【word】 利用人体外成熟卵母细胞获得孤雌活化胚胎的研究

【word】 利用人体外成熟卵母细胞获得孤雌活化胚胎的研究 利用人体外成熟卵母细胞获得孤雌活化胚 胎的研究 天津医药2oo9年2月第37卷第2期 论着 利用人体外成熟卵母细胞获得孤雌活化胚胎的研究 金丹鲁振宇张云山 摘要目的:了解人体外成熟卵母细胞经电脉冲联合6一甲基氨基嘌呤(6一出methylaminoputine,6一DMAP)作用后 的发育潜能.方法:以未见第1极体(polarbody,PB)排出的不成熟人卵母细胞作为研究对象,经过体外培养成熟,采用 电脉冲联合6-DMAP进行孤雌激活处理,观察其活化效率和胚胎早期的体外发育效率.结果:电脉冲联合6-DMAP孤 雌激活人体外成熟卵母细胞,处理组活化率为32.20%,对照组活化率为12.07%,处理组活化率明显高于对照组,组间 比较差异有统计学意义(P<0.05).结论:电脉冲联合6-DMAP能有效激活人体外成熟卵母细胞,但活化胚胎的早期 发育能力显着下降. 关键词卵母细胞胚胎干细胞胚胎培养技术 StudyontheGainingParthen0geneticEmbryosbyUtilizingtheHumanOocy tesMaturedinVitro TianjinMedicalUniversity,Tianjin30OO7O,China JINDan,LUZhenyu,ZHANGYunshan AbstractObjective:Toobservethedevelopmentcompetenceofthehumanoocytesmaturedinvitroafter parthenogeneticactivationofelectricpulsingand6一 DMAP.Methods:Theimmatureoocytesatgerminalvesiclestageor metaphaseoffirstmeiosiswereincludedinthisstudy.Theywereculturedinvitro.Aftermaturationinvitro,thehumanoocytes wereactivatedbytheparthenogeneticactivationofelectricpulsingand6-DMAP.Theactivationrateanddevelopmental potentialoftheparthenogeneticembryoswereobserved.Results:Theactivationrateinthetreatedgroupwas32.20%after parthenogeneticactivationand6-DMAPonthehumanoocytesmaturedinvitro,andwere12.07%incontrolgroup.The activationratewassignificantlyhigherintreatedgroupthanthatincontrolgroup(P<0.05).Conclusion:Althoughthe combinationofelectricpulsingwith6-DMAPonthehumanoocytesmaturedinvitrowasaneffectivemethodfor parthenogeneticactivation,thedevelopmentpotentialoftheparthenogeneticembryossignificantlydecreased. KeyWOrdsoocytesembryostemcellsembryoculturetechniques 1998年,美国Thomoson实验室成功分离建立 第1株人胚胎干细胞humanembryonicstemcells, hESCs)系【1],其不但具有正常2倍体核型,且具有体 内外分化成为3胚层细胞的多能性,因此在基础和 应用研究领域具有重要价值.但hESC研究一直受 到广泛的伦理道德争议,并且与此相关的核移植来 源的hESCs同样受到类似的质疑.目前已成功建立 的与hESCs具有类似增殖和分化潜能的人孤雌胚 胎干细胞(humanparthenogeneticembryonicstem cells,hPESCs)系,不但回避了部分伦理道德争议, 而且为遗传学研究,自体细胞及器官移植治疗领域 开辟了新途径.本研究以体外成熟人卵母细胞为研 究对象,了解其经电脉冲联合6一甲基氨基嘌呤(6一 DMAP)作用后的发育潜能. 1材料与方法 1.1试剂G1.3,G2.3,G—FERT,G—MOPS,OIL,离子霉素 (ionomycin),6-DMAP,甘露醇,硫酸镁,氯化钙,聚乙烯醇,人 血清白蛋白和透明质酸酶均为Vitrolife公司产品. 1.2人卵母细胞的收集,分组和体外培养收集来源于天津 中心妇产科医院生殖中心行试管婴儿技术治疗的不孕症患 者自愿捐献的不成熟卵母细胞,患者夫妇签署知情同意书后 将其应用于科学研究.患者进行常规控制性超促排卵 (controlledovarianhyperstimulation,COH),在注射人绒毛膜促 性腺激素humanchorionicgonadotropin,HCG)后35,36h阴道 B超引导下穿刺取卵,于取卵后4,6h行常规体外受精(in vitrofertilization,IVF),18h后观察原核pronuclear,PN)和受精 情况;行卵细胞浆内单精子注射(intracytoplasmicsperm injection,ICSI)的卵母细胞在取卵2h后去除颗粒细胞,行 ICSI前检查其成熟度.2组均选择未见PN形成及无极体排 国家重点基础研究发展973计划项目(项目编号: 2007CB948001) 作者单位:300070天津医科大学(金丹);天津中心妇产科医 院生殖中心(鲁振宇,张云山) 通讯作者E-mail:yunshanzh~ahoo.eom 出的减数分裂I期(MI)和生发泡期(germinalvesicle,GV)的 未成熟卵母细胞,经体外成熟培养24h,选择已排出第1极 体的减数分裂?期(M?)成熟卵母细胞,共l17枚,作为研究 对象.随机分2组,59枚进行电脉冲联合6-DMAP激活为处 理组;58枚不予电脉冲联合6-DMAP激活为对照组. 1.3卵母细胞的孤雌激活将待激活的卵母细胞在电激活 液(0.3mol甘露醇,0.1mmol硫酸镁,O.05lnmo|氯化钙, 0.1s/L聚乙烯醇,3g/L人血清白蛋白)中进行清洗并放置于 37?,体积分数为5%0,6%CO:和90%N的培养箱中平衡 35min.将平衡后的卵母细胞转移至融合槽内的电激活液 内进行电脉冲孤雌激活.激活处理结束后,将处理过的卵母 细胞迅速转移至5IxmIonomycin中处理5min,然后再转移 至2mmol6-DMAP中,放置于37体积分数为5%02,6% CO:和90%N:的培养箱中5h. 1.4观察激活效果与胚胎发育情况在激活处理结束后将 处理的卵母细胞放置于标准的IVF培养液(GI.3)中培养,并 于18h后使用倒置显微镜观察和记录PN形成情况,处理组 卵母细胞出现PN(包括1,2或多个)者为激活,对照组卯母 细胞自发激活发生晚裂者亦判定为激活,并计算各组激活率 (激活卵母细胞数/总卵母细胞数).将激活的卵母细胞转入 G2-3中每天观察记录其胚胎发育情况至第6天.同时观察记 录胚胎发育情况. 1.5统计学方法采用SPSS11.5软件进行统计分析,计数 资料比较行x检验.P<O.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1电脉冲联合6-DMAP对人体外成熟卵母细胞 的激活作用人体外成熟卵母细胞处理组激活率 为32.20%(19/59),对照组激活率为12.07%(7/58), 2组间差异有统计学意义(x=6.89,P<0.05). 2.2电脉冲联合6-DMAP激活后孤雌胚胎早期的 发育情况处理组含人体外成熟卵母细胞59个, 电脉冲联合6-DMAP激活卵母细胞l9个,观察到 PN者l5个,发生卵裂者4个,形成囊胚0个;对照 组含人体外成熟卵母细胞58个,自发激活卵母细 胞7个,发生卵裂7个,形成囊胚0个. 3讨论 应用孤雌生殖技术建立的hPESCs,不需破坏早 期的人类胚胎进行胚胎干细胞的分离,为原核胚胎 的形成提供可替代资源l3】.随着孤雌生殖技术的不 断改进和完善,具有更加高效和较少道德舆论争论 的hPESCs系被认为是来自于体细胞核移植的干细 胞系的有效补充,并且部分结果已在小鼠及非人一 灵长类动物的模型中得到验证.目前有文献报 TianjinMedJ,Feb2009,Vol37No2 道,应用人工孤雌生殖技术已获得人类孤雌胚胎, 并且将其作为衍生出人类孤雌多潜能细胞系的重 要资源I61. 电激活是所有激活方法中应用最为普遍的方 法.有实验证明电激活联合6-DMAP作用于小鼠, 激活率及胚胎发育数量高于单一处理组旧.影响孤 雌胚胎发育潜能的不仅是激活方法,还包括人卵母 细胞的来源和激活后培养等其他因素.有人认为去 除颗粒细胞的卵母细胞在标准的IVF培养液中 (G1.3)培养时,50%MI及20%GV期卵母细胞能在 24h内自然生长达到M?期,且具备受精和分裂能 力l71.对于目前采用电脉冲联合6一DMAP孤雌激活 人成熟卵母细胞并成功建立的hPESCs系【2】,其来源 多为进行人工辅助生殖治疗的女性患者自愿捐献 应用于科学研究的成熟卵母细胞.由于其来源有 限,本实验采用的人卵母细胞的来源和培育条件等 与Mai等[2]不同,但采用了与Mai等相同的孤雌激 活方法进行处理.对于在IVF培养液中培养成熟的 人卵母细胞来说,电脉冲联合6-DMAP孤雌激活是 一 种有效的孤雌激活方法.但与Mai等嘲实验结果 不同的是本研究中的孤雌胚胎早期发育潜能极低, 且均未发育至囊胚阶段.胚胎发育潜能下降的主要 原因之一是卵母细胞胞质不成熟罔,在体外成熟的 过程中普遍存在着胞核与胞质成熟不同步的现象, 并且长时间的体外培养加重了胞质和胞核成熟不 同步的现象.Hall等[91对人老龄卵母细胞进行孤雌 激活的研究结果表明,老龄卵母细胞的激活率,卵 裂率及胚胎发育率均低于正常成熟卵母细胞,DNA 检测发现由于孤雌胚胎的纺锤体结构畸形造成的 其染色体浓缩,缺失和畸形,这成为造成其有丝分 裂停止的主要原因.对于本试验结果,分析可能由 于采用的人卵母细胞自身条件较差,并在IVF培养 液体外培养成熟过程中,卵母细胞老化造成的母源 性染色体畸形和胞质,胞核成熟不同步成为影响孤 雌胚胎早期发育潜能下降的原因之一.对于其具体 原因,还需进一步探究. 目前,人正常成熟卵母细胞来源十分有限,笔 者试图采用新的卵母细胞资源获得孤雌发育的胚 胎,发现标准IVF培养液中培养成熟的人卵母细胞 不适合作为孤雌胚胎的新来源,且其形成的孤雌胚 胎均具有较低的临床应用价值.虽然Jeseta等Ol实 验显示曲古抑菌素(trichostatinA,TSA)可保持猪体 外成熟卵母细胞的发育潜能,但是未见TSA作用于 天津医药2009年2月第37卷第2期 人体外成熟卵母细胞的相关报道.本实验在人卵母 细胞的来源和孤雌激活条件等方面为应用孤雌生 殖技术建立hPESCs提供新思路,但是孤雌胚激活 后的培养及其继续发育潜能的改善仍是亟待解决 的问题. 参考文献 【1]ThomsonJA,hskovitz—EldorJ,ShapiroS,eta1.Embryonicstemcell linesderivedfromhumanblastocysts『J1.Science,1998,282(5391): 1145-l147. 【2]2MaiQ,YuY,LiT,eta1.Derivationofhumanembryonicstemcell linesfromparthenogeneticblastocystslJ1.CellResearch,2007,17 (12):1008—1019. 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(2008—05—28收稿2008—07—24修回) (本文编辑秦娟) 天津市医学科学技术信息研究所 2008年引进中外文医学全文数据库介绍 2008年我所中外文医学数字资源全文覆盖率全面提 升,为我市医务工作者及时了解,跟踪国际医学科技最新发 展动态,进行学术研究,课题申请,成果鉴定等提供了强大的 医学全文信息资源保障. 1中文资源包括:重庆维普,同方,万方,超星电子书等. 提供国内中文医学期刊全文文献,还有国内重要会议论文全 文,各大高等院校硕士/1~士学位论文全文,各大出版社出版 的优秀图书15000余种,此外还可以查阅中国科技成果信 息,法律法规,医药企业及产品信息,医院及卫生科研院所信 息,医药名人信息等.目前我所正在试用:(1)中国疾病知识数 据库CDD,由解放军医学图书馆与重庆有限公司 合作研发的一个面向临床医药学专业人员,同时兼顾大众的 专业图书,期刊型知识服务系统.作为临床教学及应用的专 业工具,重点解决疾病从诊断到治疗中的大量问题.(2)N师 考试培训系统,包括医师资格考试,药师资格考试,考研西医 综合考试,职称英语(卫生类),职称计算机生类)考试.可以 进行在线考试,按章节在线练习,历年真题在线练习,模拟考 试,在线答疑等,为广大医务人员考试提供了学习的平台. 2外文全文资源包括:HIGHWIRE期刊全文数据库, 消息 ELSEVIER临床医学期刊专辑E—JOURNAL,MDC0NSUIJT, KARGER,OVIDLWW,牛津大学出版社OUP医学专集, BMJ,EBSCO,PHMC,GALE.其中:f1)HIGHWIRE全文数据库 是全国独家首次引进,可在第一时间为广大读者提供最新文 献全文;f2)E—Journal是由享誉世界的出版社ELSERVIER出 版发行的临床医学期刊全文数据库(医学核心期刊全文信 息);(3)OUP涉及生命科学和医学领域期刊,其中69%的期刊 排名在全球该领域中前50位;(4)OVID为目前国内医教科 研人员使用最多,最熟悉的外文全文数据库,升级后的 OVIDSP使用更加简单,功能更加丰富,提供最强大的精确 检索.(5)BMJ涵盖了英国医学会出版的所有期刊,23种期刊 中有20种被SCI收录. 3EBSCOAtoZ访问平台能快速查找期刊所在全文数 据库,为期刊定位提供便捷通道. 4试用数据库方正电子书Apabi数字资源平台f6000余 种),OPENAccess一站式检索服务平台,随着与数据库厂商 的合作,试用数据库会不断增加和开通. 此外,我们还可传递4000余种重要外文医学期刊的全 文,文献可以通过网络中心索取.(联系电话022—23337502)