30大肠埃希菌检查法

吉林紫鑫药业股份有限公司 版号：00 文件名称 大肠埃希菌检查法检验操作规程 总页—分页 6－1 文件编号 ZX/ZA-10-104B把A 起 草 人 起草日期 原文件编号 ZX/ZA-10-104A 审 核 人 审核日期 颁发部门 中心化验室 批 准 人 批准日期 生效日期 编订依据 《中华人民共和国药典》2005年版二部附录 分发份数 各一份 分发单位 档案室、质量保证部、中心化验室 目的：完善大肠埃希菌检查法操作规程。 范围：适用于所有的进厂原辅材料、工艺用水、成品的大肠埃希菌测定。 职责：中心化验室主任、化验员。 内容： 大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外，可直接或间接污染药品及药品生产的各个环节。药品中检出大肠埃希菌表明该样品已受到人和动物粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查此项目。 1 仪器、设备及用具 1.1 仪器：无菌室、净化工作台、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、灭菌锅、离心机、电冰箱、366nm紫外灯、玻璃器皿 1.2 器具： 烧杯（1000ml）、试管（30ml、150ml）、量筒（100ml、20ml、50ml、500ml）、容量瓶（500ml）、吸液管（10ml、5ml、1ml）。 1.3 试液、指示液 1.3.1 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 1.3.2　pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 1.3.3　pH7.6无菌磷酸盐缓冲液 1.3.4　无菌对氨基苯甲酸溶液 吉林紫鑫药业股份有限公司 版号：00 文件名称 大肠埃希菌检查法检验操作规程 总页—分页 6－2 文件编号 ZX/ZA-10-104B 1.3.5　无菌山梨酸酯80氯化钠溶液 1.3.6　欧波试液 1.3.7　甲基红试液 1.3.8　V-P试液 1.3.9　革兰染色液 1.3.10　中性红指示液 1.3.11　亚甲基蓝指示液 1.3.12　溴麝香草酚蓝指示液 1.3.13　酸性品红指示液 1.3.14　曙红钠指示液 1.4 培养基： 1.3.1 胆盐乳糖培养基 1.3.2　营养肉汤 1.3.3　营养琼脂 1.3.4 麦康凯琼脂 2　对照用菌液 取大肠埃希菌的营养琼脂斜面培养基少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，36±1℃培养基18～24小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1：106，使对照菌液加入量含菌50～100个（一般用量为0.1ml），其菌落数在做阳性对照的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。 3　准备 3.1　供试品的检验量（见微生物限度检查检验操作规程6.3） 3.2　供试液的制备 吉林紫鑫药业股份有限公司 版号：00 文件名称 大肠埃希菌检查法检验操作规程 总页—分页 6－3 文件编号 ZX/ZA-10-104B 3.2.1　液体供试液的制备（见微生物限度检查检验操作规程7.2.2） 3.2.2　固体、半固体或粘稠液供试品（微生物限度检查检验操作规程7.2.1） 3.2.3　非水溶性供试品(微生物限度检查检验操作规程7.2.3) 3.2.4 含抑菌成分供试品（微生物限度检查检验操作规程7.2.4） 4　操作步骤 　　　　　　　　　　　　　　　供试品 　　　　　　　　　　　　　　 供试液 　　　　　　　　　　　　　胆盐乳糖增菌液 36±1℃ 5-24小时 　　　　　　　　　　以0.2ml至5mlMCG培养基中 　　　　　　　　　　　　　366nm紫外光下观察 加靛基质试液 　　　　MCG阳性，靛基质阳性　　　　　　　　MGC阴性，靛基质阳性 MCG阴性，靛基质阴性　　　　　　　　MCG阳性，靛基质阴性 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　取胆盐乳糖培养液划线 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　曙红亚甲蓝培养基 36±1℃ 18-24小时 　　　　　报告 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　阳性　　　　　　　　　阴性 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生化试验，镜检 报告 　报告 　吉林紫鑫药业股份有限公司 版号：00 文件名称 大肠埃希菌检查法检验操作规程 总页—分页 6－4 文件编号 ZX/ZA-10-104B 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 4.1　增菌培养 取胆盐乳糖培养基3瓶，每份100ml，2瓶分别加入规定量的供试液，其中1瓶加入对照菌50－100个作阳性对照，第3瓶加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。37℃培养18－24小时（必要可延至48小时）。阴性对照应无菌生长。 摇匀上述胆盐乳糖培养液，以灭菌吸管吸取供试品的胆盐乳糖增菌培养液、供试品阳性对照培养液、阴性对照培养液0.2 ml，分别加入MUG蛋白（培养基5.7）管，37℃培养5、24小时后，分别于5小时24小时，将各管置366mm紫外灯下观察有无蓝白色荧光，然后加欧-波试液4-5滴于上述MUG管内，观察液面颜色。MUG阳性（有荧光）靛基质阳性（玫瑰红色），报告检出大肠埃希菌。 4.2 分离培养 如MUG阳性，靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，将上述代试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取1-2环培养划线于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养18-24小时，观察EMB麦康凯琼脂平板有无可疑大肠埃希菌菌落生长。当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，可判为供试品1g或1ml未检出大肠埃希菌。 当阳性菌对照平板未生长或生长菌落检查不是大肠埃希菌，应研究原因，重新试验，以消除供试品抑菌成分的影响。有疑是菌落生长者，挑可疑菌落做革兰染色、镜检、LMVIC试验。 4.3　纯培养 如生长菌落与大肠埃希菌特征相符或疑是者，以接种针轻轻接种单个疑是菌落的表 面中心，沾取培养物，应挑选2-3个以上疑是菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养18-24小时，作以下镜检。 吉林紫鑫药业股份有限公司 版号：00 文件名称 大肠埃希菌检查法检验操作规程 总页—分页 6－5 文件编号 ZX/ZA-10-104B 如平板无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属泽）中，应沾取可疑菌团　培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于EMB琼脂平板，18-24培养小时，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。 4.4 革兰染色、镜检 4.4.1 以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2-3次（载玻片不烫手）固定。 4.4.2 滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。 4.4.3 滴加碘液，媒染1分钟，水洗，、以滤纸吸干余水。 4.4.4 滴加95%乙醇，脱色20-30s，水洗。 4.4.5 滴加少许黄染液，复染1分钟，待干后，镜检。 4.4.6 染色结果　革兰阳性菌呈蓝紫色：革兰阴性菌呈红色。大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌，或球菌状。亦有杆菌状。 4.4.7 注意事项 4.4.7.1　玻片必须洁净，涂片菌量宜少，菌不可浓。否则，菌细胞成堆或连成片。染色反应难于判断，菌细胞形态难于观察。 4.4.7.2　培养物的菌龄以16-24小时为宜。培养时间的革兰阳性菌易染成红色。 4.4.7.3　脱色是关键，脱色时间不足菌细胞易染成阳性，脱色时间过长易染成阴性， 5生化试验 5.1 乳糖发酵试验 取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管。培养24-48小时，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色，指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色）。产气（小倒管内有气泡，气泡无论大 小）为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种5%乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24小时出现阳性。或适当延长培养时间。 5.2靛基质试验 吉林紫鑫药业股份有限公司 版号：00 文件名称 大肠埃希菌检查法检验操作规程 总页—分页 6－6 文件编号 ZX/ZA-10-104B 取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养24-48小时，沿管壁加入欧-波 试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98%的大肠埃 菌靛基质试验为阳性。一般24小时即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1g或1ml培养液进行检查，靛基质是阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24小时，作靛基质试验。 6　结果判断 6.1　当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG阳性、供试品MUG阳性、靛基质阳性，报告1g或1ml供试品已检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阴性，报告1g或1ml未检出大肠埃希菌。 6.2　MUG阳性，靛基质阴性，LMViC试验为-　+　-　-、革兰阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌：MUG阴性、靛基质阳性LMViC试验为+　+　-　-、革兰阴性杆菌，报告1g或1ml供试品已检出大肠埃希菌。 6.3　供试品培养物检查不符合二项中的任一项，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。 6.4　当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠埃希菌，不能作出检验报告。 6.5　在各类供试品中检测大肠埃希菌及其他控制菌，按一次检出结果为准，不再抽样复检，检出的大肠埃希菌及其他控制菌培养物须保留1个月，备查。 7　填写原始 培训： 培训部门：中心化验室 培训对象：中心化验室主任、化验员 培训时间: 0.5小时