杜仲盐炙的化学成分和质量研究(可编辑)

杜仲盐炙的化学成分和质量研究(可编辑) 杜仲盐炙的化学成分和质量研究 辽宁中医药大学 硕士学位论文 杜仲盐炙的化学成分和质量研究 姓名:曹宇 学位级别:硕士 专业:生药学 指导教师:许? 20090501辽宁中医药大学届硕士学位论文 摘 要 .以皮入药,因其中含有大量杜仲胶,属硬 目 的:杜仲 质橡胶,煎煮时影响有效成分的溶出,故临床上多炮制至“断丝后应用,以提高有效 成分的溶出率。尽管现行版《中国药典》了其炮制方法,但缺乏量化工艺参数和客 观质量控制。因此,本论文从炮制盐炙法工艺对杜仲化学成分的影响入手,结 合杜仲炮制前后化学成分的变化分析和分离,确定因炮制工艺引起质变和量变的杜仲化 学成分。依据炮制工艺对有效成分的影响,筛选优化炮制工艺参数,制定杜仲盐炙的合 理炮制工艺,建立炮制品的质量控制标准,为临床用药的有效性和安全性提供保障。 材料与方法: 材料:杜仲科植物杜仲 .的干燥树皮,购自草药店。 方法: .采用光谱法、法、法,分析杜仲生品和炮制品化学成分的差异,研究炮 制工艺对杜仲化学成分的影响。 .采用硅胶、凝胶、高效液相等色谱技术,分离杜仲高温炮制后变化显著的化学成分。 利用理化性质和核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、质谱数据鉴定分离得到的化合物结构。 .采用法和指纹图谱法鉴定杜仲中受炮制工艺显著影响的化学成分。 .依据“断丝且不损失有效成分的原则,优化杜仲的炮制工艺参数,制定杜仲的炮制 工艺,建立炮制品质量标准。 结果: .炮制工艺对杜仲化学成分的影响结果表明,当温度达到?以上,杜仲即可“断丝, 而且当温度超过?时,生品和炮制品的化学成分差异显著。 .共计分离得到个化合物,其中从生杜仲中分离得到个化合物,栀二醇为首次从杜 仲中分离得到。从盐杜仲中分离得个化合物。 .高温炮制后杜仲的多数成分含量明显降低。环烯醚萜类活性成分京尼平、栀二醇、杜 仲醇、京尼平苷酸显著减少,木脂素类松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、中脂 素二葡萄糖苷的含量也大量损失。高温炮制后的增量成分松脂素、表松脂素、中脂素是 炮制后显著减少的双环氧木脂素苷类化合物的苷元。 .依据“断丝”且不损失有效成分的原则,确定杜仲的盐炙工艺为:取杜仲丝或块,%杜仲盐炙的化学成分和质量研究 盐水润透,烘干,再于?烘制分钟。根据此工艺,制订了盐杜仲的质量控制 标准。 结论: .本论文首次采用光谱.色谱联用的方法,考察炮制工艺参数对杜仲化学成分的影响, 从宏观和微观上明确了杜仲炮制前后化学成分的变化。 .首次确定杜仲经高温炮制后变化显著的多个化学成分。以多种活性成分为对照品,建 立杜仲药材的指纹图谱。研究结果表明,炮制温度对杜仲化学成分影响明显,尤 其是杜仲中的环烯醚萜类和木脂素类活性成分在高温炮制后含量明显减少,为杜仲的盐 炙工艺和盐炙品的质量控制研究提供科学依据。 .通过生品和炮制品的对比分析,本论文首次提出“断丝且不损失有效成分的杜仲盐 炙的炮制原则,并依据该原则确定杜仲的炮制工艺,制订炮制品的质量控制标准。 .本论文对杜仲盐炙工艺研究结果与古文献记载的杜仲应采用“文火、“中火”炒至 “断丝”的论述相吻合。 关键词:杜仲;炮制;光谱.色谱分析;化学成分辽宁中医药大学届硕士学住论文 . :.,. . ,, , . . , , . .: : . 。 :.. , , 一. . ?. . .“ ”,,.杜仲盐炙的化学成分和质量研究 . ’ ’.。, . . . . .. . ., , . , .,. .‘ ’, 、析 % 。. .: .? , . ., . . , . , . ...辽宁中医药大学届硕士学位论文 ‘‘ . ”. ”. “ ”‘ : ;;? ; .辽宁中医药大学学位论文独创性与真实性声明 本人郑重声明:在我呈交的学位论文中,本人经研究所得的数据、原理、结论等一 切内容均真实,且经本人认真核对无误;我呈交的与学位论文相关的资料原始、 照片、录像片、检查化验报告单等确为完整的学位论文研究中的原始资料,本人没作 任何修改;我呈交的学位论文是我本人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中没有其他人已经发表或撰写过的 研究成果,其他人对我完成此论文的帮助以及对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确说明并表示谢意。 我呈交的学位论文及与该论文相关的资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。 学位论文作者签名?啦 期:‘卅年‖月哲 / 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解辽宁中医药大学有关保留使用学位论文的规定,同 意学校保留或向国 家有关部门机构送交论文的印刷版和电子版,允许被查阅和借阅。本人授权辽宁中医药 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩 印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 学位论文作者签名亟宝学位论文导师签名舢 日期:叼年石月谚日杜仲盐炙的化学成分和质量研究 言 前 刖 看 杜仲为杜仲科植物杜仲 .的干燥树皮,俗称木棉、丝连皮等, 全世界只有一种,为名贵滋补药材。原产于我国,主要分布于贵州、四川、湖南、湖北、 《神农本 陕西等地,在日本、朝鲜、缅甸亦有栽培。杜仲入药已有多年的历史, 草经》和《本草纲目》均将其列为上品,具补中益气、坚筋骨、强志、安胎、久服轻身 耐老之功效。杜仲含有多种活性成分,主要包括木脂素类、环烯 醚萜类、苯丙素类等。 现代研究表明,杜仲具有降压、利尿、抗菌、抗炎、镇静、镇痛等药理作用。 杜仲的炮制方法始载于《雷公炮炙论》,此后历代医书、本草和各地炮制均记 载了杜仲的炮制方法,认为杜仲炮制后,补肝肾作用增强,炮制程度以“去丝或断丝 为标准。现代研究认为,杜仲中含有大量的杜仲胶,是杜仲中的非药效成分,煎煮时影 响有效成分的溶出。高温加热后杜仲胶可被破坏,有利于有效成分的溶出。 目前有关杜仲的炮制研究有很多不足之处,主要表现在如下方面:?版《中国 药典》一部杜仲【炮制】项下收载了杜仲和盐杜仲,其中盐杜仲的炮制方法为“取杜仲 块或丝,照盐水炙法炒至断丝、表面焦黑色。此炮制方法没有对炮制温度和时间等详 细炮制工艺参数的规定。?杜仲的炮制程度判定标准为“断丝,其主观性和经验性 较强,缺乏量化参数和客观指标。?尽管很多学者对杜仲的炮制进行了研究,但所得 结论差异较大。?有关杜仲炮制过程中化学成分的变化过程、机 理和影响因素研究较 少。?缺乏盐杜仲的质量控制标准。?市售杜仲质量差异较大。上述问题势必会影响 杜仲的质量和临床疗效。 鉴于上述盐杜仲商品和文献研究分析,本课题拟从化学成分分析入手,深入研究炮 制对杜仲化学成分的影响,为制定杜仲的炮制工艺和建立炮制品质量控制标准提供科学 依据。采用色谱法分离炮制前后变化显著的化学成分,为杜仲盐炙工艺参数优化和炮制 品质量标准的建立提供对照物质和指标成分,也为杜仲盐炙的炮制机理研究奠定基础: 故本文采用光谱法、法和法,比较分析杜仲生品和不同炮制工艺参数炮制 品的化学成分差异,确定炮制工艺对杜仲化学成分的影响。以杜仲的生品和炮制品化学 成分的薄层色谱差异为指导,分离、鉴定杜仲炮制前后变化显著的化学成分,为杜仲的 炮制工艺优化和炮制品质量标准研究提供控制指标和科学依据。在此基础上,依据炮制 工艺参数对杜仲“断丝”和化学成分的影响,确定杜仲的炮制工艺,建立炮制品质量控 制标准,为杜仲临床用药的有效性和安全性奠定基础。辽宁中医药大学届硕士学位论文 文献综述 杜仲研究概况 杜仲为杜仲科植物杜仲 .的干燥树皮【】,全世界只有一种, 属于国家二类珍惜保护植物,为我国名贵滋补药材【】。主要分布于贵州、四川、湖南、 湖北、陕西等省。药用历史悠久, 《神农本草经》始载杜仲的药效,味甘微辛,具补中 益气、坚筋骨、强志、益腰膝、除酸痛、除阴下痒湿、小便余沥,久服轻身耐老之功效。 《本草纲目》则总结了历代经验对杜仲的药理认识,认为杜仲“肝主筋,肾生骨,肾充 则骨强,充则筋键,屈伸利用,皆属于筋。杜仲色紫而润,味甘微辛,甘气温平,微辛 润,故能入肝而补肾,子能令母实也【】。 杜仲是我国特有的名贵药材,其产量占世界资源的%以上,但其综合利用率较低, 高附加值产品太少,廉价出售树皮,造成资源的浪费与恶性循环【】,迫切需要对杜仲进 行全方位的研究,提高杜仲产品在国际上的竞争力,推进中药现代化。本文从化学、药 理、炮制应用等方面对杜仲的研究概况进行综述。 一、杜仲化学成分及药理研究概况 ’ .杜仲化学成分研究 对杜仲化学成分的研究始于二十世纪五十年代,为了确定杜仲的活性物质,各国学 者对杜仲进行了大量研究,发现杜仲中主要的化学成分有木脂素类,环烯醚萜类,苯丙 素类,黄酮,多糖,氨基酸,杜仲胶等有机化合物及钙、铁等无机微量元素【。目前经 过分离和鉴定的有机化合物约有种以上,无机矿物元素不少于种【,现对杜仲中主 要的活性成分归纳如下: .木脂素类 木脂素类化合物是杜仲的化学成分中研究最多、结构最清晰、成分最明确的一类化 合物,有关杜仲中木脂素类化合物的报道已有上百篇阴。木脂素是一类在生物体内由双 分子苯丙素衍生物聚合而成的化合物【,其在杜仲皮中含量较叶中高【】。迄今为止,从 杜仲皮中分离出的木脂素类化合物已有种,包括双环氧木脂素、单环氧木脂类、新木脂 素和倍半木脂素【。多数为苷类化合物,其糖基均为..葡萄糖。结构类型多为双环氧 木脂素,如松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷,其中丁香脂香兰素醚双糖苷是新 发现的一种木脂素类物质【】。杜仲盐炙的化学成分和质量研究 .环烯醚萜类 环烯醚萜及其苷在植物界中分布较广,是由植物中臭蚁二醛转变而来的单萜类化合 物,分子中含有环烯醚键。杜仲醇类无环烯醚键,可看成环烯醚萜开环后的产物,为裂 环环烯醚萜类型的化合物【】。另外,环烯醚萜还可形成多聚体。研究发现,环烯醚萜在 杜仲皮和叶中的含量有较大区别。环烯醚双键性质活泼,羟基呋喃环极不稳定,苷易被 酶和酸水解,在鲜品和干品中的含量差别较大。原因是树皮中含有使环烯醚萜分解的胞 内酶存在,采集的树皮和叶在自然干燥过程中胞内酶会使活性成分发生分解。若在新鲜 树皮干燥前用沸水或微波处理使酶失活,则可有效防止分解过程的发生,使环烯醚萜类 成分保持在较高水平四。文献报道的从杜仲中分离到的环烯醚萜类化合物包括:京尼平 苷、京尼平、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷、杜仲苷、筋骨草苷、哈帕苷乙酸酯、雷朴妥苷、 杜仲醇、杜仲醇苷、脱氧杜仲醇、京尼平苷酸三聚体、京尼平苷酸四聚体、京尼平苷酸 三聚体乙酸酯、京尼平苷酸四聚体乙酸酯等个化合物。 .苯丙素类 苯丙素是形成木脂素的前体物质,在杜仲中广泛存在,主要存在于杜仲的根皮、茎 皮、绿叶、落叶【】。迄今为止,杜仲中发现的苯丙素类化合物有种:咖啡酸、二氢咖 啡酸、愈创木丙三醇、松柏醇、丁香苷、间羟基苯丙酸、绿原酸、绿原酸甲酯、香草酸、 寇不拉苷、松柏苷。 .黄酮类 黄酮类化合物也是杜仲的主要有效成分,目前对黄酮类化合物的报道多见于含量测 定,其含量的高低是判断杜仲药材及其饮片质量的重要指标【】。从杜仲叶中分离到的黄 酮类化合物包括:异槲皮素、、槲皮素.一一木糖?一葡萄糖、山奈酚、 棚皮素、紫云英苷、陆地锦苷、芦丁、一个简单的酚类物质、,.二羟基苯甲酸和葡萄 糖乙苷。药理研究结果表明,这些黄酮化合物均具有较强的生物活性【】。 .其他 杜仲中除含有以上几类主要的活性成分外,还包括杜仲胶、多糖、杜仲抗真菌蛋白、 萜类化合物、氨基酸、脂肪酸、维生素及微量元素等成分。 .杜仲药理作用研究 杜仲的现代药理学研究始于上世纪年代,经过中外科学工作者多年来细致的研 究,发现杜仲具有降压、降血脂、抗衰老、抗肿瘤、保肝利胆、抗菌消炎、镇静止痛、 利尿等功效。这些药理作用的物质基础是其所含的木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、辽宁中医药大学届硕士学位论文 黄酮类等成分【。现将其药理作用分述如下: .降压 杜仲被认为是“世界上无副作用的最高质量的天然降压药”【。杜仲中所含的松酯 醇二葡萄糖苷是杜仲的主要降压成分。最新研究发现,京尼平苷酸具有良好的降低血压 和调节血压的作用。日本健康与福和部最新确认杜仲的降压作用最主要是归功于京尼平 苷酸【】。杜仲的皮和叶所含的糖类、生物碱、绿原酸、桃叶珊 瑚苷均有不同程度的降压 作用,其水煎液的降压作用比醇提液强。从杜仲皮及叶中分离出的含环烯醚萜苷类和木 脂素类的提取物口服后能降低大鼠血压。杜仲中的微量元素锌含量较高,可以通过纠正 阴虚证型高血压病人的锌含量而起到降压作用。杜仲皮煎剂.,和杜仲叶浸提物制剂 ./均可使正常大鼠的血压降低【】。 .抗衰老及抗肿瘤 杜仲叶的水提物有抗脂质过氧化作用,对大鼠肝脏、肌肉的脂质过氧化有明显的保 护作用。杜仲的保健品抗氧化效果比维生素好得多,另外杜仲愈伤组织也有很好的抗 氧化作用。生杜仲水煎液灌肠给药,,可使醋酸可的松造成的类阳虚小鼠红细胞活力 增加。杜仲可促进人体皮肤、骨骼、肌肉中胶原蛋白的合成和分解,促进代谢,预防衰 老。杜仲中所含的京尼平苷、桃叶珊瑚苷有抗肿瘤活性。杜仲皮、叶所含的丁香脂素二 葡萄糖苷对抑制淋巴细胞白血病有较好的活性,浓度./口控制/值】。 .抗炎抗病毒 杜仲中所含的绿原酸有较强的抗菌作用,能兴奋中枢神经,促进胆碱和胃液分泌, 提高白细胞数量和抗病毒作用。所含的桃叶珊瑚苷具有明确的抗菌、抗病毒及保肝活性, 能明显抑制乙型肝炎病毒的复制。杜仲煎剂能使小鼠血液中淋巴细胞百分率降低, 幼年小鼠胸腺萎缩。并可使大鼠肾上腺中维生素含量降低,血中皮质醇含量明显增加。 大鼠灌服杜仲煎剂/,对蛋白性足肿有明显抑制作用,灌服杜仲皮、叶、再生皮、枝 煎剂的醇沉物/,对血清性脚肿也有抑制作用【。 .免疫功能 杜仲的皮、叶、枝、再生皮及杜仲煎剂灌服,对氢化可的松作用下小鼠巨噬细胞吞 噬红细胞功能有明显影响,吞噬活力增加。从杜仲叶的氯仿提取物中分离得到的地黄普 内酯是一种主要干扰淋巴细胞功能的免疫抑制物质。皮下注射从杜仲皮中分离出来的 含环烯醚萜苷类和木脂素类的提取物能提高小鼠血中碳粒廓清率、增强网状内皮系统的 吞噬能力。杜仲茶提取的碱性物质有抗破坏人体免疫系统病毒的功能。给小鼠注射杜仲杜仲盐炙的化学成分和质量研究 叶的%和%的乙醇提取物,可明显增强小鼠脾淋巴细胞转化功能及腹腔巨噬细胞的 。 吞噬功能,而对正常小鼠脾抗体形成细胞无明显影响【 .其它 杜仲叶醇提物具有类似性激素作用,能增进实验动物骨髓生成和增加其骨髓的强 度。杜仲叶的水煎剂对离体大鼠子宫有抑制作用,对关节炎有防治作用和明显的镇痛作 用。杜仲所含的京尼平苷酸、丁香脂素二葡萄糖苷、绿原酸均有抗应激作用。桃叶珊瑚 苷能刺激副交感神经中枢,加快尿酸转移和排出,利尿作用明显,是利尿作用的有效成 分。杜仲叶可致大鼠肉芽肿成熟和胶原在肉芽肿的沉积,促进伤口愈合进程。此外杜仲 还有降血糖、降血脂、镇静等作用【。 二、杜仲的炮制研究 杜仲在临床上多经炮制后入药,杜仲的炮制方法始载于《雷公炮炙论》,古人对此 积累了丰富的实践经验,至清末约年的研究历史,至少有部医药书籍记载了杜仲 的炮制资料【】。 .古代杜仲炮制发展概况 .唐以前及唐时期【】 净制方面,陶弘景云:“凡用杜仲皆去削上虚软甲,取里有味者秤之。切制方面, 《新修本草》: “横理切,令丝断也,其意一为切制方向按杜仲药材条纹横向切制, 二为以切制达到断丝。火制方面, 《雷公炮炙论》提出了酥蜜炙,并明确规定了辅料比 例及用量。《千金翼方》中有近二十个含杜仲的医方,采取不同切制方法,有捣为末蜜 丸、散剂、切药酒等。 .宋及金元时期【】 杜仲切制最常见的是“切或“锉”。有炙后“横锉、“锉如豆炒”、“细切’’ 及“锉碎,有“捣烂酒炒干、“杵碎”酒炒焦等。这时杜仲的火制方法,继承了前 人“炙法的同时,“炒法逐渐得到了较多的应用。杜仲的炮制火候,既受前人的影 响,体现为较轻缓,有“炙令微黄或“微炙等,又有了些新特点:“炙丝断、“炒 尽丝”;“姜汁炙令无丝或“姜汁炒令丝绝”;还有“栈炙令烟绝”。《普济方》则 以“炒令黑”为杜仲炒制的火候标准。 .明清时期【】 该时期,姜汁制、酒制、酥制、盐水制、盐酒制、姜酒制、麸炒等多种杜仲炮制品, 在临床中广泛应用。火制加热形式以“炒’’法为主,并有一些新的炮制方法:用糯米煎辽宁中医药大学届硕士学位论文 汤浸透炒去丝与酒浸续断配伍用于预防频惯堕胎,“面炒、“茴香盐水拌炒、“小 茴香盐醋汤浸炒、“醋制、“便浸炒等。 .现代杜仲炮制发展概况 随着现代科学技术的发展,近年来对杜仲的炮制研究,吸取了诸多前人的炮制经验, 运用先进设备和较为科学的手段,探索出了一些既符合临床需要又有利于提高炮制品质 量的工艺与方法【】。 .采集加工 用局部剥皮法、大面积环剥法或砍树剥皮法剥下杜仲皮后,将剥下的树皮用开水烫 后平放,以稻草垫底,将杜仲皮紧密重叠铺上,上用木板加重物压平,四周用稻草盖严, 使之发汗,注意树皮间不能留有空隙.否则发汗不匀。~周后,从中间抽出一块检查, 如呈紫黑色,即可取出晒干,刮去粗糙表皮,使之平滑,把边缘切修整齐,然后再分成 各档规格【】。 .净制 杜仲未去粗皮块的煎出率比去粗皮块低.%,粗皮占药材的%以上,故认为杜 仲去粗皮入药是必要的。杜仲叶与皮的化学成分基本一致,在药理、药效上与皮具有同 等功效。杜仲夏叶的浸提物得率明显低于杜仲秋叶,而其浸膏粉中的绿原酸及桃叶珊瑚 苷的含量也明显低于杜仲秋叶,因此可考虑将秋叶作为入药部位。杜仲药材有干树皮、 根皮、枝皮之分,树有大小之别,药材厚度差异很大。国家中医药管理局和卫生部 年制定的“种药材商品规格标准”规定,特等厚度为.以上,一等为.以上, 三等最薄不小于.。平时药用杜仲多为多种规格混杂。杜仲炮制时宜分档加工,否 则炒制火候不易掌握,而导致“太过或“不及的现象。多次实验结果表明,不分档 清炒损耗率为%~%左右;分档清炒损耗率为%%左右【。 .切制 杜仲横丝的煎出率纵丝丁条块带粗皮块,横丝的煎出率比纵丝高出.%, 丝片总成分溶出量优于块片,表明切制形状、方向和规格能影响煎出率。认为按与杜仲 丝生成的垂直方向进行切断,将有利于杜仲总成分的溶出。杜仲不同切制规格,其煎出 率也不尽相同,实验研究结果表明,横丝纵丝块;横丝以切成.宽最有利于总成 分的煎出。从炮制时间看,在同一条件下,烫制块片需才能达到断丝要求,而丝 片只需即可,且丝片切制简便,能提高工效,利于机械化生产口。 .炒制杜仲盐炙的化学成分和质量研究 ..清炒杜仲 生品置炒锅内,先武火后文火,不断翻炒,炒至断丝,有的块边缘开始冒烟,外表 黑褐色,内褐色,丝断取出。盐杜仲:取杜仲丝或块,用盐水拌匀,闷透,置锅内用文 火加热,炒至丝断,表面焦黑色,取出放?,每药材加食盐。或取杜仲丝或块, 用盐水润透,放置一夜,蒸,取出,干燥。每药材用食盐.。盐制增强补肝 肾、强筋骨作用。砂烫杜仲:将杜仲块按厚薄大小分档,喷洒适量 盐水每杜仲块用 食盐,拌闷备用。再将干净细砂置锅内加热,翻炒至沸腾状,然后将杜仲块倒人锅 内,快速翻炒至表面呈黑褐色,取出筛去细砂,摊晾,备用。砂烫杜仲的水溶性浸出物、 绿原酸含量和成品收率均高于炒杜仲炭,认为砂烫杜仲炮制法可以取代炒杜仲炭法。由 于杜仲炭在炮制过程中损耗达%,故学者们争议较大。 ..烘杜仲 将杜仲块按大小厚薄分档,置于电烘箱内??,见杜仲块呈褐色取出,喷 盐水每埏杜仲块用食盐,摊晾,备用。或杜仲加盐水润透,烤箱中烘烤。 ..杜仲炭 取杜仲块置锅内武火炒至黑色并断丝存性,用盐水喷洒,取出晾干。或取杜仲块先 用盐水拌匀,吸尽后置锅内武火炒至黑色并断丝存性,用水喷灭火星,取出晾干。每 药材用食盐埏【。 ..土炒杜仲 土炒法与砂烫法相似,当灶心土至灵活状态时,温度为?,杜仲炒约出锅 喷盐水即成。炒杜仲温度较高且易控制温度,杜仲受热均匀,胶丝易断,断丝率可达% 左右,损耗率最低仅为%,每锅用时约。炒后杜仲疏松且丝易断,易吸收盐水, 能增强补肝肾之效。土炒能增强健脾、止血作用,对于妇科胎动不安的治疗更为适用【】。 ..微波加热法 将杜仲刮去粗皮切成宽的块片,用规定量的食盐水拌匀,闷润,平摊,层厚约 ,设定微波强度和加热时间,即时取出,放晾即可。微波加热法样品中绿原酸的含量 高于炒法和烘制法的样品,这可能与微波加热具有穿透力强、内外同时加热、加热时间 短有关,且炮制品外观完整,无焦化糊化现象。而烘箱要预热至?温度,烘匍, 且炮制品多呈焦黑色,不完整,有焦化糊化斑。薄层层析对比实验证明微波对盐杜仲的 有效成分影响不大【。 不同炮制方法直接影响到药材的成品收率,内在质量和临床疗效,因此对杜仲的炮辽宁中医药大学届硕士学位论文 制工艺和方法从化学成分,药理作用等方面进行全面深入的研究是十分必要的,为保证 杜仲的临床疗效提供科学依据。 参考文献 【】中华人民共和国药典一部.:. 【】张康健,张檀.中国神树一杜仲.北京:经济管理出版社,:. 】冯锁民.杜仲化学成分研究及两种新药制剂学研究:博士学位论文.西北大学, . 【】王文明,宠晓萍,成军等.杜仲化学成份研究概况.西北药学杂志.,: .. 【】刘守延,关雄俊,李献萍等.杜仲及其炮制品中某些微量元素含量的比较.中国中 药杂志.,:. 【】李东.杜仲化学成分.植物学报.,:.. 【】管淑玉,苏薇薇.杜仲化学成分与药理研究进展.中药材.,:.. 【崔克明.杜仲研究历史、现状和展望.西北林学院学报.,:?. 【】续俊文.杜仲的化学成分.植物学报.,:?. 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炮制前后化学成分是否发生变化以及变化明显的极性部位。在此基础上,采用和 法,深入分析炮制前后在紫外光谱中化学成分变化显著的极性部位,明确炮制前 后显著变化的化学成分的理化性质和色谱行为,为杜仲炮制前后变化显著的化学成分的 分离纯化、结构鉴定奠定基础。 第一节炮制对“断丝刀的影响研究 实验材料 .材料 生杜仲丝购于北京同仁堂,产地四川。 .主要仪器及设备 .型数显电热恒温干燥箱上海沪南科学仪器联营厂。 实验方法 年版《中国药典》一部记载的盐杜仲的炮制方法为:“取杜仲块 或丝,照盐水 炙法每药材用食盐,炒至断丝、表面焦黑色”。本试验按该法制备盐杜仲 时发现,此法温度和火候是影响炮制品质量的重要因素,而且温度和火候不易控制。火杜仲盐炙的化学成分和质量研究 候不够,丝不易断;火候过大,则药材易炭化。 关于杜仲炮制的“火候,各有关书籍说法不一,有“文火“中火“武火”之 别【】。火候不同,炮制所需时间及炮制品质量也有差异。温度低所需炮制时间长,浪费 工时及能源。温度过高,药材容易炭化,影响药材质量。因此,有必要对盐杜仲的质量 影响因素进行考察。 .炮制程度判定标准 年版《中国药典》一部中规定盐炙杜仲的炮制程度为炒至“断丝”,因此本试 验以“断丝’’为炮制程度判定标准,研究不同炮制工艺参数对“断丝’’的影响。 .温度控制方法 参考杜明华‘在研究炮制温度对杜仲的影响时所采用的电热干燥箱烘烤法,以烘箱 控制温度。该方法便于控制温度和时间,其炮制品无焦斑,不炭化, 内外一致。因此, 本实验将%盐水润透的杜仲放置于烘箱内,设置所需温度,烘烤。以“断丝为标准, 考察不同炮制工艺参数对“断丝”的影响。 .工艺参数的选定 据文献报道,杜仲在炮制过程中温度和时间是影响其成分变化的主要因素。因此 本试验以炮制温度和时问两个主要工艺参数为考察对象,考察不同温度和时间对杜仲 “断丝”的影响。“断丝”的判定标准依据《中药炮制学》【叶定江主编,上海科学 技术出版社出版年出版: “丝易断,银白色橡胶丝减少,弹性减弱”。 ..炮制温度对“断丝程度的影响 依据传统炮制工艺,先将杜仲丝用盐水润透,由于盐水润后的药材含水量较大,无 法准确考察温度及时问对炮制程度的影响,因此选择先在?将药材烘干,去除多余水 分。再放入烘箱,炮制温度分别设定为?,?,。,?,?。以“断 丝’’为炮制程度,考察不同温度对“断丝的影响。 方法:取生杜仲丝,%盐水润透,平铺在不锈钢方盘内,放入烘箱,。烘干。 再将上述处理好的杜仲丝分别在、、、、。烘烤加热,不时取样观察, 考察是否“断丝”,结果见表。 表温度对“断丝’’程度的影响 温度 断丝程度 ?辽宁中医药大学届硕士学位论文 . ? ? ? ? 注:一断丝;断丝 由表可见,在、、?烘制杜仲,均能达到“断丝”的炮制程度。温度 为。,。时,虽然可以使其断丝,但是会出现“回生”现象药材放?后,橡胶 丝又会恢复成生品时的状态。由此可见,杜仲的炮制温度以?以上为宜。 ..炮制时间对“断丝”程度的影响 根据上述研究结果,选择能够使杜仲“断丝的炮制温度?以上,详细考 察炮制时间对杜仲“断丝”的影响。分别选择、、?为炮制温度,考察“断 丝所需时间。 方法:取生杜仲丝,%盐水润透,平铺在不锈钢方盘内,放入烘箱,。烘干。 再将上述处理好的杜仲丝分别在、、。力:热烘烤,定时取样观察。考察杜仲 在不同温度“断丝所需时间,结果见表。 表时间对“断丝程度的影响 注:一断丝;断丝 由表可见,温度为?时,加热分钟,杜仲可“断丝。温度为时, 杜仲达到“断丝所需时间是分钟。温度为?时,杜仲达到“断丝”所需时间是 分钟。由此可知,杜仲在~。温度范围内,都可以达到“断丝”的程度,但是 所需的时间各不相同。 结果分析 通过不同炮制温度和时间对杜仲“断丝”程度的考察,可知杜仲在~温度 范围内炮制,都可以达到“断丝的程度。但不同炮制温度和时间是否会引起杜仲的化 学成分发生变化尚不清楚,因此有必要深入研究在不同温度和时间下“断丝”的炮制品 的化学成分,才能为杜仲炮制工艺参数的确定提供合理依据。杜 仲盐炙的化学成分和质量研究 第二节炮制对化学成分的影响研究 实验材料 .材料 生杜仲丝购于北京同仁堂,产地四川。 杜仲炮制品的制备:取生杜仲丝,以%盐水润透,平铺在不锈钢方盘内,放入烘 箱,?烘干。再将上述处理好的杜仲丝分别在?烘带分钟、分钟,烘 伟分钟、分钟,?烘分钟、分钟,制成炮制品,备用。 薄层层析硅胶青岛海洋化工厂生产。 .主要试剂 氯仿、丙酮、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯,乙腈为色谱纯天津科密欧化 学试剂有限公司生产。 .主要仪器及设备 .型数显电热恒温干燥箱上海沪南科学仪器联营厂; 紫外光高效液相色谱仪美国安捷伦公司。 谱仪日本亡公司; 实验方法 .紫外图谱组分析 紫外.可见吸收分光光谱法是分子在.波长范围内的吸收谱线,该 法灵敏 度较高,测定准确度可达.%,可用于化合物的定性和定量分析。紫外光谱对有机化 合物进行定性鉴别的主要依据是多数有机化合物具有特征吸收光谱,如吸收光谱的形 状、吸收峰的数目、各吸收峰的位置、强度和相应的吸光系数等。结构完全相同的化合 物应具有完全相同的吸收光谱。若样品中有两个或两个以上组分时,可根据各组分相互 重叠后的吸收光谱对各组分进行定性分析【。 杜仲的主要活性成分木脂素和环烯醚萜类化合物在紫外区有较强的吸收,因此采用 紫外光谱法对杜仲生品和炮制品的化学成分进行定性研究,可从宏观上分析杜仲炮制前 后化学成分是否发生变化及变化明显的极性部位。根据杜仲主要化学成分的极性特点, 分别测定杜仲生品和炮制品的甲醇总提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物的紫外图 谱,并对其特征进行分析,明确杜仲炮制前后化学成分是否产生变化以及变化明显的极 性部位。 ..生品和制品甲醇提取物的紫外图谱分析辽宁中医药大学届硕 士学位论文 ...紫外光谱图测定 供试品溶液的制备:取杜仲生品和不同工艺参数炮制品的干燥粉末各,精密称定, 加入%甲醇,密塞,称定重量,超声分钟,冷却后称定重量,用%甲醇 补足减失的重量。滤过,取续滤液。 空白溶液阴性液:%甲醇试剂。 测定波长范围:.。 ...生品与制品的紫外图谱对比 为了分析的方便、直观,将所有供试品的紫外图谱叠加在一起,见图。各供试品 相应的吸收波长见表。 .。,分钟.。,分钟.。,分钟 表生品及制品甲醇提取物的紫外吸收波长杜仲盐炙的化学成分和质量研究 注;??波长;??吸光度 由图和表可见,所有供试品的紫外吸收情况主要分成两组:、、、号供试 品的紫外图谱基本相同,、、号供试品的紫外图谱基本相同。即生品与。烘制 分钟、分钟,?烘制分钟制品的峰形基本一致,而?烘制分钟, ?烘制分钟、分钟制品的紫外图谱与生品相比,峰形发生了明显 变化。由此可 见,这些炮制品的化学成分的组成或比例发生了改变。 为详细分析,将生品分别与?烘制分钟制品和?烘制分钟制品的紫 外图谱叠加在一起,见图。 枷 娜 硼 篇 枷 图生品、制品?,分钟、?,分钟甲醇提取物的紫外图谱 .生品.。,分钟制品.。,分钟制品 由、号供试品的紫外叠加图谱可见,二者的紫外图谱非常相似,表明化学成分 未发生明显变化。由、号供试品的紫外叠加图谱可见,二者在~处谱图峰 形和吸光度有较大差异。通过对比分析,发现在高温条件下,杜仲化学成分的组成或比 例发生了改变。高温炮制对杜仲的化学成分有明显影响,低温炮制对杜仲的化学成分影 响较小。 ..生品和制品乙酸乙酯提取物的紫外图谱分析 ...紫外光谱图测定 供试品溶液的制备:取杜仲生品和不同工艺参数炮制品的干燥粉末各,精密称定, 加入%甲醇,密塞,称定重量,超声,冷却后称定重量,用%甲醇补辽 宁中医药大学届硕士学位论文 足减失的重量。滤过,精密量取续滤液置蒸发皿中,蒸干。用乙酸乙酯溶解,并 稀释至适宜浓度。 空白容液阴性液:乙酸乙酯试剂。 测定波长范围:。 ...生品与制品的紫外图谱对比 为分析方便,将所有供试品的紫外图谱叠加在一起,见图。各供试品相应的吸收 波长见表。 图生品及制品乙酸乙酯提取物的紫外图谱 .生品.,分钟.。,分钟.,分钟 .,分钟.。,分钟.。,分钟 表生品及制品乙酸乙酯提取物的紫外吸收波长杜仲盐炙的化学成分和质量研究 由图和表可见,所有供试品的紫外吸收情况主要分成两组:、、、号供试 品的紫外图谱基本相同,、、号供试品的紫外图谱基本相同。即生品与。烘制 分钟、分钟,烘制分钟制品的峰形基本一致,而。烘制分钟, 烘制分钟、分钟制品的紫外图谱与生品相比,峰形发生了明显变化,说明这 些炮制品的乙酸乙酯提取物的化学成分的组成或比例发生了改变。 将生品分别与烘制分钟制品和?烘制分钟制品的乙酸乙酯提取物 的紫外图谱叠加在一起,见图。 ,蚰 ,鞠 猢 铷 枷 ,触 蛳 猢 图生品、制品,分钟、,分钟乙酸乙酯提取物的紫外图谱 。生品。,分钟制品.。,分钟制品 ?由、号供试品的紫外叠加图谱可见,二者的紫外图谱的谱图峰形相似,表明化 学成分的组成未发生明显变化。由、号供试品的紫外叠加图谱可见,二者在~ 处谱图峰形有较大差异。通过对比分析,发现在高温条件下,杜仲乙酸乙酯提取物的化 学成分的组成或比例发生了改变,说明高温炮制对杜仲乙酸乙酯提取物的化学成分有明 显影响,而低温炮制对其影响较小。 ..生品和制品正丁醇提取物的紫外图谱分析 ...紫外光谱图测定 供试品溶液的制备:取杜仲生品及不同工艺参数炮制品的干燥粉术各,精密称定, 加入%甲醇,密塞,称定重量,超声,冷却后称定重量,用%甲醇补 足减失的重量。滤过,精密量取续滤液置蒸发皿中蒸干。用正丁醇溶解,并稀释 至适宜浓度。辽宁中医药大学届硕士学位论文 空白液阴性液:正丁醇试剂。 测定波长范围:.。 ...生品与制品的紫外图谱对比 为方便分析,将所有供试品的紫外图谱叠加在一起,见图。各供试品相应的吸收 波长见表。 图生品及制品正丁醇提取物的紫外图谱 .生品.,分钟.,分钟.,分钟 .,分钟.,分钟.。,分钟 表生品及制品正丁醇提取物的紫外吸收波长 注:卜波长 由图和表可见,所有供试品的紫外吸收情况主要分成两组:、、、号供试杜仲盐炙的化学成分和质量研究 品的紫外图谱基本相同,、、号供试品的紫外图谱基本相同。即生品与?烘制 分钟、分钟,?烘制分钟制品的峰形基本一致。?烘制分钟,? 烘制分钟、分钟制品的紫外图谱与生品相比,峰形发生了明显变化,说明这些炮 制品的正丁醇提取物的化学成分的组成或比例发生了改变。 将生品分别与?烘制分钟制品和?烘制分钟制品的正丁醇提取物的 紫外图谱叠加在一起,见图。 ,彻 ,轴 帅 婀 ’帅 图生品、制品?,分、?,分钟正丁醇提取物的紫外图谱 .生品.?,分钟制品.?,分钟制品 由、号供试品的紫外叠加图谱可见,二者的紫外图谱的峰形相似,表明化学成 分未发生明显变化。由、号供试品的紫外叠加图谱可见,二者在~处谱图 峰形差异显著。通过对比研究,发现高温炮制使杜仲正丁醇提取物的化学成分发生了质 变或量变,低温炮制对其影响较小。 综上分析,杜仲生品和制品紫外图谱组的分析结果表明,高温炮制品与生品的乙酸 乙酯和正丁醇提取物的紫外图谱差别显著,说明炮制温度对杜仲的化学成分影响明显。 即高温炮制对杜仲化学成分的影响明显,低温炮制对其影响较小。明确了炮制前后显著 变化的化学成分主要集中在乙酸乙酯和正丁醇部位。 . 分析 通过光谱分析,确定了杜仲炮制前后变化显著的化学成分主要在乙酸乙酯和正 丁醇部位。为了进一步明确炮制前后化学成分的变化情况,在光谱分析的基础上, 主要以杜仲及其炮制品的乙酸乙酯提取物为分析对象,采用法对杜仲生品及炮制 品进行了薄层色谱的定性分析。此法直观,快速,方便,可以用于化学成分的详细分析,辽宁中医药大学届硕士学位论文 确定炮制前后发生变化的化学成分的色谱行为,指导这些成分的分离和结构研究。 ..供试品溶液的制备 取杜仲生品、不同炮制工艺参数的制品各,粉碎,取,精密称定。分别加% 乙醇,?温浸小时。放冷,滤过,滤液蒸干。残渣加乙酸乙酯溶解,定容至 容量瓶中,作为供试品溶液。 ..薄层色谱条件的确定 ...展开剂的选择 为了使杜仲生品和各炮制品中的化学成分的斑点在薄层色谱上的相对值尽量大, 利于定性鉴别,因此选用了不同的溶剂系统,主要选择试验结果 见表。 表不同展开剂实验结果 结果显示,氯仿.丙酮.甲醇::对斑点分离效果较好,因此选择此溶剂系 统作为薄层色谱分析的展开剂。 ...显色剂的筛选 根据文献报道,杜仲中主要含有木脂素和环烯醚萜类化合物,因此选用了%硫酸 乙醇溶液,%茴香醛浓硫酸溶液,%香草醛浓硫酸溶液三种显色剂。经过对比发现,以 %硫酸乙醇溶液为显色剂,供试品色谱中的斑点显色不清晰,斑点数量少。以%茴 香醛浓硫酸溶液为显色剂,加热后,薄层板的背景为淡粉色,与供试品色谱中化学成分 显色后的斑点颜色相近,干扰供试品中显色斑点的判断。以%香草醛浓硫酸溶液为显 色剂时,加热后供试品色谱中的斑点数量多,颜色明显,显色清晰。因此选定%香草 醛浓硫酸溶液作为薄层色谱分析的显色剂。 ...点样量的考察 将上述处理好的供试品溶液,分别吸取,,肛,山,,肛,点于同一以 .%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶薄层板上,以氯仿一丙酮一甲 醇::为展 开剂,展开,取出,晾干,喷以%香草醛浓硫酸溶液,在?加热至斑点显色清晰。 结果表明,点样量为斗时,供试品色谱中斑点的分离度最好,显色最清晰。因此,选什炙?化分?质日究 择山作为薄层色蜡分析的点样量。 . ,:品及炮制品的薄层色谱分析 %羧甲基纤 分?吸墩上进供试品溶液各相当。生药母//,点于同似 维累钠为黏合剂的硅胶薄层板上,以氯仿一丙倒一甲醇::为展开剂,胜”,取, 晾干,喷以%香草醛浓硫酸溶液,在热至斑点显色清晰.结果见图。 ??毫謦?‘尊 图杜仲生品和各制品的薄层图谱 生品 ,分钟 .分钟 ,分钟 .分钟 .分钟 ,分钟 由薄层冬谱可见,随着温度的升高,辛仲的化学成分发申明显变化。当温度达到 的蓝也斑点和为.的紫色斑点 以上,杜仲炮制品的供试品色谱中,为 与‘品比较,含量明显降低,说明炮制温度对卡仲的化学成分有明 显影响。当温度达到 】。以,为 的 的粉色斑点禽最增加,并且出现了新的粉色斑点和为 绿色斑点,说明高温炮制后有新成分产生。 .分析 法具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高的特点,并上可以采用梯度洗脱 的方式埘药材中不『可极性;位的化学成分进行分离。吲此,在光谱和分析的 基硎上,为了更加明确杜仲炮制前后化学成分的细致变化,采用法建讧杜仲生品 和盐炙品的指纹罔谱,对杜仲的化学成分进行深入研究,以明确炮制后化学成分的变 化情况。根据光谱和法研究结果,选择变化明硅的?烘制分钟的炮制 品与生品进行了指纹图谱对比。辽宁中医药大学届硕士学位论文 ..供试品溶液的制备:取杜仲生品及。烘制分钟的炮制品干燥粉末各,精 密称定,置锥形瓶中,精密加入%甲醇,密塞,称定重量,超声。 冷却后称定重量,补足减失的重量。滤过,滤渣同滤纸再置锥形瓶中,加入%甲醇 ,同法提取。合并滤液,摇匀,精密移取置蒸发皿中蒸干,残渣用% 甲醇溶解,定容至容量瓶中,摇匀,微孔滤膜滤过,即得。 ..色谱条件:色谱柱..,;以乙腈为流动相,以.% 磷酸水为流动相,按下表进行梯度洗脱。流速:./检测波长:;进样 量:。柱温:室温。 表梯度洗脱程序表 .. 指纹图谱 图杜仲、盐炙杜仲指纹图谱比较图 钆生品杜仲的指纹图谱.盐炙杜仲的指纹图谱 ..杜仲盐炙的化学成分和质量研究 为详细对比分析生品与盐炙品的化学成分变化情况,将生品与盐炙品指纹图谱中的 吸收峰分别编号,并记录其吸收峰的峰面积,结果见表。 表生品和制品色谱峰的保留时间和峰面积 由杜仲、杜仲高温盐炙品指纹图谱比较图可见,与生品相比,盐杜仲指纹图谱中的 、、、、、、、、、、、号峰的峰面积分别降低了.%%,辽宁中医药大学届硕士学位论文 其中、、、、号主峰的峰面积锐减,说明杜仲在高温盐炙后这些成分的含量都 有不同程度的降低。盐杜仲指纹图谱中的、、、、、、、、号峰的 峰面积与生品相比分别增加了%~.%,说明杜仲在高温盐炙后这些成分的含量有所 增加。杜仲高温盐炙品的指纹图谱中还出现了杜仲生品指纹图谱中不具有的号和 号色谱峰,此类成分可能是杜仲药材中某种成分的高温降解产物或是杜仲药材在高温盐 炙过程中产生的新物质。由此可见,杜仲经高温盐炙后,其化学成分发生显著变化,大 量成分显著减少,同时也有新的物质产生。杜仲盐炙的化学成分和质量研究 结果和讨论 本部分研究首先考察了炮制对杜仲“断丝的影响。以杜仲传统盐炙法为依据,采 用烘烤的方法控制温度,以“断丝”为炮制程度判定标准,考察了不同温度和时间对杜 仲“断丝程度的影响。结果表明,杜仲在?~?范围内均能达到“断丝的炮 制程度,说明杜仲盐炙的温度需要达到?以上。 在上述研究基础上,采用光谱、和法相结合的光谱.色谱联用的方法分 析了杜仲炮制前后化学成分的变化,结果如下: 光谱分析:由紫外图谱组分析可见,杜仲生品和不同工艺参数炮制品的甲醇总 提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物的紫外吸收图谱均有差 别。其中高温炮制品与 生品的乙酸乙酯和正丁醇提取物的紫外图谱差别尤为显著,说明高温炮制后杜仲化学成 分的组成和比例发生了明显的变化,而且变化的化学成分主要集中在乙酸乙酯和正丁醇 部位。从宏观上分析了杜仲炮制前后化学成分的变化情况,并且确定了炮制前后化学成 分变化显著的极性部位。 分析:在光谱分析的基础上,进行了薄层色谱分析。由可见,当温度达 到?以上时,.化学成分明显减少,并且有新的物质产生。法更加直观的显示了 杜仲炮制前后化学成分的变化,确定了变化成分的色谱行为,可用于指导炮制前后变化 显著的化学成分的分离。 分析:在光谱分析和分析的基础上,采用法进行定量分析。结 果可见,杜仲在高温盐炙后多数化学成分的含量降低,并且在盐炙品的指纹图谱上同时 出现了生杜仲指纹图谱上所不具有的色谱峰,此类色谱峰可能是杜仲药材中某种成分的 降解产物或是在高温盐炙过程中产生的新物质。法更加深入地明确了杜仲炮制前 后化学成分的细微变化。 本实验首次采用光谱.色谱联用的方法,分析炮制对杜仲化学成分的影响,研究结 果显示:?炮制温度和炮制时间对杜仲的化学成分有显著影响。因此,温度和时间作 为影响杜仲盐炙品质量的重要工艺参数,在炮制过程中需要严格控制炮制温度和时间, 以保证盐杜仲的质量。?在“断丝”的前提下,有必要深入研究杜仲的化学成分,明 确炮制前后变化显著的化学成分的性质和结构,用于指导杜仲的炮制工艺参数优选和质 量控制标准研究。辽宁中医药大学届硕士学位论文 第二章杜仲炮制前后变化显著的化学成分研究 通过对炮制工艺参数的考察,发现在不同的炮制温度和时间下,杜仲的化学成分差 异显著。高温条件下,杜仲的化学成分变化明显,不仅有大量损失的成分,而且有增量 成分。然而炮制前后显著变化的化学成分的类型和结构不清楚,无法确定其是否为杜仲 的有效成分,并且这些成分的变化对杜仲的药材质量和临床疗效有何影响也无法得知。 因此本试验分别以生品杜仲和高温盐炙杜仲为原料,对炮制前后 变化显著的化学成分进 行分离、纯化和结构鉴定,为杜仲炮制工艺优化和炮制品的质量控制研究提供指标性成 分和依据。 第一节化学成分提取与分离 实验材料 .实验材料 生杜仲丝购自北京同仁堂,产地四川。 薄层层析硅胶、柱层析硅胶目青岛海洋化工厂产品。 一法玛西亚公司产品。 .主要试剂 石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇为分析纯天津科密欧化学试剂有限公司生 产,水为二次蒸馏水。 .主要仪器及设备 一型核磁共振光谱仪;.型核磁共振光谱仪德国公司。 高效液相色谱仪美国安