反胶团萃取分离螺旋藻藻蓝蛋白

反胶团萃取分离螺旋藻藻蓝蛋白 第23卷第2期 2008年6月 天津科技大学学报 JournalofTianjinUniversityofScience&Technology ,,_01.23No.2 Jun.2008 反胶团萃取分离螺旋藻藻蓝蛋白 刘杨,王雪青,庞广昌 (天津商业大学,天津市食品生物技术重点实验室,天津300134) 摘要:研究了CTAB/-t~-戊醇一正辛烷反胶团溶液萃取分离螺旋藻藻蓝蛋白的性 能.考察了水相离子强度和种类,有 机相中表面活性剂浓度和助溶剂浓度等因素对萃取行为的影响,并从反胶团的 微观结构予以解释.结果表明:O.o4 mol/LCTAB/-~戊醇一正辛烷(体积比1:4)的反胶团体系用于萃取pH7.0,包含 0.1mol/LKC1的螺旋藻细胞破碎液, 藻蓝蛋白萃取率可达96.3%,分配系数达到26.O;采用pH5.0,包含2mol/LKBr的 反萃液反萃藻蓝蛋白,反萃取率可达 90.6%. 关键词:螺旋藻;藻蓝蛋白;反胶团;十六烷基三甲基溴化铵(CTAB);萃取 中圈分类号:TS20文献标识码:A文章编号:1672.6510(2008)02.0030.04 Liquid—LiquidExtractionofc-PhycocyaninfromSpirulinaUsing ReversedMicelles UUYang,WANGXue—qing,PANGGuang—chang (TianjinUniversityofCommerce,TianjinKeyLaboratoryofFoodBiotechnology,Tianjin 300134,China) Abstract:ThesupernatantexVacfionofc-phycocyaninbyreversedmicellesusingsurfacta ntCTABwascarriedout. Variousparametersoftheaqueousphase(pH,metypeandconcentrationofsalt),aswellasth eorganicphase (concentrationofsurfactantandCO—solvent)werestudied.TheexperimentaldataCanbeinterpretedreasonablybythe microscopicstructureofthemicellarorganicphase.Itisreportedthatfromthesupematanto fpH7.0.O.1mol/LKC1disrupte Spirulinacel1.thepartitioncoefficientofc—phycocynainisashighas26.0withayieldof96.3%extractedbyO.04mol/L CTAB/n—pentanol—octane(1:4v/v)reversedrnicelles.Abackextractionyieldofc—ph ycocynainis90.6%bypH5.0,2 mol/LKBrsolutionasbackextractant. Keywords:Spirulina;c—phycocyanin;reversedmicelles;cetyltrimethylaminebromide; solventextraction 螺旋藻(Spirulina)是蓝藻门,藻蓝纲,段殖体 目,颤藻科中的一个属,是一种丝状多细胞螺旋形原 核藻类生物,包括钝顶螺旋藻,极大螺旋藻,盐泽螺 旋藻等多种品系.螺旋藻中含有丰富的藻胆蛋白,藻 胆蛋白中又包含藻蓝蛋白,别藻蓝蛋白以及藻红蛋白 等多种蛋白质,其中藻蓝蛋白作为一种有多种生理活 性的天然蛋白质具有良好的药用开发前景J,并且 ,螺旋藻藻蓝蛋白的 它在螺旋藻中的含量较高,因此 分离纯化方法成为螺旋藻类蛋白研究的热点.传统的 分离纯化方法多采用盐析沉淀法【4],该方法包括沉 淀,离心和透析这三个主要操作环节,在实际工业化 生产过程中存在操作步骤烦琐,动力能耗高以及操作 周期长等缺点. 反胶团萃取具有传统液液萃取的优点:操作条件 温和,设备简单,易于规模化放大;而且反胶团 内的”微水池”环境接近细胞内的环境,蛋白质不易 变性,适于蛋白质等生物大分子的分离,浓缩和纯 化,对细胞发酵液中的胞外产物【o]和细胞破碎液中的 收稿日期:2007—11—06;修回日期:2008—01—07 基金项目:天津市重大科技攻关项目(06YFGZNCIM200);天津市自然科学基金 重点项目(08JCZDJC16600) 作者简介:刘杨(1978一),女,河北秦皇岛人,讲师,博士;通讯作者:王雪青,教 授,wxqing@tjcu.edu.cn 2008年6月刘杨,等:反胶团萃取分离螺旋藻藻蓝蛋白 胞内产物J均有良好的萃取分离效果. 本文探讨一种简单有效的适合大量萃取分离螺 旋藻藻蓝蛋白的方法——反胶团萃取,对该方法萃取 藻蓝蛋白的萃取条件进行优化,并从反胶团的微观结 构解释各种因素对藻蓝蛋白萃取和反萃取的影响.由 于钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的等电点为pH4.3[8],在pH 为中性的螺旋藻细胞破碎液中藻蓝蛋白带负电荷,因 此,本研究选取CTAB阳离子表面活性剂形成的反胶 团体系,研究藻蓝蛋白在其中的萃取分配行为. 1材料与方法 1.1材料 钝顶螺旋藻粉产自内蒙古鄂托克旗乌兰镇;十六 烷基三甲基溴化铵(CTAB),正辛烷,正戊醇和其他 无机盐均为国产分析纯试剂. 1.2分析方法 螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其检 验的标准.藻红蛋白(PE)最大光吸收在490, 500am,藻红蓝蛋白(PEC)在568am,藻蓝蛋白 (PC)在620am附近,别藻蓝蛋白(APC)在 650am.因此,藻胆蛋白中各组成蛋白含量可根据 Kaplan,D等[9]采用的方法进行测定. 『Pc1_—/t620-0.— 474A65o(1) 5.34 [ARC]:—A65o--0.—208/1620(2) 一一 5.09 『PE1_—A568-2.41([PC]+[A— PC])-0.849[APC] 9.62 (3) 式1一式3中:[PC],[APC],[PE】分别代表藻蓝 蛋白,别藻蓝蛋白和藻红蛋白的质量浓度 (mg/mL);A620-,A650-,A568分别代表波长在620am, 650am和568am处的吸光度. 1.3反胶团萃取 1.3.1螺旋藻细胞破碎 准确称取0.5g螺旋藻粉,加入100mL的0.01 mol/L的磷酸缓冲液(pH=7.0),采用反复冻融(3 次)的方法对藻体细胞进行破碎,在显微镜下观察计 数细胞破碎率可达到90%以上.将破碎的螺旋藻细胞 悬浊液于4000r/min离心20min,倾倒上清液可得 到含藻胆蛋白的粗提液.测粗提液在620nnl和 650am下的吸光度,计算藻蓝蛋白的含量. 1.3.2反胶团溶液配制 将CTAB以一定比例溶于正辛烷和正戊醇(体 ? 31? 积比为4:1)的混合液中,并用pH=7.0,0.01mol/L 的磷酸缓冲液洗涤2—3次,得到透明澄清的CTAB 反胶团溶液. 1_3_3反胶团的萃取与反萃取 在10mL带塞的离心试管中加入等体积的藻胆 蛋白粗提液和反胶团溶液(均为4mL),在恒温25 ?以60~~a’min的频率上下颠倒离心管10min,使两 相充分混合,藻蓝蛋白质达到分配平衡.然后静置分 层,将油水两相分离,水相为反胶团萃取液.用移液 管抽取下相(水相)溶液,在568nm,620nm和650 am下测吸光度,计算藻蓝蛋白的含量.向装有油相 (抽取完反胶团萃取液的剩余部分)的离心管中加 入等体积不同pH(0.01mol/L磷酸盐缓冲液)的无 机盐溶液(均为4mL),在恒温25?,以600rdmin 的频率上下颠倒离心管120min,使两相充分混合, 藻蓝蛋白质达到分配平衡.然后静置分层,将油水两 相分离,水相为反胶团反萃取液.用移液管抽取下相 (水相)溶液,在568am,620am和650nm下测吸 光度,计算藻蓝蛋白的含量. 1.3.4藻蓝蛋白萃取率,分配系数和分离因数 在反胶团体系萃取过的螺旋藻细胞破碎液(粗 提液)中,藻蓝蛋白富集于反胶团体系的上相(即反 胶团溶液有机相),因此,计算藻蓝蛋白萃取率 (E),藻蓝蛋白反萃取率(E),分配系数()和 分离因数()如式4—式7: E:×100%(4)【PC] 0 ×Vo E,:=[3×100%(5) 【PCl0×vo×E : [PC](6) =面羽[PC]t/[PC丽]b(7) 式4一式7中的V代表溶液体积,下标0,t,b分 别代表粗提液,萃取或反萃取后反胶团体系上相(有 机溶剂相)和下相(水相)的溶液. 2结果与讨论 2.1盐离子种类和浓度对萃取的影响 盐离子种类和浓度主要影响蛋白质与表面活性 剂极性头之间的静电作用力.表l中显示出几种盐对 反胶团萃取螺旋藻藻蓝蛋白的影响.由表1可见,改 / ? 32? 变阴离子种类(C1一,SO4,PO4孓)对萃取的影响大于 改变阳离子种类(1(+,Na+,Mg2+)对萃取的影响.这 是由于本实验采用的阳离子表面活性剂CTAB,因此 该表面活性剂分子的头部受到阴离子的静电屏蔽作 用较大,并且随着离子价态的增加,即离子强度的增 加,这种静电屏蔽作用越大,如表1中所示,在相同的 天津科技大学学报第23卷第2期 盐浓度下,K3PO4作用下的藻蓝蛋白萃取率比KC1作 用下的萃取率降低了15.7%,同时分配系数降低了 527%,分离因数降低了104%;而对于不同的阳离子 种类的影响却没有这么显着,对于K2s04,Na2SO4和 MgSO4作用下的藻蓝蛋白的萃取率和分离因数的变 化均未超过2%,分配系数变化未超过20%. 表1盐离子种类对反胶团萃取藻蓝蛋白的影响 Tab.1EffectofsalttypeonreversedmiceHesextractionofc-phycocyanln 萃取现象 分相快,油水界面清晰 分相较快,油水界面模糊 分相慢,出现中间乳化层 分相较快,油水界面模糊 分相较快,油水界面模糊 曰% 96_3 90.5 80.6 9l_1’ 89.6 X 26.O 9.53 4.15 10.2 8.62 B l_53 l_11 O.75 l_13 1.11 注:0.04mol/L的CTAB/iE戊醇.正辛烷(体积比1:1)反胶团体系萃取,pH=7,包含 0.1mol/L不同盐种类的螺旋藻细胞破碎液 图1显示了不同种类的盐浓度对藻蓝蛋白萃取率 的影响.由图可见,在不同的盐浓度下,KC1,K2SO4 和K3PO4对藻蓝蛋白的影响与表1中的结果相吻合; 同时,随着盐浓度的增加,藻蓝蛋白的萃取率逐渐下 降,这进一步说明离子强度对反胶团萃取蛋白质的影 响,离子强度增加可削弱蛋白质与表面活性剂极性头 之间的静电作用力,导致蛋白质萃取率的下降. 图1盐离子种类和浓度对萃取率的影响 Fig.1Effectofsalttypeandsaltconcentrationon extraction 2.2表面活性剂浓度对萃取的影响 表面活性剂浓度是影响反胶团形成以及反胶团 大小的重要因素n...在表面活性剂溶液中,表面活性 剂的浓度只有超过其临界胶团浓度时,溶液中才能自 发的形成反胶团.根据胶团形成的质量作用定律,增 加表面活性剂的浓度将使有机相中胶团聚集的数目 及胶团粒径增加,导致反胶团相的萃取容量随表面活 性剂浓度的增大而提高.表2中显示的实验结果与上 述理论相吻合. 从表2可以看出:随着CTAB浓度由0.02 mol/L增加到0.06mol/L,藻蓝蛋白的萃取率由 85.4%增加到96.5‰分配系数由5.85增加到27.6,但 由于藻蓝蛋白,别藻蓝蛋白和藻红蛋白在分子质量和 ,因此,藻蓝蛋 等电点等性质上的差别并不显着【l0】 白的分离因数增加并不显着.另一方面,当CTAB 浓度增加到一定程度(高于0.05mol/L)时,有机相黏 度增大的程度影响了油水两相的分层速度,因此,本 实验研究确定表面活性剂CTAB浓度为0.04mol/L. 表2表面活性剂浓度对反胶团萃取藻蓝蛋白的影响 Tab.2Effectofsurfactantconcentrationonreversedmicellesextractionofc-phycocyanin CTAB浓度/tool?L-萃取现象K 1.47 l_31 l_53 l_58 l_49 O.02 O.03 0.04 O.O5 O.o6 分相快,油水界面模糊 分相快,油水界面较模糊 分相快,油水界面清晰 分相较慢,油水界面清晰 分相慢,油水界面清晰 85.4 92-3 96-3 96.7 96.5 5.85 12.O 26.O 29-3 27.6 注:不同浓度的CTAB/iE戊醇一正辛烷(体积比1:4)反胶团体系萃取,pH=7,包含 O.1mol/LKC1螺旋藻细胞破碎液. 2.3水相pH对萃取的影响 离子型反胶团体系萃取蛋白质主要依靠蛋白质 与表面活性剂极性头之间的静电作用力.而蛋白质是 一 种两性电解质,水相的pH决定了蛋白质分子表面 可电离基团的离子化程度,只有当蛋白质带的电荷与 反胶团内带的电荷性质相反时,才能发生萃取.本实 萃取的影 验选取了pH5,8考察水相pI-I对藻蓝蛋白 响,如表3所示.结果显示:随着水相pH的增加,藻 类一 一一砌一.二盐一 2008年6月刘杨,等:反胶团萃蛊夔夔堇呈自 蓝蛋白的萃取率,分配系数和分离因数均有不同程度 的增加,表明随着pH的增加,藻蓝蛋白偏离其等电 点(pH4.3)越大,所带的负电荷越多,导致其萃取 ? 33? 率增加.但当水相pH为8时,萃取过程中油水界面 处出现了沉淀层,说明藻蓝蛋白此时发生了变性,因 此,本实验研究选定水相pH为7. 表3水相pH对反胶团萃取藻蓝蛋白的影响 Tab.3EffectofpHonreversedmicellesextractionofc?phycocyanin pH __一 5 6 7 8 萃取现象 分相快,油水界面清晰 分相快,油水界面清晰 分相快,油水界面清晰 分相慢,出现中间沉淀层 刀% 15.6 56.3 96.3 95.3 K O.18 1.29 26.O 20l3 O.92 O.89 1.53 2.23 注:0.04mol/L的CTAB/KT戊醇.正辛烷(体积比1:4)反胶团体系萃取,包含 0.1mol/L的KCI螺旋藻细胞破碎液 2.4助剂浓度对萃取的影响 反胶团形成的理论研究【l州表明:低级醇作为助 溶剂添加到反胶团体系中,一方面可以提高表面活性 剂在有机相中的溶解度;另一方面还参与了反胶团的 形成,增大反胶团的含水量及粒径大小.本实验选取 了正戊醇作为助剂,同时考察其对CTAB反胶团体 系萃取藻蓝蛋白的影响. 如表4所示,随着正戊醇浓度的增加,藻蓝蛋白 的萃取率,分配系数和分离因数均有所增加,并且萃 取过程中油水两相的分相速度也随之增大,这与上述 的理论相一致.但当正戊醇浓度增大到一定程度(正 戊醇与正辛烷的体积比为I:3)时,藻蓝蛋白的萃 取率,分配系数和分离因数均急剧下降,这是由于助 剂正戊醇浓度过大,反胶团表面上正戊醇分子所占的 比例过大,导致反胶团内部表面活性剂CTAB分子 头部之间的静电斥力下降,从而使反胶团表面的 CTAB分子相互靠得更紧,致使反胶团变小,萃取容 量下降. 表4正戊醇浓度对反胶团萃取藻蓝蛋白的影响 注:0.04mol/L的CTAB/KT戊醇.正辛烷(不同体积比)反胶团体系萃取,pH=7,包含 O.1mol/L的KC1螺旋藻细胞破碎液 2.5藻蓝蛋白的反萃取 藻蓝蛋白的萃取率随水相pH,盐离子种类和浓 度的变化规律见表5. 表5水相pH和盐离子种类及浓度对藻蓝蛋白反萃取 的影响 Tab.5EffectofpH,salttypeandsaltconcentrationon backextractionofc?phycocyanin 盐离子浓度/E/% 种类mol’L-pH4pH5pH6pH7 13.423.715.65.8 KCl 27.956.734.212.9 KBr111?884?751?723?6 215.290.654.326.0 注:0.04mol/L的CTAB/KT戊醇.正辛烷(体积比1:4)反胶团体系 萃取,包含0.Imol/L的KC1螺旋藻细胞破碎液,藻蓝蛋白萃取率 为96.3%. 从表5可以看出,静电相互作用力主导了藻蓝蛋 白在CTAB反胶团中的萃取过程.因此,从理论上分 析,通过削弱藻蓝蛋白分子与CTAB分子之间的静 电相互作用力可实现藻蓝蛋白从CTAB反胶团中的 反萃取过程,所以,本实验在藻蓝蛋白的反萃取过程 采取降低水相pH和增加水相盐浓度的方法.在不同 的盐离子种类和浓度的条件下,藻蓝蛋白的反萃取率 整体上随水相pH的降低而增加,说明藻蓝蛋白分子 所带负电荷随水相pH的降低而减少,导致与CTAB 分子的静电相互作用减弱,从而实现反萃取率的增 加,但当水相pH为4时,反萃取过程中油水界面处 出现了沉淀层,说明藻蓝蛋白此时发生了变性,导致 藻蓝蛋白的反萃取率较低,并不符合上述反萃取率随 水相pH的变化规律;在相同pH和盐离子种类的条 件下,藻蓝蛋白的反萃取率随水相离子强度的增加而 增加,说明水相离子强度的增加可增大CTAB分子 反离子的数目,使CTAB分子的静电屏蔽作用增加, 导致与藻蓝蛋白分子的静电相可用减弱,使藻蓝蛋 (下转第64页) ? 64? 在计算机辅助公差设计中,蒙特卡洛模拟方法可 以计算任意置信度,各种概率分布的尺寸链问题,它 既适用于线性公差设计函数,也适用于非线性公差设 计函数,是一种普遍适用的公差设计方法.关于蒙特 卡洛方法在非线性公差设计函数中的应用还有待于 进一步研究. 参考文献: [2] [3] JeangA,ChenTK,HwanCL.Astatisticaldimension andtolerancedesignformechanicalassemblyunder thermalimpact[J].IIltJAdvManufTechnol,2002, 20:907—15. 方红芳.计算机辅助工序尺寸及其公差设计[M]. 上海:中国纺织大学出版社,2000. 花嵘,傅游,康继昌.直接模拟蒙特卡洛问题的 并行化方法[J].计算机工程,2004,30(5):4o_-41. 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