原位杂交理解

原位杂交： 手动1、样本制备：采集相应的全胚胎或者病理切片         较为成熟的样品需要蛋白酶K处理（也可以在仪器上进行） 第一天：（第一种液体手动加入，机器开始摇动） 机器2、梯度甲醇复水：a：50%甲醇的PBST溶液中，5min，30%甲醛的PBST中，5min，PBST溶液中，5min，重复一次。     3、样本的固定：4%多聚甲醛PBS溶液中，20min，PBST溶液中，5min，重复一次。     4、预杂交：300ulHYB-，50min，60℃，300ulHYB+，4h，60℃。 手动 5、杂交：加入100ul已经加入探针（地高辛标记的，之后用酶联地高辛抗体与之反应）的HYB+（探针浓度1ng/ul），60℃，杂交炉中过夜。 第二天：（第一种液体手动加入，机器开始摇动） 机器6、探针回收：50%甲酰胺的2XSSCT溶液，1ml，30min，60℃。重复一次2XSSCT溶液，1ml，15min，60℃，0.2XSSCT溶液1ml，30min，60℃，重复一次。 手动 7、封闭：MABT溶液，5min，两次，1:2:7溶液，1h，1ml 手动8、抗体孵育：按照1:3000的比例在1:2:7的溶液中加入酶联地高辛抗体，4℃，冰箱过夜。 第三天：（第一种液体手动加入，机器开始摇动） 机器9、清洗抗体：1ml，10%热灭活血清的MABT溶液，清洗抗体，1mlMABT溶液，25min，1mlMABT溶液1h，1mlMABT溶液25min。1ml含有1MM左旋咪唑的Staining buffer，5min，洗三次。 手动10、染色：将胚胎或切片转入16孔板中，吸去之前的staining buffer，加入300ulBM Purple AP stubstrate（反应底物），避光摇动，室温显色。     每隔一小时观察一次，是否显色，将显色完全的胚胎中底物吸出，用PBST清洗2-3次，4%多聚甲醛固定，拍照。4℃，冰箱保存 FISH技术与普通的原位杂交技术的操作区别在于： 1、 时间短，没有抗体孵育，清洗抗体和染色的，直接滴加复染剂15min后观察， 2、 检测的仪器不一样，普通的直接拍照，荧光的需要荧光检测系统。 3、 灵敏度更高一些， FISH 一、玻片预处理 1、65℃烤片过夜。 2、室温 二甲苯15分钟 X 3次。 3、室温 100%酒精5分钟X 2次。 4、室温 85%酒精、70%酒精各3分钟。 5、室温 去离子水3分钟，用无绒纸巾吸取多余水分。 6、90℃，去离子水煮沸25分钟或免疫组化修复液（PH7.0）煮沸20分钟。 7、待片子室温晾干后，37℃蛋白酶K消化12-15分钟（取0.4ml蛋白酶K储存 液（20mg/ml）溶于40ml 2xSSC（PH7.0），得到蛋白酶K工作液（200μg/ml）。如果是免疫组化修复液，蛋白酶K修复10分钟。 8、室温，2xSSC 5分钟2次 9、室温，70%、85%、100%乙醇脱水各3分钟。 10、自然干燥玻片。 二、变性杂交 杂交仪变性杂交流程 1.56℃，烤片2-5分钟 2、探针准备：①交液8μl              ②探针2μl 加入到0.5ml离心管中混匀，离心1-3秒，混匀备用。 3、将10μl探针混合物加于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边。 4、准备杂交仪，共变性条件：83℃ 5分钟，杂交条件：42℃16小时。 三、玻片洗涤与观察 1、46℃，2xSSC 10分钟 2、46℃，0.1%NP-40/2xSSC 5分钟 3、室温，70%乙醇3分钟  4、暗处自然干燥玻片。 5、室温，将15μl DAPI复染剂滴加于杂交区域，立即盖上盖玻片，15分钟后观察。 四、判断    分别数30个癌细胞的红绿信号数，设红信号与绿信号的比值为K    ①当K〈1.8时       判为阴性    ②当1.8〈K〈2.2时  为临界值    ③当K〉2.2时       判为阳性    当K为临界值时，要重新数100个癌细胞的红绿信号数，再计算比值。计算仍为临界值的，则要重做或另取材  FISH注意事项： 1、37℃蛋白酶K消化10-15分钟是关键，要看切片的厚薄和蜡块存放时间的长短。有点麻烦。 2、组织福马林固定时间不能太长，如星期五取材的，星期一制片就可能会减弱。 3、试剂盒有差异，Vysis的产品较好。