酿酒酵母全细胞催化合成脱氧腺苷三磷酸研究（可编辑）

酿酒酵母全细胞催化合成脱氧腺苷三磷酸研究（可编辑） 酿酒酵母全细胞催化合成脱氧腺苷三磷酸研究 onthewhole―cell for Study biocatalysis deoxyadenosine Sacch cerevisiae by aromyces ADissertationto Submitted of UniversityTechnology Nanjing in fulfillmentofthe partial requirements forthe of degree MasterOf Engineering By Yuelan鼢D ieYING Supervisor:Prof(Hanj 2010 May 硕士学位论文 摘 要 脱氧核苷三磷酸是各种脱氧核糖核酸 DNA 聚合酶促反应的底物，是DNA Chain Reaction， 序列、基因分析、定点突变、聚合酶链式反应 Polymerase 低分子量生物有机分子。目前主要用于临床医学上的干细胞和心脑血管修复、医 学诊断上的DNA 脱氧核糖核酸 基因鉴定。生物技术的快速发展及PCR在我 国和欧美发达国家的广泛应用带动了对脱氧核苷三磷酸系列产品需求的迅速增 长，产品市场前景非常广阔。 本文对酿酒酵母全细胞催化合成脱氧腺苷三磷酸的作用机制进行了探讨，主 要从以下三个方面进行了研究: cerevisiaeAs2(398 全 1、dATP合成通量分析初探。初步探讨酿酒酵母 S 细胞催化合成dATP的反应机理，通过简化dATP生物合成的代谢网络模型，利 代谢通量分布结果显示:在初步实用通量平衡分析计算实验代谢通量分布。 验条 件下，由于缺乏足够的NAD+，同时由于丙酮酸激酶活性不高，在dATP累积过 程中生成大量的甘油，37,碳流流向甘油，使得ATP再生过程受阻。ATP低再 生效率导致dAMP磷酸化受到限制，从而使产物dATP合成受到限制。 2、dATP合成工艺优化。在酿酒酵母磷酸化合成dATP的代谢流分布初探基 础上，研究几种主要小分子物质、底物以及pH等对酿酒酵母合成dATP的影 响。 通过适宜浓度M92+激活一系列糖酵解关键酶;适宜浓度K+激活PK;适宜浓度 对细胞内乙醛外流造成的NAD+浓度偏低，导致胞内氧化还原失衡，糖酵解途径 通过外源乙醛的加入解除这种效应，达到减阻通往甘油方向代谢流量受阻， 的效 果。通过析因实验和响应面优化得到最优反应工艺条件，最终dATP得率达到 93(7,，浓度2(10 化前30(7,增加了63(O,，与文献报导的水平60,相比提高了33(7,。 3、优化工艺下dATP合成代谢通量分析。在优化后的反应条件下，测定S cerevisiaeAs2(398合成dATP时的代谢速率，计算出此时的代谢通量分布，并与 优化前代谢通量相互比较。实验结果明，经通量调节后系统内代谢流量发 生明 摘要 显改变，流向甘油的代谢流量从73(5减至12(8，糖酵解ATP释能途径代谢通量 提高了一倍，dATP合成速率得到提高，能量利用效率达到1(8,，是优化前的三 dATP得率和浓度也得到了很大提高。代谢通量分析结果显示，体系中倍， 小分 子物质调节较好地提高了dATP代谢网络中目标代谢流通量，代谢通量的重新分 配对于dATP产率提高具有重要意义。 关键词:脱氧腺苷三磷酸酿酒酵母代谢通量分析糖酵解途径 II 硕士学位论文 ABSTRACT is thesubstrateof all kindsof Deoxyribonucleoside triphosphate it is the deoxyribonucleicacid DNA polymerasereaction，also bio-organic moleculeswithlow-molecularusedinDNA weight sequence analysis， geneanalysis， site―directed Chain mutagenesis，PolymeraseReaction PCR ， reversetranscription DNA is PCR RT-PCR ，reverse transcription， andlabelingreaction(Currently,it usedinstemcellsandcardio―cerebrovascularin theDNA mainly repairingclinic，and identificationinmedical of andPCR gene diagnosis(Thedevelopmentbiotechnology inChinaand countriesleadstothe inthedemandof European rapidgrowth has market deoxyribonucleosidetriphosphate，whichbright prospects( Inthis ofwhole-cell for paper,theprocess biocatalysisdeoxyadenosine cerevisiaewas the bySaccharomyces studied，and triphosphate dATP production mainresultsweredescribedasfollows: 1、Thereactionmechanismsof deoxyadenosine networkmodel S(cerevisiaewas themetabolic by investigated(Throughsimplifying flux werecalculated ofdATP distribution using biosynthesis，experiments’metabolic showedthat: Under fluxbalance resultsofmetabolicfluxdistribution analysis(The theinitial thelackof the conditions，because NAD+，and experimental adequate of was inthe of kinasewasnot lot activitypyruvate highenough，aglyceringenerated ofdATP thecarbonflowof wasabout process accumulating，and glycerolpathway ATP 3 meantthattheATP wasblocked(Thelow of 7,，which regeneration efficiency ledtothelimitionofdAMP thatthe of regeneration phosphorylation，SOsynthesis dATPwaslimited( 2、Onthe ofmetabolicflux effectsof understanding distribution，the preliminary small―molecule dATP were investigated( effectors，substrate，pH，etc(onproduction concentrationof usedtoactivatethe of Adequate M92+was keyenzymesglycolysis( theinhibitionofthePFKcaused ATP And usedtoremove NH4+was byhigh thefluxofdATP ofthelow increase addition，because concentration，to production(In ABSTRACT the ofintracellular redox NAD+concentrationcaused outflow acetaldehyde，the by imbalancewas wasblocked(Theadditionof imbalanced，andglycolyticpathway thefluxof canremovethis reduce effect，and flow,furtherly acetaldehyde glycerol increasethefluxof andATP fractional glycolysis regenerationefficiency(Through factorial and surface andconcentrationof designresponse experiments，theyield reached 2(10 was dATP 93(7,and yield nearly63, higher g,L(respectively(The level thanthelevel thanthe before 33(7,higher reported(In optimization(and three―fold( concentrationafter increased addition，the optimizationnearly 3、Underthe metabolicrateofvariousmetabolites condition，the optimal during fluxdistributionwascalculated( dATP was themetabolic synthesisdetermined，then Afterflux flowof reducedto12(8from the regulation，theglycerol 73(5， and pathway fluxofATP alsoincreased regenerationpathway nearly ofmetabolic withinthe rateofdATP flow pathways systemchanged(Ultimately,the was the utilization reached synthesisimproved，andenergy efficiency 1(8,，which increasedtwo―foldthanbefore(Andthe andconcentrationofdATP yield relatively increased(Metabolicflux showedthatthe ofsmall― molecule analysis regulation effectorsinthe increasedthe metabolicfluxindATPmetabolic system target network， whoseredistributionofmetabolicfluxis fordATP important production(( cerevisiae; KEYWORDS:Deoxyribonucleosidetriphosphate;Saccharomyces Metabolicflux analysis;Glycolysis 硕士学位论文 目 录 摘要………………………………………………………………一I ABSTRACT…………………………………………………………………………i 第一章文献综述……………………………………………………………(1 1(1 dATP的性质及用途………………………………………………………(1 1(1(1 dATP的结构及理化性质……………………………………………1 1(1(2生物学功 能…………………………………………………………(1 1(1(3医学用途……………………………………………………………(1 1(2 dATP的生理合成途径及关键酶系………………………………………(2 1(2(1磷酸果糖激酶………………………………………………………(3 1(2(2丙酮酸激酶…………………………………………………………(3 1(2(3腺苷酸激酶…………………………………………………………(4 1(2(4核苷二磷酸激酶……………………………………………………(4 1(3 国内外研究现状及存在问 题………………………………………………4 1(3(1化学合成法…………………………………………………………(4 1(3(2酶法………………………………………………………………………………………(5 1(4基于ATP水平调控的生物催化过程优化………………………………一6 1(5代谢通量分 析………………………………………………………………8 1(5(1代谢通量分析………………………………………………………(8 1(5(2代谢通量分析的意 义………………………………………………lO 1(6本课题主要研究难点与内 容……………………………………………(10 1(6(1本课题主要技术难点………………………………………………10 1(6(2本课题主要研究内容………………………………………………11 第二章 实验材料与方法…………………………………………((12 2(1 实验材料与仪 器…………………………………………………………(12 目 录 2(1(1菌株与培养…………………………………………………………12 2(1(2试剂与仪器…………………………………………………………12 2(2实验方法…………………………………………………………………(14 2(2(1无机磷的检测方法…………………………………………………14 5 2(2(2葡萄糖的检测方法…………………………………………………1 2(2(3有机酸的测 定………………………………………………………16 2(2(4反应液中乙醇、甘油的测定………………………………………16 2(2(5 2(2(6 6(磷酸葡萄糖 G(6(P 和6(磷酸果糖 F(6(P 的酶法 测定…(17 2(2(7 9 FBP的酶法测 定……………………………………………………1 第三章 酿酒酵母全细胞催化合成dATP的初探及通量分析………21 3(1 前言……………………………………………………………………………………………一21 3(2实验部 分…………………………………………………………………(21 3(2(1实验材料与仪 器……………………………………………………21 3(2(2实验方法……………………………………………………………21 3(3 dATP的合成代谢网络简化………………………………………………22 3(4代谢模型的建 立…………………………………………………………(24 3(5 dATP合成的代谢通量分析………………………………………………25 3(6本章小 结…………………………………………………………………(29 第四章酿酒酵母全细胞催化合成dATP的优化…………………(30 4(1 前言…………………………………………………………………………………30 4(2实验部 分…………………………………………………………………(30 4(2(1 实验材料与仪 器……………………………………………………30 4(2(2 实验方法……………………………………………………………3l 4(3 dATP合成的影响因素……………………………………………………33 4(3(1 底物dAMP对酿酒酵母合成dATP的影响………………………33 4(3(2底物葡萄糖对酿酒酵母合成dATP的影响………………………34 4(3(3 酵母加量对酿酒酵母合成dATP的影响…………………………35 4(3(4M92+对酿酒酵母合成dATP的影响………………………………35 硕士学位论文 4(3(5K+对酿酒酵母合成dATP的影响…………………………………36 4(3(6磷酸二氢钠缓冲体系对酿酒酵母合成dATP的影响……………37 4(3(7NH4+对酿酒酵母合成dATP的影响………………………………38 4(3(8 乙醛对酿酒酵母合成dATP的影响………………………………39 4(3(9pH值对酿酒酵母合成dATP的影响……………………………((40 4(4 dATP合成的过程优化…………………………………………………… 4l 4(4(1 析因法优化工艺条 件…………………………………………41 4(4(2响应面设计优化工艺条 件…………………………………………43 4(5本章小 结…………………………………………………………………(45 第五章优化后的dATP代谢通量…………………………………47 5(1 前言………………………………………………………………………(47 5(2实验部 分…………………………………………………………………(47 5(2(1 实验仪器与材 料……………………………………………………47 5(2(2实验方法……………………………………………………………47 5(3优化前后的代谢通量比 较………………………………………………(48 5(4通量调节的效 果………………………………………………………((50 5(5 本章小 结…………………………………………………………………51 第六章结论与展望…………………………………………………((52 6(1 结论………………………………………………………………………………………………52 6(2展望……………………………………………………………………………………………一53 参考文献……………………………………………………………54 附 录…………………………………………………………………………((63 成果………………………………………………………………64 硕士学位论文 第一章文献综述 1(1 dATP的性质及用途 1(1(1 dATP的结构及理化性质 脱氧腺苷三磷酸，英文名:2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate，Deoxyadenosine CloHl6Ns012P3;分子量:491(2g,mol;最大吸收波长:259am;纯净的 dATP为 白色或类白色粉末或晶体。其结构式如图1(1所示。 N 《 N ? 几 卜― 。(苫 oic卜IoH H 图1(1脱氧腺苷三磷酸的结构式 Thestructureof山,TP Fig(1??1 1(1(2生物学功能 脱氧核糖核苷酸是DNA合成底物，DNA前体受到脱氧核苷三磷酸 dNTP 生物合成过程中酶异构效应的控制，同时受到编码这些酶的基因表达调控[1】。胞 内dNTP影响各种细胞功能如细胞生长、DNA复制速率、免疫活性、细胞分化、 染色体稳定性、自发和诱导变异性【7】。细胞正常生长必需保持dNTP适当比例。 dNTP库 胞内游离脱氧核苷三磷酸的含量 平衡对维持体内遗传稳定具有重要 作用，四种常见dNTP不仅只是简单地作为细胞内DNA合成前体，其供应还 与 突变剂的致突效应有密切关系【3】。迄今为止观察到的因dNTP库水平变化而引发 的遗传效应包括细胞死亡、突变、重组、对DNA损伤因子敏感性增强、染色体 断裂、脆性位点增加、互换等 、致畸、胞转化以及辅助致癌等【4】。 异常 1(1(3医学用途 脱氧核苷三磷酸是构成细胞、反映细胞特质的基本物质，是人工合成DNA 的必备前体原料。人工合成的DNA片段，广泛应用于基因工程、分子生物学、 l 第一章文献综述 生命科学、基因药物等方面，医药市场对dNTP的需求每年稳定增长【5’6]。dNTP 是各种DNA聚合酶促反应的底物，是DNA序列分析、基因分析、定点突变、 PCR、RT(PCR、反转录和DNA标记反应不可缺少的低分子量生物有机分子【7母】。 现代分子生物学、生物化学和现代生物医学研究已将DNA序列分析、定点突变、 PCR及DNA芯片技术作为一种技术手段。PCR技术具有操作简单应用广泛等特 广泛用于研究和商业应用，如基因分子克隆、蛋白质工程、生物医药研点， 发、 遗传和传染性疾病诊断、法医鉴定、亲子检定等领域[101。DNA合成和转录的DNA 聚合反应，是以dNTP为DNA亚基【11，12J。目前脱氧核苷三磷酸主要用于临床医 学上的干细胞和心脑血管修复以及医学诊断上的DNA基因鉴定。 1(2 dATP的生理合成途径及关键酶系 除少数RNA病毒外，DNA是绝大多数生物的遗传物质。生物的生长和繁殖 首先需要合成DNA。大多数生物通过核糖核苷酸还原酶催化核糖核苷酸中核糖 上C2位的羟基还原成氢，生成脱氧核糖核苷酸[131。这一还原作用多数生物是在 二磷酸核苷酸 NDP 水平上进行，少数生物在三磷酸核苷酸 NTP 水平上进 行[14。81。核糖核苷酸还原酶是生物体内唯一将核糖核苷酸催化生成脱氧核糖核苷 酸的酶，通过酶本身的变构作用与4种结构不同的核糖核苷酸底物 ADP、GDP、 CDP或UDP 作用，生成4种相应的脱氧核糖核苷三磷酸dNTPsCl9】。 以dAMP为底物，在酵母体内超量合成dATP，其生物合成途径主要由两部 径如图1(2所示。 在厌氧条件下，糖酵解途径作为ATP再生体系存在，可以将一分子葡萄糖 降解为两分子乙醇，产生两分子ATP。dATP合成体系需要两分子ATP用于磷酸 化，生成一分子dATP。通过将ATP再生和利用与dAMP磷酸化相耦联，才能有 效地合成dATP。大量研究数据显示，ATP再生途径主要有两个限速步骤，分别 为磷酸果糖激酶催化的反应和丙酮酸激酶催化的反应;催化dATP磷酸化合成的 酶分别为腺苷酸激酶和核苷二磷酸激酶。 2 硕士学位论文 图1-2酵母内dATP的生物合成途径 The ofdATPin Fig(1―2 biosynthesispmhway s(cerevisiae 1(2(1 磷酸果糖激酶【20】 酿酒酵母产生的磷酸果糖激酶是一个变构酶，相对分子质量为835000，催 化效率很低，糖酵解的速率严格地依赖着该酶的活力水平【2l】。磷酸果糖激酶作用 时需要K+、M92+的参与，在ATP存在下，将果糖(6(磷酸转化为果糖(1，(二磷酸 6 并生成ADP。ADP、果糖(2，6(二磷酸、铵离子激活磷酸果糖激酶，也被AMP和 磷酸盐协同激活，同时ATP和柠檬酸对该酶具有强烈的抑制作用。高浓度ATP 会使该酶与底物果糖(6(磷酸结合，曲线从双曲线形变为S型。柠檬酸通过加强 ATP的抑制效应来抑制磷酸果糖激酶的活性，从而使糖酵解过程减慢。该酶的最 适温度为250C，最适pH为7。 1(2(2 丙酮酸激酶[22】 酿酒酵母中的丙酮酸激酶也是一个变构酶，相对分子质量为250000，由四 个相对分子质量为55000的亚基构成四聚体[211。丙酮酸激酶催化作用时需要K+、 第一章文献综述 式丙酮酸对该酶都有激活作用[231，ATP、长链脂肪酸、乙酰(CoA、丙酮酸对该酶 都有抑制作用。该酶的最适温度为30。C。它控制着丙酮酸的外流量。果糖(1，6一 二磷酸对丙酮酸激酶的激活作用，使糖酵解过程的反应中间物能够顺利地往下一 步进行反应。当能量贮存足够时，ATP对丙酮酸激酶的变构抑制效应使糖酵解过 程减慢[2l】。 1(2(3腺苷酸激酶【24J 酿酒酵母的腺苷酸激酶是一种单体酶，相对分子质量为41000，该酶的最适 化腺苷酸 AMP 磷酸化生成腺苷二磷酸 ADP ，脱氧腺苷酸也可以作为底物。 已知在肝脏、肾脏、微生物中都存在此酶。腺苷酸激酶催化在过程中需要有M92+ 存在。2(硝基苯甲酸对此酶有抑制作用[24,25]，NaCl对此酶有激活作用五。 1(2(4核苷二磷酸激酶? 酿酒酵母的核苷二磷酸激酶相对分子质量为70000左右，由四个 17000,18000的亚基组成L2 7|。该酶的最适温度为370C，最适pH为6(0,9(0。核 苷二磷酸激酶参与DNA和RNA代谢，能催化核苷二磷酸生成相应的核苷三磷 酸。核糖核苷二磷酸激酶基因在进化中高度保守，却又呈现复杂多样的生物学功 能。核苷二磷酸激酶除了催化ATP和核苷二磷酸之间高能磷酸基团的转移外， 还具有NDP激酶活性和蛋白磷酸转移酶活性，并参与转录调控和信号转导。核 苷二磷酸激酶催化作用时需要有M92+或Mn2+存在。 1(3 国内外研究现状及存在问题 1(3(1化学合成法 商业上主要通过化学方法生产dNTP，反应是以dNMP相应的三丁基铵盐和 正磷酸为底物，以二环己基碳二亚胺 DCC 为催化剂，在吡啶或者二甲基酰胺 生成较多副产物如脱氧核苷四磷酸或五磷酸等。化学合成法所用有机溶剂如吡啶 或者DMF溶剂须经还原、分离、回收。化学合成工艺中产生的废液污染环境， 4 硕士学位论文 副产物多、得率低，成本相对较高。化学合成法反应过程如图1-3所示。 烈脚三丁基铵盐+正磷酸 言蕃囊至等主詈等酬TP 图1(3有机溶剂中dNMP三丁基铵盐和正磷酸合成dNTP ofdATPfromdNMP ammoniumsaltand acid Synthesis Fig(1―3 3-butyl phosphoric in solvents organic 1(3(2酶法 1(3(2(1双酶合成法 从经济和环境因素考虑，目前已出现酶法合成脱氧核苷三磷酸，此法比 化学 方法更具优势。dNTP合成需要两步磷酸化反应，第一步从dNMP生成dNDP， 化实现;第二步磷酸化反应由核苷二磷酸激酶 NDPK 催化。据报道，双酶合 成法dATP得率为30,(57,[29’301。双酶合成法在合成时需要加入纯酶 以及ATP 作为反应原料，生产成本过高。双酶合成法反应过程如图1(4所示。 Deoxynucle0Side―hoSphate diphmosphate j争Deoxynucleo啡side Deoxynucleosidetriphosphate 图1(4使用核苷单磷酸激酶和核苷二磷酸激酶磷酸化dNMP合成 dNTP dNMPdNTP kinase of to nucleoside Fig(1―4Phosphorylation by monophosphate andnucleoside kinase( diphosphate 1(3(2(2核苷酸还原酶法 近年来国内外很多学者展开核苷酸还原酶的研究[16，31，321，也有报道利用核苷 酸还原酶合成dNTP的研究[331，其主要原理是利用核糖核苷酸还原酶将相应的核 苷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸底物上的羟基去除，从而生成相应的脱氧核苷酸、 脱氧核苷二磷酸、脱氧核苷三磷酸。由于核糖核苷酸还原酶类主要来源于细胞提 取或基因克隆表达，限制了应用范围，因此不适合工业化生产。 1(3(2(3动物细胞提酶法 二十世纪60年代科学家用埃利希腹水癌 鼠乳癌之腹腔转移 、再生鼠 肝、 兔骨髓等组织的细胞抽提物进行合成实验。这些特定的组织包含特定的激酶，能 转化脱氧核苷成为相应的脱氧核苷单磷酸、脱氧核苷二磷酸、脱氧核苷三磷酸。 高速冷冻、离心取上清液来制备。反应时动物细胞组织提取物是经过匀浆、 加入 第一章文献综述 51。动物细胞 dAMP，ATP，MgCl2以及组织提取物，dATP得率为30,一50,E34’3 提酶法产物得率低，反应过程中所需特定的激酶在非再生的组织抽提物中很少， 不适合大规模生产。 1(3(2(4基因工程产酶法 了此酶的催化特性。在磷酸供体存在情况下，胸苷酸激酶催化脱氧胸苷酸单磷酸 磷酸化形成脱氧胸苷二磷酸。Bao[7，37,383等人成功将编码四种核苷单磷酸激酶的 基因从ScerevisiaeATCC2610菌株基因组中分离出来，分别为编码腺苷酸激酶 coli URA6以及编码胸苷酸激酶 TK 的CDC8基因。他们将这些基因克隆到E 激酶催化脱氧核苷单磷酸形成脱氧核苷二磷酸;第二步加入从家兔肌肉中提取的 中间产物进一步磷酸化成为dNTP，通过PK作为非特异性的核苷二磷酸激酶， 反应中磷酸烯醇丙酮酸 PEP 是被用作磷酸化供体四，如图1(5。这项研究证 明了基因工程产酶法生产dNTP的可行性，并且建立了一个完整的生物法生产工 艺。基因工程产酶法生产dATP时生产工艺繁琐、生产成本高、dATP得率为60, 匦吵案?―回―紫弋囤 d南kinased矗P dA妥+PEP dATOPVmv ’ , ,, , 1(4基于ATP水平调控的生物催化过程优化 ATP作为一种核苷酸衍生物，在代谢网络中以底物、产物、激活剂或抑制剂 理过程。通过这些复杂的生理过程，ATP参与许多代谢途径和几乎所有工业菌种 硕士学位论文 代谢产物的生产。 随着代谢工程以及基因工程的深入研究，更多研究者开始意识到仅仅在某些 代谢途径中超量表达，删除或导入同源基因无法达到预期目的。糖酵解途径是典 型例子。无氧条件下，在底物水平磷酸化过程中，细胞代谢生长所需的能量主要 在真核[521和原核微生物[53】中，单独或组合超量表由糖酵解途径提供。 达糖酵解 关键酶所编码的基因，不能显著增加糖酵解途径的通量。 周景文等【54】出ATP供求与目标代谢物合成间存在四种类型的关系。有 一种类型是通过ATP供给的强化来促进代谢产物的合成。大部分同化代谢合成 属于这一类型。当ATP供给得到改善，则可能达到工业生物技术中三个最重要 的目标，即最高产物浓度、最高得率和最高生产效率。除此以外，通过ATP 水 平的调节还能够促进底物利用，强化对环境胁迫的抗性等，具体如下: 1 提高目标代谢物的浓度。工业菌株中ATP水平的调控可以进一步提高 目标代谢物浓度，增加生物反应器实用性，并降低随后提取工艺的费用 【55|。以谷 61。直接 胱甘肽 GSH 合成为例，持续和充足的ATP是GSH合成和分泌的关键【5 使用纯ATP补充发酵液可以进一步提高GSH的生产，但此法代价昂贵[5‘71。1978 年以来，研究人员一直在试图构建一个谷胱甘肽生产的耦合体系，即利用能够合 成GSH的大肠杆菌工程菌和高效ATP再生的酿酒酵母种间耦联【57】。通过使用此改 mMp6l。 进的耦合体系，在未补充ATP的情况下，GSH浓度达到了8(92 2 提高生产效率。高生产效率降低了发酵周期、设备成本和能量消耗， 是生物经济增长的有效途径。为实现这一目标，增加中央代谢途径 如糖酵解途 径或柠檬酸循环 碳流量，提高细胞ATP水平，可以提高一些代谢产物的生产 效率。例如，利用Streptococcus 分析表明，细胞生长和HA生产与发酵过程中ATP水平密切相关【58]。通过限定葡 萄糖并增加酵母提取物来增JJHATP的供给，HA的连续生产可以减少花费在重复 清洗生物反应器上的时间，从而提高总生产率【5圳。 3 提高产物得率。用工业菌种生产过程中，许多副产品如乙酸、乳酸和 甘油会分泌到培养液中【60’611，副产物的积累降低了产物得率[62’631， 并增加了生 物过程的成本和对环境的负担【酬。通过调控ATP相关的代谢途径可以减少副产物 的形成。例如，乳酸生产是一种厌氧过程，所有的ATP来自糖酵解[651。乳酸高产 第一章文献综述 的实现是通过增jJHATP的需求，并通过使丙酮酸甲酸裂解酶 矽 基因缺失和限 制氧气来增加糖酵解流量。ATP需求的增加推动了糖酵解的速率，并且抑制了氧 气限制条件下的副产物合成。该法乳酸对葡萄糖的得率提高T72(5,?6J。 4 提高底物利用率。研究证明ATP在底物利用率的两个关键过程中发挥 了重要作用:跨膜运输和底物磷酸化‘67,68】。因此，ATP水平的调控可能是一个提 高底物利用率的有效途径。大多数工业菌株不能有效地利用木糖和阿拉伯糖 作为 hansenii的木糖利用效率，细胞内ATP水平受控于特定的氧吸收速率，产生的最 大木糖醇生产值76(6 g,L【J71]。此外，具有较高ATP产量的酿酒酵母基因工程菌株 可以利用阿拉伯糖作为碳源和能源[_72】。 5 增强细胞对环境胁迫的抗性。在生物过程中，工业菌株可能受到一系 长和代谢功能受到这些胁迫因素的影响。目前研究已确定了一些环境胁迫抗性机 制和特点。在高度环境胁迫下，工业菌株的生长对ATP的需求很高【78】，并且增 加ATP的供应可以很好地促进对胁迫条件的抗性[79，801。然而，大多数研究都集 中于不同胁迫条件下ATP相关机制或现象的描述。调控ATP水平来增强工业 菌 株对抗胁迫条件能力的研究还是很少。 1(5代谢通量分析 1(5(1代谢通量分析 代谢工程是将通量及其控制进行量化的方法与分子生物学技术相结合，进行 定向基因修饰。所以代谢途径及其通量的研究就成为代谢工程的核心内容，代谢 通量分析 MFA 在代谢工程中也处于中心地位。代谢通量分析是利用实验测得 的细胞组成、底物以及产物量和所构建的代谢网络，在拟稳态假设 Pseudo Steady State，PSS 的基础之上，以质量守恒的方法把系统中各个代谢物联系起来，给 出整个网络的代谢流分布，并运用化学计量学方法来研究整个代谢过程[81‘831。这 种方法最大的优点是不需要研究代谢途径中酶的复杂动力学特征就可以得到微 生物代谢过程的重要信息[84]。 代谢通量分析的前提就是拟稳态假设，即假设细胞内的中间代谢物的浓度变 R 硕士学位论文 化速率为0，这样n个中间代谢物即可得到n个关于变化速率的约束条件，假设 选定速率的总数目为J，那么所求问题的自由度为F J(n。这样，只要测得的不 相关的速率的数目不小于自由度F，即可确定整个代谢网络的通量分布。 在考虑到J个胞内代谢反应时，我们可以把化学计量系数写成化学计量系数 矩阵T的形式【851，其中T的行向量是每个反应的化学计量系数，T的列向量则 是每种反应物质的计量系数。T的行向量数量是J，T的列向量数量为N+M+K， 前N列是底物的计量系数，从N+I到N+M列是代谢产物的计量系数，从N+M+1 到N+M+K列是K个胞内代谢物的计量系数。设v表示J个反应通量的向量，r 表示代谢物的变化速率矩阵，rc表示未知变化速率向量，rm表示已知变化速率向 量，在拟稳态的前提下，可以得到这样一个矩阵方程: rc rm :T丁(v:『T1(v 【T2J O 公式 1(1 向量v: V T2,??[苫] 公式。，(2， 最后求得rc: rc。l 1‘V 公式 1(3 由于代谢网络的复杂性，经常会出现建立的方程组存在不唯一解，即出现了 F J(n的情况，所以这种方法也具有一定的局限性。解决办法主要2种:一种是 在测量值中选择一部分数值，使得方程有唯一解，利用这些数值求得方程解，然 后对比参与求解的测量值和它们所对应的计算值，最后验证方程确定方程解。另 外一种是利用统计学的方法分析数据，一般选用最小二乘法来确定最优解。 其中 最小二乘法求解通量方程应用较多。另外，如果J-n F，此时通量方程可能存在 多个解，在这种情况下，如果能够规定一个合适的目标函数，即可通过线性规划 求得唯一解。 代谢通量计算的结果是一幅代谢通量图，通过对比出发菌种和改造菌种或者 相同菌种不同条件下节点的代谢通量，分析代谢途径各个节点出的性质，从而确 第一章文献综述 定了代谢途径中各个不同的控制点，可以有目的的使通量分配于目标产物的支 路，通过对不同控制点的重要性分析，可以比较准确的确定出网络中关键控制点 关键节点 ，这为下一阶段的研究提供了指导作用。 1(5(2代谢通量分析的意义 代谢通量分析能够量化每个途径的通量，提供关于细胞的重要生理特性方面 的更深的洞察力。其意义归纳起来有以下几点: 1 代谢网络节点 分支点 性质的鉴定;通过比较不同操作条件的变化， 不同变异菌株导致的分支点的分配比的变化，对一些重要的节点的柔性和刚性进 行评估。 2 确定胞内的代谢途径;对于许多微生物来说可能不清楚一些具体的反 应路线，那么通过代谢通量分析能够帮助识别几条代替途径并且知道是在不同条 件下产生的。其同样好地重复产生胞外代谢物的宏观通量测定。 3 未测定的胞外通量的计算;有时，能被测得胞外通量的数目小于 计算 未知胞内通量的所需数目。这种情况下，利用先前的试验通量分配比，可以计算 胞外未知的通量。例如各种副产物的产生速率，可用化学计量模型和已知的通量 计算。 4 考察另一些途径对物流分布的影响;从优化代谢产物生成来看，可鉴 别一种或几种物流的限制作用。例如，利用基因重组技术，在菌株中导入定向改 造的基因构建新的微生物生理特性，即为微生物的代谢活动引入新的代谢途径， 检测其是否能消除改造前菌体对目的产物的限制作用。 5 计算最大理论转化率:假设没有菌体生长和多余幅产物，碳源以最大 可能转化为产物，此时的转化率为最大理论转化率。以计量系数为模型，如 果指 定所给约束条件，就可以计算出给定代谢物得最大理论转化率[86】。 1(6本课题主要研究难点与内容 1(6(1本课题主要技术难点 目前国内外dATP得率普遍不高、成本高并且生产工艺繁琐的一个重要原因 在于能量再生和偶联效率低下。在dATP的合成过程中需要消耗大量的能量 10 硕士学位论文 再生体系以糖为底物，通过糖酵解途径 EMP 来实现，该途径是能量再生的最 经济的途径之一，而供体ATP在dATP合成过程中作为磷酸供体和能量而存在。 因此利用酿酒酵母全细胞合成dATP的主要技术难点就在于如何建立一个高效 的能量再生和自偶联体系。在现有技术中，糖通过EMP途径生成ATP的效率很 低，只能维持酵母一般的生命代谢，要加大EMP途径的通量，超量表达底物磷 酸化水平，只有通过基因工程技术或采用化学效应物质改变代谢流的方法来实 采用后者更方便，易于实现。在化学效应物质的调节下，可使EMP途径现， 的 代谢流量发生明显改变，ATP再生的速率也得到很大的提高，当其速率和dATP 合成体系的速率相匹配时，即可实现dATP的高效合成。 1(6(2本课题主要研究内容 本论文以,cerevisiaeAs2(398为研究菌株，以实现dATP高效积累为目标， 在代谢流分析的指导下，就酿酒酵母全细胞催化合成dATP的影响因素及其作用 机制展开研究。主要研究内容包括: 1 初步考察dATP合成条件，建立酿酒酵母全细胞生物催化合成dATP的 代谢网络模型，通过反应的化学计量模型及代谢物的质量平衡关系，由实验测得 的速率计算出代谢通量分布情况，预测网络调控位点，为发酵工艺的进一步优化 提供一定的理论依据和思路; 2 在初步了解dATP积累机制的基础上，考察几种主要的小分子物质、底 物以及pH等对酿酒酵母全细胞催化合成dATP的影响。并进一步通过析因实验 和响应面设计方法优化合成条件; 3 通过合成条件优化，在最优工艺条件下考察酵母全细胞生物催化合成 dATP的情况，计算此时的代谢通量分布，并进行反应前后的通量分布对比， 以 看通量调节的效果。 第二章实验材料与方法 第二章实验材料与方法 2(1实验材料与仪器 2(1(1菌株与培养 2(1(1(1 菌种 本研究所用菌株为,cerevisiaeAs2(398，为实验室保存菌株。 2(1(1(2培养基及培养方法 a(培养基 1 斜面培养基:葡萄糖:50(oo g;酵母膏:5(00g;磷酸二氢钾: 2(00g; 硫酸镁:1(OO g;硫酸铵:2(oog;琼脂:25。00g;蒸馏水:1000mL;pH 6(3。 2 种子培养基:葡萄糖:40(oo g;酵母膏:5(00g;磷酸二氢钾:(00g; 2 硫酸镁:1(oo 6(3。 g;硫酸铵:1(50g;蒸馏水:1000mL;pH b(培养及发酵方法 1 斜面恒温培养:将菌种接于斜面培养基，300C恒温培养36h，然后在 40C下保存备用。 2 种子发酵培养:挑取斜面菌种一环，接入装液量50mL的小三角瓶 250 mL 培养基中30。C下恒温培养72h，摇床速125 rpm。 3 200L大罐种子培养:将小三角瓶摇瓶种子移入100L种子培养基 中 接 种量5, ，300C下恒温培养72h。 2(1(2试剂与仪器 2(1(2(1 主要试剂 本论文中所用到的主要实验试剂列于表2(1。 表2―1主要实验试剂 Tab(2一tCheckofmain list reagent 硕士学位论文 续表2(1 2(1(2(2主要仪器 本论文中所用到的主要实验仪器列于表2-2。 第二章实验材料与方法 表2-2主要实验仪器 Tab(2―2Checklistofmain instrument laboratory 2(2实验方法 2(2(1无机磷的检测方法 2(2(1(1试剂配制 1 3 mol,L的硫酸:量取16mL的浓硫酸，加水定容到100mL; 2 2(5, 钼酸铵:称取2(6546 3 10, mL: g的四水合钼酸铵，用水溶解，并定容到100 的抗坏血酸:称取抗坏血酸10 g，加水溶解，并定容到100mL，放在冰箱保存， 可以使用一个月; 4 (定磷试剂:将3 mol,L的硫酸，水，2(5,钼酸铵，10,的 抗坏血酸按1:2:1:1的比例配制 体积比 ，配制时，按顺序加，当天配制当 天使用，正常颜色呈浅黄绿色;如果呈棕黄色或深绿色，不能使用，可使用一个 燥器内降至室温，精确称取0(2195 mL， g 含磷50mg ，用水溶解，定容至50 测定时，将此溶液稀释100倍，使含磷量为10 gg,mL。 14 硕士学位论文 2(2(1(2无机磷的标准曲线及样品测定 取12支干净的硬质玻璃管，按表2(3加入标准磷溶液，水及定磷试剂，平行 将试管内溶液摇匀后，于450C水浴内保温25分钟，冷却至室温后，作两份。 于660 nm处测定A660值，取两管平均值，以标准磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘 品先稀释500倍，再各取1(0 mL稀释样品，其余操作同标准的测定。测得吸光值， 对照标准曲线或拟合的方程可得无机磷的含量。 表2-3测定无机磷标准曲线的溶液配制 Tab(2―3The of solutionforthestandardcurve preparationinorganicphosphorous 图2(1无机磷测定标准曲线 curve Thestandardof Fig(2―1 inorganicphosphorous 2(2(2葡萄糖的检测方法 发酵液的葡萄糖采用生物传感分析仪进行测定。将发酵液离心，上清液 取适 当稀释度n稀释后测定。稀释原则:稀释度选择使生物传感分析仪的显示 数值N 在100以下的数值。本实验中一般稀释100倍。则葡萄糖浓度Mg g,mL 为: Mg NXn 公式 2-1 15 第二章实验材料与方法 2(2(3有机酸的测定 rain 取 取5mL反应液，加入1mol,LHCl溶液灭活，离心 16，000×g，10 上清液，用去离子水稀释50倍，用HPLC进行有机酸分析。分析条件如下:进 HPX(87H 300HHn×7(8 样量为20此，色谱柱为Aminex mm，9岬 ，流动相为 3 nm。 mmol,L硫酸溶液，流速0(2mL,min，柱温600C，检测波长为210 代谢过程中常见的八种有机酸基本达到基线分离，如图2(2所示。 1(a(酮戊二酸;2(柠檬酸;3一丙酮酸;4(葡萄糖酸; 5一苹果酸;6(琥珀酸;7一乳酸;8一乙酸 图2―2有机酸标准品液相色谱图 The of acidsstandardsolution Fig(2―2 liquidchromatogramorganic 2(2(4反应液中乙醇、甘油的测定 样品制备:取反应液5mL，离心取上清液1mL放入10mL容量瓶，用去 离子水稀释定容，再加入20此二甲亚砜作为内标。 mx0(32mm×1 色谱条件:色谱柱，KR(9 30 gm ;载气， 99(99,N2;汽化 温度，2000C;柱温，1900C;检测，2800C;柱头压，O(05MPa;尾吹，O(11VIPa; 分流比，60:1。 图2(3 硕士学位论文 E 矗 弋 (人k i’ 2 ， 1(乙醇;2。二甲亚砜;3(甘油 图2(3乙醇、甘油的气相色谱图 ethanoland of c11romatogram glycerol Fig(2―3Thegas 2(2(5 dAMP、dADP、dATP的测定 1 液相色谱分析条件 C18 4(6x250 色谱柱为江苏淮阴汉邦科技有限公司Lichrospher mm，5岬 ， mL,min，柱温为室温，检 8磷酸三乙胺溶液 5:95，流速1(0 流动相为甲醇:pH 测波长为254 nm;进样量:10此。 2 标准品溶液及样品溶液的制备 精确称取dAMP，dADP，dATP的标准品，用缓冲液配制成质量浓度约为 50 mg,L，并用0(45 mg,L的标准品溶液:将经预处理的样品用缓冲液稀释至约50 哪微孔膜进行过滤后，作为样品溶液待检测。 2(2(66(磷酸葡萄糖 G(6(P 和6(磷酸果糖 F(6(P 的酶法测定[87】 2(2(6(1试剂配制 1 三乙醇胺 TEA 缓冲液:将14(99 mol,L盐酸至于200 g三乙醇胺和5 18mL，用水定容至500mL。 2 氯化镁: mL双蒸水中，加入2mol,L的NaOH mL。 3 NADP:将25 mL水中，并定容至100 mg 将109MgCl2(6H20溶于50 mL 水 G??6-P溶于20 mL水中。 4 G(6(P:准确称取50mg NADP-Na2溶解于l F-6(P溶于20mL水中。 6 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 中。 5 准确称取50 mg G…6PDH，5 u,mL :10此原酶加90此三乙醇胺缓冲液， mgprotein,mL，700 17 第二章实验材料与方法 摇匀。 7 磷酸葡萄糖异构酶 PGI，10 u ,mL :10儿原酶 mgprotein,mL，700 加90 pL三乙醇胺缓冲液，摇匀。所有配制的溶液都在0(4。C冰箱中保存。 2(2(6(2G(6(P和F(6(P的样品测定 取2只石英比色皿，一为空白参比，另一为标准或样品。首先于各比色皿中 A缓冲液3(0mL。在另一比色皿中加入100 加入TE pL标样或样品，以及20此 pL重蒸水，然后在2只比色皿分别加入20皿 p-NA