蛹虫草液体培养基的研究

　2009年第 2期 山 东 蚕 业 蛹虫草液体培养基的研究 顾寅钰 　　张亚平 　　施新琴 　　刘志斐 　　李化秀 (山东省蚕业研究所 ) 　　蛹虫草与冬虫夏草同属异种 ,是我国分布 最广的具有药用价值的两种虫草菌。蛹虫草 (Cordycep sm ilitarisL L ink)亦称北虫草或北冬 虫夏草 ,属于真菌门 ( Eumycota) ,子囊菌亚门 (A seomycotina)、肉座菌目 (Hypocreales)、麦角 菌科 (Clavicip itaceae)、虫草属 (Cordycep s) ,寄 生于夜蛾科等蛹体上 ,分布于世界各地 ,是一 种国内外公认的既可食用又可药用的真菌。 研究明蛹虫草与冬虫夏草具有相同的属性 , 相似的药理功能及相近的临床效果 ,可替代冬 虫夏草入药。 　　野生虫草资源有限 ,因此人们开始转而研 究蛹虫草的人工栽培。蛹虫草对于生长环境 的要求相对较低 ,人工培养相比之下较为容 易 ,除了可经液体发酵形成菌丝体外 ,还可通 过人工大规模固体培养获得子实体 ,另外通过 活体培养进行规模化蛹虫草生产也成为现实。 而且现有的多数文献认为人工培养的蛹虫草 其有效成分和含量与冬虫夏草相仿 ,有的甚至 更高。所以 ,近年来蛹虫草的研究取得了迅速 的发展。培养基的成分对蛹虫草的生长影响 较大 ,碳源、氮源、无机盐和 PH值等都是影响 蛹虫草生长的重要因素 ,因此本文对其液体培 养基进行了研究。 1　材料与方法 1. 1　材料 1. 1. 1　菌种 　菌种为来自锦州的草头 6 - 1。 1. 1. 2　药品 　葡萄糖、土豆、蛋白胨、硫酸、氢 氧化钠、磷酸二氢钾和硫酸镁。 1. 1. 3　基础培养基 　葡萄糖 (适量 )、蛋白胨 (适量 )、硫酸镁 1g、磷酸二氢钾 2g、水 l 000 mL,制备方法同常规。 1. 1. 4　设备和仪器 　恒温培养箱、高压灭菌 锅、超净工作台、电子称、光电显微镜、高温干 燥箱、血球计数板、滤纸等。 1. 2　方法 1. 2. 1　接种与培养 　每个三角瓶内培养基为 100m l,接种时按无菌操作要求 ,向各三角瓶中 央接入菌悬液 0. 1m l,孢子液的浓度用血球计 数板测定。每个设区有三个重复 ,接种后置于 22℃恒温箱遮光培养 , 7d后调查。 1. 2. 2　测定方法 　采用菌丝重量法。用滤纸 过滤 ,置入高温干燥箱中 80℃烘至恒重 ,采用 电子称称取菌丝干重。 1. 2. 3　试验方法 1. 2. 3. 1　碳源实验 　在基础培养基中 ,葡萄 糖浓度依次为 0% , 0. 5% , 1% , 1. 5% , 2% , 2. 5% , 3% , 3. 5% , 4% , 4. 5% , 5% ,测其菌 5 山 东 蚕 业 2009年第 2期 丝体干重来确定碳源的最佳浓度。 1. 2. 3. 2　氮源实验 　在基础培养基中 ,蛋白 胨浓度依次为 0% , 0. 5% , 1% , 1. 5% , 2% , 2. 5% , 3% , 3. 5% , 4% , 4. 5% , 5% ,测其菌 丝体干重来确定碳源的最佳浓度。 1. 2. 3. 3　正交实验 　碳源与氮源的含量各设 为 1% , 2% , 3%进行正交试验 ,其余按常规配 方 ,测其菌丝干重。 1. 2. 3. 4　无机盐含量实验 　无机盐含量试验 测定了磷酸二氢钾和硫酸镁 ,含量分为 0% , 011% , 012% , 013%和 0% , 0105% , 0115% , 012% ,其余为常规配方 ,测其菌丝干重。 1. 2. 3. 5　PH值实验 　按常规培养基配方 ,用 硫酸和氢氧化钠调 PH 值 ,设区为 4, 4. 5, 5, 515, 518, 6, 6. 5, 7,测定菌丝干重。 2　结果与分析 2. 1　碳源含量试验 　　在对液体培养基的碳源含量进行的研究 中 ,采用的是葡萄糖 , 接种用孢子浓度为 950000个 /m l,试验结果见图 1,从图中可以看 出培养基的葡萄糖含量从 0% ～5%之间 ,菌 丝生长量是呈递进关系的 ,也就是说在此范围 内 ,菌丝生长量是随着含糖量的增加而增加 的。 2. 2　氮源含量试验 　　在对液体培养基的氮源含量进行的研究 中 ,采用的是蛋白胨 , 接种用孢子浓度为 675000个 /m l,试验结果见图 2,从图中可以看 出培养基的蛋白胨含量从 0% ～5%之间 ,菌 丝生长量也是呈递进关系的 ,也就是说在此范 围内 ,菌丝生长量是随着含氮量的增加而增加 的。 2. 3　正交试验 　　从碳源与氮源的正交试验结果 (表 1)可 以看出氮源浓度的变化对菌丝干重的影响较 大 ,相对氮源来说 ,碳源影响较小 ,且二者的菌 丝干重均随浓度的增加而增加。本试验只做 到 3% ,所以以碳、氮浓度各 3%的设区为最 高。 表 1　碳源浓度与氮源浓度正交试验结果 试验序号 碳源浓度 ( % ) 氮源浓度 ( % ) 菌丝干重 ( g) 1 1 1 0. 308 2 1 2 0. 528 3 1 3 0. 668 4 2 1 0. 370 5 2 2 0. 672 6 2 3 0. 734 7 3 1 0. 364 8 3 2 0. 755 9 3 3 1. 101 均值 1 0. 501 0. 348 均值 2 0. 592 0. 652 均值 3 0. 740 0. 834 极差 0. 239 0. 487 6 　2009年第 2期 山 东 蚕 业 2. 4　无机盐试验 　　无机盐试验主要做了磷酸二氢钾和硫酸 镁 ,结果见图 3和图 4,从图中可以看出添加磷 酸二氢钾后菌丝生长量明显高于未添加区 ,以 含量 0. 3%为最高 ,但 0. 1%和 0. 3%之间差距 不是很明显。而添加硫酸镁后菌丝生长量也 高于对照 ,但是以添加量 0. 2%时明显高于其 它设区。 2. 5　PH值试验 　　PH值试验结果见图 5,从图中可以看出 PH为 6时菌丝生长量最高 ,而从 4. 5至 7之 间对菌丝生长量的影响不是很明显。 3　小结与讨论 3. 1　在 0% ～5%的范围内菌丝生长量随葡萄 糖的含量增加而增加 ,但是常规上多采用 2% 的比例 ,张以俭、尹萍、朱姣等都认为 2%最 好 ,王飞等认为 3%为佳 ,这可能与采用的菌 种、接种方法、培养条件等有关 ,另外 ,有的人 是根据接种于活体寄主后的表现判断的 ,这也 可能是导致结果不同的一个原因。还有一个 原因可能是糖类在高压灭菌的情况下均发生 某种程度的改变 ,导致含高糖分的培养基颜色 不同程度的加深 ,时间越长 ,糖分越高的培养 基颜色越深 ;同时糖在高温时易形成焦糖 ,也 影响微生物的培养效果。 3. 2　在 0% ～5%的范围内菌丝生长量随蛋白 胨的含量增加而增加 ,即在葡萄糖的含量一定 的前提下 ,蛋白胨的含量越高则菌丝干重越 高 ,反之则越低。正交试验结果也证明了以上 结论。这也与其他人的实验结果和常规采用 的浓度不同 ,张以俭和王飞等都认为 3%较 好 ,而朱姣则认为 2. 5%最好 ,一般人都采用 3%左右的氮源含量。这也可能是实验方法和 目的不同所致。 3. 3　本试验所设浓度是参考其它文献和教材 确定的 ,所以最高只设到 5% , (下转第 10页 ) 7 山 东 蚕 业 2009年第 2期 RSD为 0. 024 7%。此结果表明 ,本方法的重 现性良好。 2. 6　加样回收率试验 　　取测定过虫草素和虫草腺苷含量的北虫 草 5份 ,精密称量后分别加入 2种标准品 ,按 1. 2方法操作 ,进行 HPLC分析 ,测定虫草素和 虫草腺苷的含量 ,计算加样回收率。研究发现 平均加样回收率为 100. 7%和 99. 01% , RSD 为 0. 375%和 0. 501%。此结果表明 ,本测定 方法符合加样回收率的要求。 3　讨 　论 　　用该方法测定样品中虫草素和虫草腺苷 的含量 ,目标色谱峰分离效果好 ,结果稳定可 靠 ,是测定各种虫草样品中虫草素和虫草腺苷 含量的有效方法。该方法具有流动相低毒、少 有机溶剂、高分离度等优点 ,且目标峰保留时 间适中 ,减少了分析样品的分析时间 ,提高分 析效率、分析质量 ,同时改进的提取方法可以 快速、有效的提取虫草素和虫草腺苷 ,因此本 测定方法具有良好的实用性。 　　为提高测定的准确性和可靠性 ,本方法在 实际应用过程中需要注意以下问 :首先 ,对 虫草素和虫草腺苷的提取 ,采用双蒸水微波处 理 1m in,提取率达到 99%以上 ,该方法方便、 快捷 ,微波处理时应注意不要沸腾漾出 ,以免 影响测定结果。其次 ,虫草素和虫草腺苷的水 提液 ,在室温下能稳定存在 6h,超过 12h后 ,虫 草素和虫草腺苷发生变化 ,产生新的物质 ,干 扰目标峰 ,所以 ,应及时测定虫草提取液的虫 草素和虫草腺苷。最后 ,色谱柱的更换、柱温 和流动相的比例等对样品的分离效果、保留时 间和峰面积均有影响 ,以上条件改变之后 ,需 要重新制作标准曲线。 (上接第 7页 ) 结果碳源、氮源均未出现最高峰 ,所以想获得 最高值只能再提高浓度 ,鉴于生产上多采用 2% ～3%的浓度 ,可能是综合考虑的结果 ,因 此在选择碳氮源的含量时应根据自己的需要 综合考虑选择所需浓度。 3. 4　磷酸二氢钾的浓度以 0. 3% 较好 ,硫酸 镁以 0. 2%的菌丝生长量为最高 , PH 值则是 等于 6的情况下菌丝生长最好。 (上接第 32页 ) 大棚升温 ,同时达到排湿目的。 6　注意事项 6. 1　提高健蚕率是防止蚕病发生的根本。同 时发动蚕农搞好选茧 ,也是防止僵菌孢子在茧 内、好蛹内蔓延的一种措施。 6. 2　户内管理要加强 ,不能做表面文章 ,保证 踏步池使用率及换鞋率 100%。另外户内小环 境的每日消毒要跟上 ,保证清洁卫生。 6. 3　对于没有备足草木灰的地区 ,要大力推 广用漂白粉液喷体的方法。 6. 4　桑叶添食 ,尤其是在阴雨天气下添食氯 霉素 ,预防细菌病的发生 ,保证蚕体健壮。 6. 5　保持种叶平衡 ,合理用桑 ,尽量不要外出 买桑 ,买回的桑叶也要及时消毒。 6. 6　当地农民蔬菜及果园所用农药 ,禁止使 用僵菌制剂的药类。 01