【doc】吗啡对大鼠培养海马神经元钙离子作用机制的研究

【doc】吗啡对大鼠培养海马神经元钙离子作用机制的研究 吗啡对大鼠培养海马神经元钙离子作用机 制的研究 第24卷第2期 2002年2月 第三军医大学 Ac1_AACADEMlAEMEDICINAEMILl不删ST口订1AE Vol24,No2 Feb.2002155 芟章缩号:1O(2Om)m.O155? 吗啡对大鼠培养海马神经元钙离子作用机制的研究 论着_ 谢燕',余争平',朱光绪',方强',江海洪(第三军医大学:'预防医学系劳动卫生学教研室;:科技部;重庆400038) 提要:目的研究吗啡对悔马神经元游离钙离子谁度(c:i)影响的机制,探索吗啡成瘾的神经生韧学机制及对吗啡成瘾 可能的治疗途径:方法运用新型荧光探针Fluo-4,利用激光共聚焦显微镜研究吗啡对大鼠培养海马神经元[c]i作用机制.结 果10Ismol/L吗啡急性刺激引起海马神经元[c]i升高,阿片受体选择性拮抗剂crop(1tmlo]/L)不能阻断吗啡引起的细胞内 [ca-"Ji增加.而岛阿片受体选择胜拮抗剂Naltrindole(1}mL)阻断了吗啡引起的细胞内[cJi反应;特异性的内质网钙泵抑制 剂Thapslgarg~n(TG,Itanal/L)预处理海马神经元阻断吗啡引起的细胞内[cJi增加,L钙通道阻断剂Vempmnil(20tanal/L)预处理海 马神经元不能完全抑制吗啡引起的细胞内[c]i增加;100tmaol/L吗啡长时程(24h)作用于海马神经元,细胞内[c]i升高,加人 l0OnoFL纳络酮急性戒断后.不能阻断细胞内[c】i升高,反而引起[ci异常升高.结论吗啡急性刺激引起的海吗神经元 内钙增加主要来源于阿片受体介导的m敏感的钙库释放. 美键词:吗啡;海马神经元;钙离子;阿片受体;激光扫描共聚焦显微镜 中图法分类号:R322.81;R4468;R996文献标识码:A Mechanismsofmorphine—evokedchangesofintracellularcalciuminprimarycultured hippocampalneuronalcells XIEYan,YL2~teng-pitu5,ZHUGuang-m,FG.JlGHmg(脚帅norLmH舶 e,Thim]Millta~Medlc~Unive~iry,Chongallng 400038,ChinaJ Abslrmet:ObjectiveToinvestigatetheacuteandchroniceffeetsofmorptinleoiltheintmcellularfreecalciumconcexatratioilJc]iinpoi一 culturedpp0c1paIneuronalceilsandplother,eurobidogicalmechanismofmowhineaddimioilandIreatment.M酬odsChangesof 【c'Jiinducedbymorphineinp力 nmry-culturedhippoeampalneuronalceilsweredetectedwithconfocallaserscamaingmlcro~copyI】yusingCa"一 ~rtsitivedyefluo-4asa[itewcalciumfltmreseentprobeResultsActually10bcmol/Lmo,l~inducedtheincreaseof[ca=!]】inhippocam口al necellsMorphineinducedit~reaseofLciwereblockedI】 y6opioidreceptorantagonist(1Fmol/Lj,but?tbyopioidl'~'eyorantago— nJslCTOP(1~mal/L)Pretwatmentoilthecellswith1~.tmof/Lthapslgarinalmostblockedthemorphine-evokedresponse;byeontra.st,pretreatment onthecells? 20bcmol/Lverapamilincreased[caJi..M'terthecellsbeingexposedto100tmaol/LmorpIfinefor24h,[c]lincmased, whichcouldbefua~rintetrsifiedwith10tanol/L~oxoneadditionConclusionsMorphineindueedreleaseofCismainlyfrominos砌1.4. 5-txisphosphate(IP3)seaasiti~,estoresinratculturedhippocampalilellrotl~mmutheactivationofsubtype0】dreceptor Keywords:morphine;hippoeampalneur啷:ealeitm~o删 mdreceptor;laserscanrfingconfocalmicroscope 吗啡长期使用易导致镇痛耐受,心理\身体依赖, 戒断综台征和自身给药行为,吗啡依赖和耐受的机制 很复杂,目前尚未完全清楚.文献[1,3]明钙离子 拮抗剂能够降低吗啡依赖和耐受的程度,海马在吗啡 依赖和耐受形成中起重要作用.采用原代培养海马神 经元研究吗啡对海马神经元[ca2]i作用的动态变化, 可更直接准确获得吗啡对海马神经元[ca2]i作用证 据,探索吗啡成瘾的神经生物学机制及对吗啡成瘾可 能的治疗途径,本研究利用激光扫描共聚焦显微镜 (Laserscanningconfocalmicroscope,LSC)d)技术动态观 察吗啡急性和长时程作用对培养海马神经元[c]i 的影响,并对其机制进行研究. 1和方法 1.1主要试剂 DMEM培养基,胎牛血清购自美国Hyclone公司:Fluo-4/ 基盒项目家自然科学基金资助项目(398~039) 作者筒秆:谢燕(1968—1,女,四JII省西昌市人.博士.讲师.主要从事学习 记忆分子机制方面的研究,发表论文6篇电话:(023)68752289 收稿日掘:2001&64)1;任回日期;21XJ1.嘶 AbI,A23187.PluronicF-127购自美国Molecularpl1lbes公司;多 聚赖氨酸cly-L-Lysine),阿糖胞苷,Naltrindole,CTOPtD-Pen— Cys-Tyr-D-Trp-Om-Thr-Pen-Thr-NH2)购自美国Sigma公司;EGTA 为国产分析纯盐酸吗啡为国产试剂. 1.2仪器 激光其聚焦扫描显微镜【德国LeicaTCS-N'~型) 1.3新生大鼠海马神经元的培养 取当日出生的Wistar大鼠,断头处死,分离海马,剪碎, 0.125%胰蛋白酶消化,分离为单细胞,05xl个/ml的细胞 数接种于铺有多聚赖氢酸的无菌塑料培养皿上,置含有95%空 气:5%c,37?恒温湿化的孵育箱内孵育接种24h后改用 培养液,培养至第5天加人阿糖胞苷,抑制胶质细胞生长,培养 6—10d后神经细胞之间突触联成网状,即可用于实验 14买验分组 实验分为:?吗啡急性作用组:10l~mol/L吗啡刺激海马神 经元;?吗啡慢性作用组:1?~xmol/L吗啡作用悔马神经元 24h;?纳络酮戒断组:吗啡慢眭作用海马神经元后,加人 10pmol/L纳络酮;?阿片受体拮抗剂预处理组:在吗啡作用前 分别加入1bmml/LNaltri~rdole,1gmol/LCTOP预处理海马神经 元30rrdn;?钙通道阻断剂预处理组:在吗啡作用前分别加人 20tunollLVerapamil,1,m~nd/LThap:咖预处理海马神经元 l56第三军医大学第24卷 30tr6n或1h每组6皿细胞. 1.5海马神经元[c]i测定J 负载:将单层培养的大鼠海马神经元用Hanks液漂洗2—3 次.冼去细胞表面的杂质,放人含有2~nd/LFluc-4/AM和2ml PIumnieF-127(200g/L)的1mlHanks液中,37?负载45min,用 小含荧光探针的Hanks液洗涤2—3次,充分洗去没有进人细胞 内的荧光探针,上机检测.激光共聚焦扫描显微镜检测:荧光 探针F14/AM的激发渡长494iim,发射波长516l,ln|,扫描间隔 时问为12s,按下公式计算ca2浓度::c]i=Kd(F-Fmin), (Fm一F),F:检测到的荧光强度,Frnax:加人5mm~l/LCaCI缓冲 液和c'载体A23187后细胞内饱和时的荧光强度,FHun:加入 10retool/LEGTA使荧光淬死后的荧光强度,Fluo-4的Kd值为 345rmM/L 1.6统计学分析 实验数据用i?表示,采用Miemedthcel软件进行 检验. 2结果 2.1吗啡急性和长时程作用引起培养海马神经元内 钙升高 从表1可知,1130f删L吗啡作用海马神经元24h,海马神 ln1 200 {160 } 120 =B0 ;0 0 经元荧光强度增强,[c:i浓度升高,见图11加入l0. umol/L 纳络酮急胜戒断15n,海马神经元:ci异常增高.在培养 的海马神经元中加^10,umol/L吗啡刺镦,发现数10s内诲马 神经元荧光强度逐渐增强.并产生c]i峰(Ca]ciumtran— sient),细胞内[c]i最大值比基础值增加8倍,图2为吗啡刺 激单个海马神经元典型的钙离子动态变化图在吗啡刺激前 分别加入阿片受体选择性拮抗剂CTOP(1~md/L)和岛阿片 受体选择性拈抗剂Na1.trlndole(1~nol/L),CrOP不能阻断吗啡引 起的细胞内[Ca2]i增加,Naltri~rlole阻断吗啡引起[c:L增 加,见表1 表1吗啡急性和长时程作用对海马神经元c]i的影响1月=6,?) Tab1Acuted~mrd~e日ofJme?[:iInpI cmredpl幻呷lneuronale~tls(月=6.?) :P<00lc衄tI:##:P<0Olehmnien~or0hlne A:UntriedCr0【){B:Thecellsexp?edl0100~lol/L『『?inefor24h 围1培养海马神经元[c]i的黄光强度 F1g1nll0res唧.e'valueof[(]iin厢扛娜In?bi呻EH:叫Ineuronal.dk 图2吗啡急性作用引起海马神经元[c'i增加 啦2A邝ofm?[]iiI|r毗scI】lmred bi呻0c越I|pneuronal0e?s 2.2Verapamil预处理海马神经元对吗啡诱导[Ca2]i 增加的影响 用Verap~md(20~nolJL)预处理海马神经元30nlln,阻断 L钙通道,不能阻断吗啡(10f帅ovL)的升[Caz]i作用,海马神 经元荧光强度由82.75?2588升高到14675?1968(n=6,P <O.O1),细胞[c]i由(149.80?2689)nmol/L升高到(60875 ?60.42)nmol/L【n=6,P<0.01).但缩短吗啡引起细胞 [c一]i升高持续的时间:单个海马神经元典型的钙离子动态 变化见图3:- 2.3lali驴晒n预处理海马神经元对吗啡诱导[c]i 增加的影响 当用特异性的内质网钙泵抑制荆‰p8iEa嘶n(亿,1~-nd/ L)预处理神经元1h,吗啡(10uL)升高海马神经元细胞内 :口i的作用被抑制,海马神经元[c]i维持在基础值 【9445?9.37Jtm-~l/L(n=6,P>0.05):单个海马神经元典型 的钙离子动态变化见图4: 第2期谢燕,等吗啡对太鼠培养海马神经元钙离子作用机制的研究l57 ]Jit 16o I20 } 80 ? 40 60120i80240 圉3Verap~l预处理海马神经元对吗啡诱导[0':i增加的影响 ng3Elleets0f憎p衄】il(铷~nol/L)吐啦岫t0fI舯卜 phiminduced.眦r?in[(];_mralseulfan~dlI_忡. 0am叫n目-n肌ceIb 圉4Tha肛n预处理海马神经元对吗啡诱导[凸+]i增加的影响 F4E~ectsoftII印商rg_m(1lama/L)p代毗删帆lnor- pI面枷?o嘲缸嘲辅in[(iInralscldhipp- 0?擀lnem~nalodb 3讨论 ca"在中枢神经系统功能中起着重要作用.参与 神经信号的传递和神经递质的释放.吗啡对神经细胞 株[Ca2]i影响已有文献报道,吗啡能够改变神经母细 胞瘤和神经胶质瘤NG10815,SH-SY5Y等细胞内 [c]i动态平衡.阿片类药物可以增加培养的I 型星状胶质细胞[Ca2]i.学习记忆在吗啡成瘾中起 重要作用,海马是学习记忆形成的重要部位,海马在吗 啡成瘾中很重要.h和Fan等发现抑制大鼠海马 内CaMK?活性可以减轻吗啡诱导的依籁和耐受.我 们已证实原代培养的海马神经元存在一8阿片受体 (另文)用原代培养的海马神经元研究吗啡对海马 [Ca:i作用机制非常有意义采用第4代荧光探针 Fluo-4与激光共聚焦扫描技术结合,能够更好地监测 cd空间分布和细胞内ca2浓度的连续变化.但迄 今为止.用LqCM技术动态检测吗啡对原代培养海马 神经元[ca.]i变化及其机制的研究尚未见报道.本 研究结果发现吗啡急性刺激引起海马神经元:Ga2.]i 升高,阿片受体选择性拮抗剂CTOP(1/~mol/L)不能 阻断吗啡的升钙.而82阿片受体选择性拮抗剂Nahrin. dole(1btmollL)完全阻断了吗啡的升钙作用,提示吗啡 对海马神经元ca2]i的作用可能通过&阿片受体介 导cBilecki等"的研究发现在NG108—15神经细胞株 上吗啡是通过激话阿片受体引起cAMP反应元件结 合蛋白磷酸化,ca2,钙调蛋白参与此过程,也有文献 表明吗啡引起ca2的增加是p-受体介导的.L.型 c通道阻断剂Verapanfil不能阻断吗啡的升钙作用, 提示L-型ca2通道在吗啡急性刺激诱导细胞内钙增 加中不起重要作用Yang等用膜片钳在NG10815 神经细胞株上发现吗啡对I|.型c通道作用不明显; 进一步研究发现用特异的内质网钙泵抑制剂rG预处 理海马神经元,以耗竭细胞内钙库可抑制吗啡诱导的 细胞内增加,表明吗啡引起细胞内钙增加主要来源于 l,4,5三磷酸肌醇(Inositoll,4,5-trisphosphate.I)敏感 的钙库释放.Spencer等在稳定表达,6'受体的3 种神经细胞株上,用相应受体的选择性激动剂处理这 3种细胞,均引起ca2的增加,进一步研究发现『c]i 的增加是细胞内钙库释放增多所致.吗啡长时程作用 于海马神经元.海马神经元[c]i升高,加入纳络酮急 性戒断后,不但不能阻断ca2]i升高,反而引起fci 异常升高,表现出受体脱敏由于神经细胞内[c+]i 与神经递质的释放有密切关系,所以,吗啡依赣或者戒 断时,神经细胞内[ca2:i的剧烈变化,引起神经突触传 递变化.出现戒断症状.因此,对神经细胞内[Ca2]i检 测,除对阿片类药物的作用机制有研究意义外,还可了 阻断剂 解吗啡依赖治疗药物的疗效,并为研究利用ca2'治疗吗啡依赖及戒断症状提供可能途径. 参考文献 . 1LeeSC,YobumBC1ke31"~.tofnimodipineoDopioid?…tl川h】ced PrgU眦1and叫s_n'廿J]P|la咖BiochemBeha~2000,66 (21:347—351 【2JL儿L,ZengS,[fluI3?et.I&~ibitionoftheamy山andh'prpal caleiundcalrxMulin-dependentproteinkina~natlenuat~lhedepenkn andrelap~tomm1difli'mnt/yinrats:J]Neun~i?.20?,I (3j:[91—195 JFanGH.wangLz.QLuHc,alM~ibltion…al…m/Imod11l_ depen&t~tpmmHn越e?invg,tp一mallennat~r呻曲】…tol— a?eanddep目Id. _『1.MolPh~,ol,.1999,56(I):39—45 [4邢虹,何其华,于桂芬,等中毒剂量替封酸引起大脑皮质神经细 胞的钙振荡及其机制探讨[J中国应用生理学杂志.1999,【5(41: 294—-296 【5JYangJC}shanJ}gKF,+[~lorpMneand?血ad?hayf雎』I effectsmcalciumc].~Jnel一?sinn—cel[~.JjBrainRe 2OOO,870f1—21:199—203 .6Jspe?RJ.Jmw.ThayerSA,dalM&filizeai~ofc'fmmintr~lcel lul盯目dI髓intra~fectedneuro2acellsbyf】Yml帅ofmtdtipl…opi(Ih tZrpes[JlBlhemPharr~[.1997.54(7):809—818 7JBileoMW,HAltV.E?llRAcutedd协.o1tlr刚町1l…li.n indue~CREBphc~hory'lafioninNGI@8.15c~tlls[J].EurJPhamm~I 2O0O.390(1—2):I一6 _8JWangD.Tolb~rtLM.CarlsonKw,?alNucle盯c一.1emodulin cra『ocall?a~'tivatedbymu-opioid(O1'3)mprJjJ"geur~.h1. 2O00.7,1(4):14一1425 (编辑陈聪连) 呈,一