879?121)cpm,P<0.05;(1120? 300)epm(I409?297)epm,P<0.05;(918?180) epm(1109-t-117)cpm,P(0.05].第8周,其表 达开始减弱,组间无统计学差异(P>0,05),见表1. 表I不同时间ColImRNA的表达(RT-PCR法 注:数据表示经凝胶分析仪校正后的光密度值(cpm). 2.损伤血管IcAM.1表达的检测结果:用免疫 组织化学.LSAB法检测发现,血管损伤术后3天即 可看到ICAM.1在血管内膜的微弱表达,但LPRLI组 明显低于对照组(0.90?0.481.79?0.9I,P< 0.05).第1周到第4周,LPRLI组的IC~/I.1虽然逐 渐增强,但仍然显着低于对照组(1.41?0.89vs3.46 ?1.57,P<001;2.60?0.9I讲3.5I?0.99,P< 0.05;2.31?1.00椰2.57?1.20,P<0.05).并司 见到血管外膜明显表达ICAM.1,LPRLI组位于外膜 的IC~,i.1的表达受到明显抑制.术后第8周,两组 表达均显着减少,组问无统计学差异(P>0.05),见 表2. 3.删对VSMC凋亡的影响:在光学显微镜 下,对凋亡细胞(TUNEL阳性细胞)进行记数,分别 记数血管中膜和内膜细胞凋亡指数(apoptosis 表2不同时间ICAM-1免疫组织化学检测结果 注:数据表示阳性细胞数积分. index).每张切片记数200个以上的细胞,每个标本 观察4张切片,取其平均值.细胞凋亡指数=凋亡 细胞数/记数细胞总数×100%.镜下可见凋亡细胞 的细胞核呈蓝紫色,均匀致密.损伤术后3天至1 周凋亡指数两组间无显着性差异.术后第2周和第 4周激光照射组凋亡指数显着增加(51?1929? 11.P<0.01;36?1226?8,P<0.05)第8周逐 渐减少,组间无统计学意义.免疫组织化学.LSAB 法检测p53,bel-2/bax基因表达,两组问无统计学意 义.见表3. 表3不同时间,Mc凋亡检测结果{‘IXlm~法 注:数据表示VSMC掏亡指数. 许多学者认为再狭窄的过程是一个血管损伤反 应的新生内膜增生与血管重塑的过程.血管内超声 研究表明,PI?A术后的再狭窄30%与新生内膜增 生有关,而70%则与血管重塑有关.cuej的研 究发现如果代偿性扩张动脉和无代偿性扩张动脉发 生等量的内膜增生,内弹力板下内径代偿性增生 10%,而最终的管腔内径将增加108%,显然血管内 径或面积较小的变化可导致管腔内径较大的变化, 这足说明血管重塑对再狭窄的影响.引起血管重 塑的机制并不清楚,一些研究认为血管剪切应力,细 胞外基质,血管外膜的挛缩,VSMC的过度增殖是血 管病理性重塑的主要原因.本研究从胶原代谢,血 管损伤后的炎症反应,VSMC凋亡三方面探讨了 LPRLI对血管损伤后的病理性重塑的影响. 血管损伤便导致了胶原组织的破坏和非特异性 炎症反应,胶原酶,基质金属蛋白酶(MMP$)活性增 加,导致原有基质发生降解,细胞外纤维连接蛋白沉 积,在损伤部位由成纤维细胞,VSMC等侵入病变区 产生了大量的基质成分,出现胶原纤维的交互连结, 在这种原有基质成分降解和新的基质成分沉积的过 程中便发生了血管重塑.细胞外基质的成分十分复 杂,作用各不相同,胶原是其中最主要的成分之一, 主要为I型,?型胶原,占胶原总量的80%,9o%, 而I型胶原又占其中的8o%,本文选择I型胶原用 RT-PCR法观察了LPRLI对球囊损伤术后不同时间 点胶原代谢的影响.我们发现从球囊损伤术后第1 周开始,对照组ColImRNA的表达逐渐增强,而激 光照射组的ColImRNA的表达逐渐减弱,说明一定 剂量的LPRLI局部照射可以抑制ColI的合成,此途 径可能是其抑制病理性血管重塑的机制之一. LPRLI对胶原代谢的影响离体实验研究较多,且对 照射剂量的要求较高,不同的剂量将产生不同的甚 至是相反的效果,因此,检测ColImRNA的表达量 也是判定LPRLI疗效以及疗效与照射剂量之间关系 的可靠指标之一.过去的观察指标是通过测定组织 羟脯氨酸含量来间接估计胶原含量的变化,比较粗 浅. 在血管球囊成形术的损伤过程中,单核细胞在 内皮细胞上的黏附和聚集是再狭窄早期的重要病理 变化.黏附分子是单核细胞与内皮细胞黏附和相互 作用的物质基础.正常血管内皮细胞不表达细胞间 黏附分子或微量表达L3J,但是在动脉粥样硬化病灶 可见ICAM一1表达明显增加.有关ICAM一1与再狭窄 关系的研究报道较少,由于LPRLI可以抑制炎症反 应,我们设想LPRLI预防再狭窄是否是通过抑制炎 症反应来实现的,因此,本文用免疫组织化学方法观 察了血管损伤后不同时期ICAM一1的表达,发现 LPRLI的确可以抑制其表达,最终结果可以抑制 VSMC的增殖和迁移,减少胶原等基质的合成,从而 减少病理性重塑,成为LPRLI预防再狭窄的又一机 制. Kaule等_4报道,附壁活化的白细胞产物可使猴 动脉粥样硬化的血管收缩,附壁的白细胞可释放氧 自由基,使EDRF/NO失活,白细胞膜上有ADP酶, 可使ADP降解.由于ADP可刺激内皮细胞释放 EDHFO,所以,ADP酶影响EDRF/NO的释放,因 此,可以推坝IICAM一1的过度表达会导致内皮功能的 损害,LPRLI作用的结果应当可以通过抑制ICAM.1 ~2KlthCtmmJournalofCarchology,hug0st2000,Vol6,No3 的表达来减少内源性EDRnO的破坏,从而改善 内皮功能率研究还观察到单纯拉伤组除了位于内 膜的内皮细胞和VSMC表达ICAM.1外,损伤的血管 外膜也明显表达ICAM.1,且呈强阳性.Scott等_5l5用 BrdU(5-brcmo.2.deoxyufidine)和a-smoothmuscleactin 双标记法证实增殖的外膜细胞约(43.14-33)%可 迁移到内膜,这些源于外膜的增殖细胞的性质是肌 成纤维细胞.如果能够抑制这些细胞表达黏附分 子,就可以减少炎症反应,减少新生外膜形成和外膜 纤维化,因为,新生外膜不仅限制了血管的代偿性扩 张,而且可造成损伤节段的挛缩,所以,LPRLI可能 通过这一途径减少了血管损伤后期管径的丧失.可 见,LPRLI通过抑制炎症反应可以有效地减少损伤 血管的病理性重塑. 我们也观察了VSMC的凋亡情况,发现术后第 2,4周LPRIA组凋亡指数较对照组明显增加(P< O05;),其余各实验终点组问无统计学差异.第8周 两组凋亡指数均下降.p53,bc1.2/bax三个凋亡相关 基因免疫组织化学检测组间无统计学意义.随着凋 亡研究的不断深入,人们发现细胞凋亡是在一定的 生理或病理情况下,机体为维护内环境的稳定.通过 基因调控使细胞程序性死亡的过程.LPRLI如能诱 导VSMC凋亡对再狭窄的防治必将产生积极的影 响,有可能成为LPRLI预防再狭窄的机制之一.凋 亡的发生需要外源性信号诱导和内源性基因调控. r玎,IFN.,IL-I~]等细胞因子可诱导VSMC凋亡, 而由细胞因子介导的VSMC凋亡分NO依赖性和非 NO依赖性两种途径,炎性细胞诱导的VSMC凋亡可 激活不同的信号途径,其中L-Arg/NOS途径可能是 最初的触发途径,基因敲除技术和转基因技术均证 明了这一点_6_7J,并且发现此途径是由p53基因调 控,其跨膜信号转导并不依赖cGMP.根据本研究的 结果,INOS,p53均未参与此途径,可见LPRLI诱导 VSMC罚亡的机制尚需进一步研究,是否非NO依赖 性途径尚难以定论,因为,Koglin等_6J认为机体内环 境的DH值,氧化还原反应等决定了NO的各种各样 的生物学特性,也许炎症反应本身会改变NO的生 物学特性.我们的理解是由于LPRLI抑制了炎症反 应过程,通过这一途径诱导VSMC凋亡的可能性不 大,LPRLI是否直接作用于VSMC而诱发其凋亡尚 需更深入的研究. (下转第171页) 峙南心血管病杂志2OOO年8月第6卷第3期 表2心电圈活动平板运动负荷试验异常模糊 聚类分析结果和冠状动脉造影结果对比 叶斯理论或判别函数诊断分析冠心病的心肌缺血的 程度,这些方法使正常和异常有一明显的分界线. 实际上,心肌影像本身和各因素变量(x;)具有从轻 度到重度的分级倾向,而冠心病的心肌缺血的程度 也可视为从轻度到重度的连续变化过程l4..而且, 受空间分辨率的影响,心肌的影像具有一定的模糊 性.应用模糊聚类分析的方法将Tc.NIBI心肌显 像负荷试验异常结果分成轻,中,重,通过与冠状动 脉造影结果对照分析表明,本方法与仅把心肌显像 分为缺血和正常相比能更好地反映冠状动脉病变的 程度 本方法结合多个变量进行分析,通过的方 法量化分析,而判定每个变量是否正常则不根据绝 对分界线,而是通过隶属度的梯度变化来反映各变 (上接第198页) 参考文献 1Pl8cbjrM,DoemerA,Re~nppisA,eta1.Differentialmy— oeantialabImofc0?呼ntypeIandtype?in dilatedeardiomyol~thy:etfeets0fmyoea,dialil’ltlolnnl~on. 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