丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(赖氏比色法)

丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(赖氏比色法) 北京雷根生物技术有限公司 www.leagene.com 丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(赖氏比色法) 简介: 转氨酶是催化α-氨基酸和α-酮酸之间氨基转换反应的一组酶,丙氨酸氨基转移酶(ALT)旧称谷丙转氨酶(GPT)主要存在于肝细胞浆内,细胞内ALT浓度远高于血清,肝细胞破坏后,血清ALT立即迅速升高,因此谷ALT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。 Leagene 丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(赖氏比色法)其检测原理是丙氨酸氨基转移酶催化丙氨酸不α-酮戊二酸之间的氨基转移反应,在ALT催化下,其反应公式如下: L-丙氨酸+α-酮戊二酸?丙酮酸+L-谷氨酸。 二硝基苯肼不α-酮酸反应,生成相应的二硝基苯腙,在碱性条件下,二硝基苯腙的吸收光谱有差异,通过分光光度计检测在处差异最大,以等摩尔浓度计算出丙酮酸的生成量,进而计算酶的活性。100T该检测试剂盒可检测50个样本(不含标准品),该试剂盒仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。 组成: 编号 TE0123 Storage 名称 100T 试剂(A): 丙酮酸标准(100mmol/L) 1ml 4? 避光 试剂(B): 丙酮酸标准稀释液 2ml RT 试剂(C): 标准对照液 2ml 4? 试剂(D): ALT assay buffer 30ml -20? 避光 试剂(E): 二硝基苯肼显色液 30ml 4? 避光 使用说明书 1份 自备材料: 1、 蒸馏水 2、 离心管 3、 水浴锅 4、 比色杯 5、 分光光度计 操作步骤(仅供参考): 1、 准备样品: ? 血浆、血清样品:血浆、血清按照常规方法制备,可以直接用于本试剂盒的测定, 北京雷根生物技术有限公司 www.leagene.com -20?保存1个月有效,用于ALT/GPT的检测。 ? 细胞或组织样品:取恰当细胞或组织进行匀浆,低速离心取上清,-20?保存1个 月有效,用于ALT/GPT的检测。 ? (选做)样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,以便于后续 计算单位蛋白重量组织或细胞内的ALT/GPT含量。 2、 制作ALT标准曲线:取适量的丙酮酸标准(100mmol/L),按丙酮酸标准(100mmol/L): 丙酮酸标准稀释液混合,即为丙酮酸标准工作液-丙酮酸标准(2mmol/L),按下表制备 标准曲线。最好设定平行检测管,求平均值。 加入物 0 1 2 3 4 丙酮酸标准(2mmol/L)(μl) 0 20 40 60 80 标准对照液(μl) 40 40 40 40 40 ALT assay buffer(μl)(37?提前孵育5min) 200 180 160 140 120 相当于ALT/GPT(卡门单位) 0 28 57 97 150 混匀,向各管中加入二硝基苯肼显色液,混匀,孵育后,加入ALT显色基液,混匀。室温放置,分光光度计,以蒸馏水调零,读取各管吸光度。各管吸光度均减去”0”号管吸光度,所得吸光度差值(纵坐标)不对应的卡门酶活力单位(横坐标)作图。注意:Leagene标准品检测参考值在0.25-0.8之间,由于检测仪器、操作手法等条件的不同,参考值范围会有波动。 3、 ALT酶促反应:按照下表设置对照管、测定管,溶液应按照顺序依次加入,幵注意避免 产生气泡。如果样品中的酶活性过高,可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。 加入物 对照管 测定管 待测样品(如血清等)(μl) 40 40 ALT assay buffer(μl) ? 200 混匀,37?水浴孵育30min。 ALT assay buffer(μl)(37?提前孵育5min) 200 ? 二硝基苯肼显色液(μl) 200 200 混匀,37?水浴孵育20min。 ALT显色基液(ml) 2.0 2.0 4、 ALT检测:混匀,室温放置5min。分光光度计检测吸光度,比色杯光径,以蒸馏水调 零,读取各管吸光度值。 计算: 北京雷根生物技术有限公司 www.leagene.com 以标准管活力单位为横坐标,以吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。测定管吸光度减去对照管吸光度后,从标准曲线查得ALT活力单位。 参考范围:成年健康人血清ALT:5-25卡门单位/ml 注意事项: 1、 二硝基苯肼显色液溶解以后,如果仍然有结晶析出,应弃用。 2、 由于赖氏法的特点,在绘制标准曲线时每个点最好做三管的重复测定,求出各标准管 的吸光度均值,减去“0”号管吸光度均值后,对照赖氏单位绘制标准曲线。 3、 血清中ALT活性在室温可以保存2天,4?保存1周,-20?保存1个月。 4、 成批样本测定时,一般无需每份样本都做自身血清对照,以试剂空白管代替即可。但 对于超过正常范围的血清样本,应该进行复测。复测时,每份样本都应做自身血清 对照。 5、 严重黄疸、脂血或溶血的血清,可能会引起测定管吸光度增高,因此检测该类样本时 应做自身血清标本对照。 6、 当样本的酶活力大于150卡门单位时,应将样本进行5-10倍稀释后再行测定。 7、 为了您的安全和健康,请穿实验服幵戴一次性手套操作。 有效期:6个月有效。 相关: 编号 名称 CA0005 氨苄青霉素溶液(Ampicillin,50mg/ml) DH0006 苏木素伊红(HE)染色液 NR0003 Lezol(总RNA提取试剂) PE0018 SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 TE0002 碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(PNP微板法)