尿液转铁蛋白免疫比浊法测定

尿液转铁蛋白免疫比浊法测定 5’一r 北京医科大学 JOURNALOFBEIJINGMEDALUNIVERSITYVoL.28No21996-l55? y-7’ e] 质f靛,承峨,龟珐比j.稚屏拓舒勃, 尿液转铁蛋白免疫比浊法测定 . 垂.夏继徐国宾 (北京医科太学第一医院检验科1000343 尿液白蛋白定量,是糖尿病肾病诊断分期的重要 依据,目前更多的证据表明.糖尿病尿液白蛋白(ALB) 增加之前,尿渡转铁蛋白(Tf)已开始升高.但尿液转铁 蛋白困含量低,干扰因素多,常规测定比较困难车文 建立尿液转铁蛋白免疫比浊测定法,并应用于槔尿病 人尿液Tf的监测. 1材辑与方法 试剂:转铁蛋白;BoebringerCo(HPLC纯);转铁 蛋白抗体:Boebr[ngerCoTf(HPLC)免疫家免制备;抗 血清处理液:0.Olmol/LpH7.4PBS(含0.15mo/L NaCI,0.1EDTA,0.1NaN1}起动谶;兔抗人Tf抗 血清(双扩{圭测得,效价l:16)与其处理{夜等量混合,4 C72h后3000r/rain离心10min取上清f反应缓冲 {i芟fpH7.4pBS0.2mol/L(含PEG6000IOQg/L) EDTA3g/L. 仪器和方法:应用COBASFARA离心式生化分析 搜,反应模式尿样本加反应缓冲液,1Os后再加起动 渣读吸光度值AI.5min后再读吸光度值A2,计算差 值采用logit门.罾5数学模式计算.波长340nm,温度 37c,样本体积65,反应缓冲液12:0,起动液20 . l结果 波长选择:分别对尿液,PEG一抗原抗体复合物在波 长250~450nm扫描,结果尿液样本在340nm处吸收 较小,抗原抗体复合物也有中度吸收,故选择340nnl 为测定波长. 抗血清处理t分别用非处理抗血清,处理抗血清作 起动试剂,连续测5趺.结果经处理的抗血清作起动 液所得试剂空白吸光度显着减少(P<0.01). 起动剂用量:分别用5,10,20,3O,50起动剂测 定同一样本,结果随起动剂用量的增多,反应吸光度增 加,同时空白嗳光度也增加,且出现后,前滞效应 反应时间:8种不同浓度的TF,加起动剂反应后 5,10rain测定吸光值,结果表明5rain接近反应终点. 表面活性剂影响:在反应缓冲液申加 ,5的 Tween一20t测定8种不同浓度的吸光度变化,结果l反应 体系中加入Tween后反应的敏感性下降. 缓冲液各因素的水平的选择:对埂冲液各因素,水 平进行L(5)正交实验.各因素的水平分别为pH 5.8,6.2,6.8,7.4,8.0IPB$(tool,L)0.01,0.05,010, O.20,0.40}EDTA(g/Ll0.6I.218,2.43.9,PEG (g/L)30,45,75,105,135.结果表明,反应援冲液PBS 和PEG的浓度对AOD值影响较大(P<0.05),后者随 PBS降低,PEG升高而增加. 标准曲线:当Tf浓度依次为0.156,0.318,0.625, 2.500,5.000,l0,OOO,20.000,40.000mg/L时,测定 340nm的AOD值分别为0.040,O.086,o.174,0.537, I.005,0.162,0.25,5,0.392. 方法变异:批内转铁蛋白样本5.25522.880mg,/L (一20).CV一2.38%,1.6O%I批间转铁蛋白样本 5.47,13.90mg/L(:10).(一8.1%,5.0% 回收率:1m1屎液Tf8.523mg,L,加人TF40mg! lJR准液200,均值l425rhg./L(:10),回收率 107.1另一藤维样本TFI2.q8mg/LInd,加入4o mg/LTf标准液250r’均值l8.17mg/L(=10),回 收率97,32., 干扰因素.本实验:用人血清白蛋白200mg/L,凡血 清免l攫球聋白100mg/L做干扰实驻,涮定值分别为 0.58和0.48mg/L. 铁饱和度影响:配制约35mg/I脱铁转铁蛋白,分 别用1.8的NaCI,60mmo]/iFeCI倍比稀释测定 值分别为18.08mg/L,儿.44mg/L(P<0.01)结果表 明铁饱和度显着影嗬测定结果 参考范围;年龄25~65岁之间的健康人受264倒, 平均46岁,其男146倒,女118倒,两因素协方差分 析(P>D-05)t95单侧上线参考值1.s8mg/gCr 尿液标奉的存放:一份尿慷分6组存放:(1)留取 后0.5h梗I宦?(2)加入0.I蹦NaN,4?l周;(3)不加 入NaN31~4l,C1周{(4岫口 .1NaN,2OCI周f(5) 不加入0.1NaN”20C1周f(6)不加入0.1NaN, l56马.等棘涟转铁监免礁比洼}上州定 2OCl周.结果无显着性差异(P>0.05). 临床观察:7O例尿蛋白磺柳酸定性阴性的N1DDM 患者尿白蛋白阳性率22,展转锭蛋白阳性率48.5, 较白蛋白高265转铁蛋白与白蛋白正相关.0 908(,】<0.01). 3讨论 由于离子强度对OD影响较大,考虑到反应体系的 缓冲力,考虑到反应体系的缓冲力.我们选择与尿近等 渗的O.2mot/lPBS使结果更为准确选择t00g/1 PEG是为了提高反应的敏感性.而又不致粘度过大. pH影响鞍小.但pH过低样品和试剂的空白均增加.囤 此选择7.40为测定pH.使用EDTA以消除样本中大 量阳离子的干扰.否则,样本空白强烈吸收,限制了尿 液转铁蛋白的测定,因为PEG加速沉淀物形成,沉降 反应缓冲渣中加入3g/L的EDTA适Hj于各种尿样本 的{j鲥定.同时,EDTA和转铁蛋白与二价铁的平衡常数 分别为l0和l0次方,因此EDTA能将锭结台转锭蛋 白转变为脱铁的这一点对标准化十分重要困~勾两青 构相是不同的.与同一抗血清的反应性是不同的.我们 比较锭铁蛋白饱和度说明了这一点. 本实验利用生化分析仪采用正文设计法处理反应 条件.比较各囤素影响的大小.了解各困索最优水平. 有利于综合分析.改变了以往的工作方法其它方法的 条件摸索也有可鉴之处. 屎液转铁蛋白,白蛋白的排泄量增加.与基底膜L 径,基底膜阴电荷相对减少,白蛋白的糖基化相关. NIDDM肾病主要是肾小球病变,也涉及肾小管功能. 正常情况下,肾小球毛细血管基底膜内皮细胞表面及 足突含有丰富的硫酸肝素糖蛋和唾液酸糖蛋白.构成 一 道负电荷屏障由于电荷的作用,阻止了白蛋白,转 铁蛋白的外排当塘屎病肾小球罡损时,硫酸肝素糖蛋 白和唾赦酸糖蛋白合成减少.肾小球基底膜增厚-斥力 减弱.排泄量增加,再加上白蛋白糖基化,等电点进一 步降低,这可能是转铁蛋白优先增加的原因. (1995—062ll5[捣) (上接第ll0页) 于高水平.提示内膜增生与持续血浆中高 EDLF水平之间具有一定关系. EDRF现认为就是一氧化氮(NO),后者进 入靶细胞(血小板和血管平滑肌细胞)内,激活 鸟苷酸环化酶,提高靶细胞内cGM浓度而发 挥其抑制血小板的粘附和聚集,舒张血管平滑 肌的生理功能嘲.它的产生受损与冠心病,高血 压,动脉粥样硬化,心力衰竭等许多病理过程密 切有关.实验发现,EDRF有抑嗣平滑1l细胞 中DNA合成而抑制血管平滑肌细胞增殖的作 用].提示血管内皮受损,EDRF产生减少是血 管内膜增生的一个重要原因,可能参与了临床 再狭窄的发生. 在大鼠胸主动脉内皮损伤模型上发现,内 皮损伤可使大鼠胸主动脉内膜明显增生,受损 血管eGMP含量明显下降,而血浆中EDLF水 平显着提高.EDRF的前体L—Arg却可使内 皮受损血管内膜增生程度减轻,血管局部 cGMP含量显着上升,而血浆中EDLF水平明 显下降.而EDRF的抑制剂LNNA的作用恰 好相反,表现EDRF可通过升高血管中cGMP 含量而抑制大鼠体内EDIF的产生.这种抑制 作用可能在血管内皮损伤引起血管平滑肌细胞 增殖和内膜增生的过程中具有重要意义. 参考文献 I涵韶.晰朝杜.忻环系坑的内讣泌功能.第1敷_Jt京: 北京?科凡学,中国协和医科大联出版扯,1989:j259, 75r82 2Sagne[[aGA.Evidence[orincreasedlevelsofacirculating 0uabalnllke[aetorin…c?【hypertensionHyperlension, 1986;8t433 3柯永胜,孛苏老年人慢性亢血性心力衰竭患血竹叶J内 源性洋地黄闻子的临术研宽.临睐胍学杂甚.19895Z99 4DeNP.Increasedinplasmadigitalislikeactivltvduringper cut…ustranslumlna【coronaryangiop[astvinpatlemswith ?…vstenosis.LifeSei.19D0;47:385 5HendersonAH.Endotheliumincontrot.BrHeartjlD89{ 65.1 6NakakTInhibilhionbynitricoxideandnJlrk.oxideIr. ducingvasodilatorsofDNAsynthesisinvaula~nIOOth musclec【.EurjPharmaeol,1990I189:347 (本文图见插页第ll页) (1?5—06一O6收稿)