2006-新型重组人血小板生成素 干细胞因子的研究（学位论文）

2006-新型重组人血小板生成素 干细胞因子的研究（学位） 【篇名】新型重组人血小板生成素/干细胞因子的研究 【作者】臧宇辉 【学位类型】博士 【授予单位】南京大学, 【导师】秦浚川 【年份】2006. 【页数】 【摘要】血小板是参与凝血作用的关键成分。造血干细胞经过逐步分化成为巨核系定向祖细胞，然后再分化为成熟的巨核细胞，最后裂解产生血小板。血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)是调节巨核细胞分化、增殖、产生血小板的最重要的细胞因子。干细胞因子(Stem Cell Factor，SCF，也称Kit配体，Steel因子等)是一种多功能细胞因子，能在多级造血水平与其他细胞因子协同作用促进造血干/祖细胞及各系血细胞的存活和增殖。目前已进入临床试验的TPO重组蛋白虽然能快速有效地提高体内血小板的水平，但血小板稳定的时间不长，效果不理想，并有引发血栓的倾向，限制了使用范围。造成上述现象的一个重要原因是作为巨核细胞来源的造血干/祖细胞增殖速度太慢而巨核细胞的成熟分化过快。因此促进造血干/祖细胞增殖将有利于巨核细胞的产生和血小板的稳定升高。虽然SCF单独使用时对巨核细胞的生成和分化没有作用，但是SCF能与TPO协同作用增强其促进造血干/祖细胞及巨核细胞的存活、增殖和分化。因此，TPO与SCF的联合应用将有助于巨核细胞和血小板的生成，防止由于造血干组细胞不足而影响血小板水平的稳定。我们通过计算机辅助，构建了一种新型的TPO与SCF融合蛋白，探索其促血小板生成活性，为寻求适合临床应用的稳定有效的升血小板药物探索新途径。 本论文通过计算机同源模建的方法构建了TPO和SCF受体的配体结合区的三维构象，并模建了TPO与SCF通过连接肽以不同方式融合的空间结构，以及融合蛋白和受体结合的空间模型。在此基础上我们应用DNA重组技术构建了含有人TPO的1-157位氨基酸、16个氨基酸的连接肽(GGGGSPGGSGGGGSGG)和人SCF的1-145位氨基酸编码序列的TPO/SCF融合基因片段。 我们分别尝试了用昆虫杆状病毒和大肠杆菌两种达系统进行TPO/SCF融合蛋白的表达和纯化。pET28a—TPO/SCF在大肠杆菌中表达量仅占菌体总蛋白的6,左右，在与分子伴侣蛋白TF和GroEL/GroES共表达时，可溶性表达rhTPO/SCF的比例可以提高6倍左右。经Western Blotting验证，分子量与预期一致，通过DEAE Sepharose和Ni离子金属鳌和柱两步层析得到纯度大于90,的纯品。pET32a—TSH在大肠杆菌中的表达量可以占到菌体总蛋白的20,左右，但是表达产物主要以包含体形式存在。Western Blotting的结果显示可溶性表达的融合蛋白易发生降解。分离包含体蛋白，用8M尿素溶解变性后上样于DEAE Sepharose层析柱，通过梯度洗脱进行柱上复性。测活结果显示，复性后的融合蛋白对红系白血病细胞依赖株TF1和巨核系白血病细胞依赖株Mo7e均有促增殖活性。 将融合基因克隆到昆虫杆状病毒转移载体pAcSecG2T，并与AcNPV DNA共转染Sf9细胞，经胞内同源重组和4轮有限稀释法筛选并结合TF-1细胞增殖法测活选出重组病毒AcNPV—rhTPO/SCF。重组病毒感染Sf9细胞后表达的rhTPO/SCF经两次Glutathione Sephrose4B亲和柱层析和凝血酶切割，获得了纯度达90,的纯品。 选取红系白血病细胞依赖株TF1和巨核系白血病细胞依赖株Mo7e作为模型，用于检测融合蛋白的生物活性。TF-1细胞增殖实验显示大肠杆菌表达的rhTPO/SCF的比活为7.0×106units/μ mol，是E(coli来源的单体rhSCF参照品比活的1.2倍左右。Mo7e细胞增殖实验显示rhTPO/SCF的比活为2.9×107units/μmol，是单体rhTPO比活的1.7倍。在软琼脂法测定人外周血CD34+细胞形成巨核细胞集落的能力的实验中，rhTPO/SCF促巨核细胞集落形成的能力与TPO和SCF联合使用的效果相当，而比单独使用TPO有显著的增加。 通过凝胶阻滞(EMSA)实验，我们初步研究了rhTPO/SCF在Mo7e细胞的信号传导中增强信号转导蛋白STAT5磷酸化程度，上调其转录调控功能的作用。结果表明在Mo7e细胞中，rhTPO/SCF 激活STAT5蛋白，上调STAT5与靶基因的转录调控序列结合的能力比单独使用TPO相比明显增加，而TPO和SCF联合使用的效果相当。通过半定量的RT—PCR反应，证实了rhTPO/SCF诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(Cdk Inhibitors)p21表达的能力较rhTPO有明显增强，表明rhTPO/SCF可能具有较强的促巨核细胞分化的功能。 【DOI】