单核细胞的分离

单核细胞的分离 在外周血中，要分离到足够数量的单核细胞，通常不用比重为1.077的细胞分层液，因为单核细胞的比重与淋巴细胞近似，且含量仅为3%-8%，故很难将两者分开。而如用黏附法，则黏附细胞的剥离较难控制，剥离过度易造成细胞损伤，剥离不全使细胞回收率下降。以下介绍的两种方法可获得量多且纯度和活力都较好的单核细胞。 （一） Colotta方法 【实验原理】见Percoll 非连续密度梯度分离法。 【主要试剂与器材】 （1） 人外周血分离的PBMC悬液。 （2） HBSS(无Ca2+ 、Mg2+)，含10% FCS和 25mmol/L HEPES的RPMI-1640 (pH7.2)。 （3） 46%浓度的Percoll。 【操作步骤】 （1） 将分离获得的PBMC用HBSS洗涤2次（1000rpm，5min），加5ml完全培养液重悬。 （2） 将细胞悬液缓慢叠加在5ml的46% Percoll上，室温离心（2200rpm，20min或400g，25min）；得到3个带：第一带为富集的单核细胞（83%）；第二带含少量的单核细胞；第三带则为淋巴细胞。 （3） 收集第一、第二带的细胞，经洗涤后，重悬于培养液中。 【注意事项】 将细胞悬液叠加在Percoll分离液上时，应缓缓加入，保证二者间的比重界间不被破坏，否则影响分离效果。 （二） 密度梯度离心法 【主要试剂与器材】 （1） 肝素抗凝血。 （2） 不同比重的聚蔗糖-泛影葡胺细胞分层液： A液：90g/L聚蔗糖15ml，加500g/L泛影葡胺10ml (比重为1.14)。 B液：90g/L聚蔗糖17.5ml，加500g/L泛影葡胺10ml (比重为1.13)。 C液：90g/L聚蔗糖20ml，加500g/L泛影葡胺10ml (比重为1.12)。 D液：90g/L聚蔗糖24ml，加500g/L泛影葡胺10ml (比重为1.08)。 【操作步骤】 （1） 在15ml离心管内依次加入A液、B液、C液和D液各2ml，制成梯度。 （2） 在D液上叠加肝素抗凝血（用HBSS稀释）约2ml，室温下，离心（1000 rpm，40min）；血浆与D液的交界面即为单核细胞层（纯度可达97%）。 （3） 用吸管小心吸取该细胞层，经洗涤后，重悬于培养液中备用。 【注意事项】同“外周血PBMC的分离”。 ---摘自《免疫学技术》，科学出版社，葛海良，张冬青 主编