《通脉口服液》配伍规律及作用机制的研究

项目类别 申报学科代码1 科学部编号 A C030503 国家自然科学基金 申 请 书 项目名称： 《xx口服液》配伍规律及作用机制的研究 申 请 者： 所在单位： 中医药大学 邮政编码： 通讯地址： 电 话： （ 传 真： （ 申请日期： 2002年3月10日 国 家 自 然 科 学 基 金 委 员 会 一九九七年制 填 报 说 明 一、填写申请书前，请先查阅国家自然科学基金有关项目申请办法及规定。申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明确、严谨，字迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现的缩写词，须注出全称。 二、申请书为十六开本，复印时用B5复印纸，于左侧装订成册。第三页起各栏空格不够时，请自行加页。一式六份（至少一份为原件），由所在单位审查签署意见后，按申报学科投送国家自然科学基金委员会对口科学部。地区科学基金项目，申请书另报送省（自治区）科委一份原件。 三、封面右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别和申报学科代码1由申请者填写。 四、下列人员不得作为申请项目的负责人提出申请，但可作为项目组成员参加研究： —在读（含在职）研究生 —已离退休的科研人员 —申请单位的兼职科研人员 五、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请（含参加）的项目数，连同在研的国家自然科学基金项目数（不含重点项目、重大项目），不得超过两项。 六、同一项目组研究内容相近的项目，只允许报送一个学科。 七、申请者可因同类项目竞争等原因，提出不宜评议本项目的专家名单（姓名与单位，3人以内），密封于信封中，钉在申请书原件封面，或另专函相关学科，供科学部选择同行评议人时参考。科学部将对此信息保密。 八、国家自然科学基金委员会通讯地址：北京市海淀区花园北路35号东门 邮政编码：100083 一、简表 研 究 项 目 名 称 中文 《 服 液 》 配 伍 规 律 及 作 用 机 制 的 研 究 英文 Study on the combining regulation and effecting mechanism of TONGMAI oral liquid 类别 A.自由申请 B.高技术探索 C.青年 D.地区 高技术探索 项目主题号 E.重大 F.重点 H.专项 A 申报学科 名称1 中医临床基础 名称2 中药药理学 A. 基础研究 B. 应用基础 代码1 C030503 代码2 C03050205 B 申请金额 2 0 . 0 0 万元 起止年月 2003 年 1 月至2005 年12 月 所用实验室 A. 国家重点 B. 部门开放 实验室编号 B 申 请 者 姓 名 中文 杨霓芝 性 别 A. 男 出生年月 48年10月 民 族 名称 汉 拼音 YANG NI ZHI B. 女 B 身份证号 440102481025402 代码 01 专业技术职务 名称 教授 学位 A. 博士 B. 硕士 C. 学士 C 博士学位授予国别或 地 区 国(地区)名 中国 A. 院士 B. 博士生导师 C. 博士后 代码 011 代 码 156 B 所在单位 名 称 广州中医药大学 系（所） 临床医学院 单位代码 51040701 性 质 A. 高等院校 B. 科研机构 C. 其它 邮政编码 510405 隶属 关系 名称 广东省教育厅 A 申请者电话 (020)86591233-2267 代码 944 所在地 广东省 (自治区、直辖市) 广州 市(县) 白云 区 机场 街(路) 12 号 项 目 组 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 参加单位数 8 5 3 1 1 姓 名 身份证号 专业技术 职 务 所在单位名称及代码 项目中 的分工 签字 药效学 主要成员(不含申请者) 药效学 机制研究 植化、分析 细胞培养 统计分析 生化检查 －1－ 研 究 内 容 和 意 义 摘 要 在 既 往 对 《 通 脉 口 服 液 》 临 床 和 实 验 有 效 的 基 础 上 , 进 一 步 系 统 研 究 其 配 伍 规 律 , 阐 明 该 制 剂 治 疗 慢 性 肾 炎 的 有 效 物 质 基 础 及 其 形 成 规 律 ; 并 从 细 胞 因 子 ( 致 炎 细 胞 因 子 IL -1 β 、 抗 炎 细 胞 因 子 IL - 1 0 ) 的 角 度 探 讨 其 作 用 机 理 ， 为 开 发 出 具 有 自 主 知 识 产 权 的 治 疗 慢 性 肾 炎 、 防 治 肾 小 球 硬 化 的 中 药 新 药 提 供 坚 实 的 理 论 基 础 和 科 学 依 据 。 主题词 中文 中 药 复 方 慢 性 肾 炎 组 方 机 理 英文 Compound prescription of Chinese herbs; Chronic nephritis; Mechanism of composing and effects 简 表 填 写 要 求 一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最新发布的《国家自然科学基金申请项目分类目录及代码》为准填写。高技术探索课题主题号按《高技术新概念新构思探索课题项目指南》中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。 二、凡选择性栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。 三、部分栏目填写要求： 项目名称——应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字 (包括标点符号）。 基础研究——指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。 应用基础研究——指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。 申报学科——申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。 申请金额——以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。 起止年月——起始时间从申请的次年1月算起。终止时间为完成年度的 12月。 所用实验室——系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的开放实验室。 所在单位名称及代码——按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填“中科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字，一律写中文，例如：中国航天工业总公司第七○一所。首次申请国家自然科学基金的单位，尚未编入单位代码，其代码暂不填写。 参加单位数——指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位(合作者所在单位)，以阿拉伯数字表示。 项目组主要成员——指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作用的人员，本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。 研究内容和意义——摘要与主题词均录入软盘。 －2－ 二、立论依据 （包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处） 对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景。 慢性肾炎是一种常见病，其病程长，迁延不愈，是目前我国引起慢性肾功能衰竭的主要原因[1]。现代医学多采用降压、抗凝、利尿等对症治疗及激素和细胞毒药物的应用，尚缺少针对发病机理进行治疗的药物，与之相比，祖国医学在治疗慢性肾炎方面有着长足的优势。目前对慢性肾炎的中医药治疗主要可分为二大类,即辨病施治和辨证施治：辨病施治主要是针对慢性肾炎的临床表现如蛋白尿、血尿的治疗。对蛋白尿的治疗，多采用健脾固肾、活血化瘀、清热解毒等法[2]；针对血尿的治疗则主要以清热凉血法、健脾固肾法、活血化瘀法为主[3-4]。辨证施治方面目前尚没有统一的分型标准,各家仍各执一说：如余绮明以脏腑结合阴阳辨证为主，将慢性肾炎分为脾肾阳虚、肾阴虚火旺、肾虚湿毒三型，分别用参苓白术散合真武汤、知柏地黄丸、济生肾气丸合温胆汤加减治疗[5]；郭连川将慢性肾炎分为湿热内蕴、湿热犯中、水热内停、瘀血内阻四个证型论治[6]等。但综观目前的文献报道，或是集中在某方治疗某病上，未能充分体现中医辨证施治原则；或是组方过于繁杂,不利于有效成分的分析提取；另外辨证分型标准不统一，也不利于临床疗效的判定。这样都不可避免地会影响治疗效果和药物的进一步开发。 我们在长期的临床研究中发现，慢性肾炎发展过程中，气虚血瘀型占很大比例，约占56.3%[7]。其由气虚而发病，因血瘀而致疾病迁延难愈；与现代医学之慢性肾炎主要由免疫失调而发病，因凝血障碍而致疾病发展恶化的病机极其相似[8]。因此，我们根据多年的临床经验，摸索出有效验方，制成通脉口服液。方中黄芪为益气要药，有补气升阳、益卫固表、利水消肿之功，药材中主要含皂甙[9-12]、异黄酮[14-15]、多糖[16]等水溶性成分，黄芪水提液及其中的黄芪多糖、黄芪皂甙对多种动物免疫系统、体液免疫及细胞免疫均有显著的调节作用[17-22]，而且能显著降低大鼠血小板粘附率[23]及减少肾小球疾病尿蛋白的排出量[24]。三七和营止血、通脉行瘀，药材主要含皂甙、黄酮、多糖[25]等水溶性成分，其中三七总皂甙及总黄酮均有扩张冠状动脉[26]、抗心肌缺血[27]作用，总皂甙还有显著的抗炎[28]、免疫增强[29]及延缓肾小球硬化发生作用[30]。经过1997.8~2000.8广东省科委重点攻关项目《通脉口服液防治慢性肾炎气虚血瘀证的临床与实验研究》三年多严格的临床与实验研究，充分证明该药是治疗慢性肾炎气虚血瘀证患者的有效药物，且未发现明显毒副作用[31-34]。经省级鉴定，成果水平达国内领先。因此本项目拟进一步对其配伍规律及更深入的作用机制进行研究： Ⅰ. 配伍规律的研究：中药复方配伍规律的研究，是一个复杂的系统工程。临床疗效是中药复方研究的依据，复方的主要功效和配伍理论是中药复方研究的前提。 从物质基础角度探讨方剂的组成原理和配伍规律，已逐渐在学术界引起重视，并进行 了有益的尝试。如用薄层扫描法对四逆汤的三种乌头碱类成分的测定表明，甘草及干姜均能显著降低附子的毒性成分，四逆汤的不同配伍对化学及药效均产生影响[35]。生脉散配伍化学研究中发现产生了新物质，经UV，IR，MS及NMR谱鉴定为5-羟甲基-2-糠醛，研究表明，复方独特疗效有其独特的物质基础，与单味药及其简单加和在化学成分上有本质区别[36]。对不同配伍的白头翁汤中黄连素和秦皮素的测定表明，复方中被检物质的含量不符合各单味药成分含量的加和[37]。 运用现代分离方法提取有效部分，通过指纹图谱定性、指标成分定量等方法，可使含有几百种化合物的中药复方分成十多类，每类含可定量的几十种化合物。同时，将单味药中一种或几种有效成分作为定性定量指标，对复方中药采取提取分离分析技术，与选定的有效成分指标进行比较，从而说明复方的配伍。在复方药理研究及分析复方中各药味已知化学成分药理作用的基础上，进行药效和作用机理研究，这些研究可在整体、离体、细胞、分子生物学等水平上进行，从而确定君臣佐使药的有效部位、有效成分，阐明复方药物配伍规律。这样一来，不仅可以确定各有效部分的药效作用，而且可发现有无更有效的新的化学物质出现。 由于中药复方用药本身的复杂性，以上研究所取得的成果还很有限，仍未能在更深层次阐明方剂组成原理，未能更深入揭示方剂中各组成药物在方中的作用、地位及相互关系，也难以有效地指导临床制方和中药新产品的研创。其中既有技术手段方面的不足，也有思路与方法上的缺陷，突出表现在：1、对方剂产生疗效的物质基础研究明显滞后：对多数方剂而言，在为数众多化学成分中，究竟那些是有效成分，哪些是无效成分，哪些是起主要作用的成分等尚未可知；2、方剂物质基础的运动、变化关系研究相对薄弱：方剂君臣佐使配伍以后，在制剂过程及体内过程中，各药的化学成分（特别是效应成分）在数、量、分布及作用趋向发生了怎样的变化多未能充分说明；3、方剂组成原理研究综合性不够：没能从药效、作用机理及药效物质基础的运动变化等多方面、多层次采用多学科手段进行综合研究，来揭示君臣佐使的科学内涵；4、“证”的客观化研究有待加强：既往多为对较为单一的药效学指标进行方剂君臣佐使药物地位与作用分析，与“证”的结合不多，主要是缺乏客观、、符合中医药理论的“证”的动物模型，难以反映配伍效应与主治“证”之间的内在联系，与临床实际有较大差距。因此本课题拟通过能从宏观上反映中药物质群的指纹图谱法与显示中药微观作用的肾小球系膜细胞筛选法二者的结合，建立有效物质群评价法，系统研究黄芪与三七组方配伍前后有效物质群的变化规律，科学地阐明通脉口服液配伍规律及有效物质基础。 对通脉口服液配伍规律进行系统研究（目前针对黄芪与三七的配伍研究尚未见报道），阐明该制剂治疗慢性肾炎的有效物质基础及形成规律，对于该中药制剂的进一步开发有着重要意义。首先，有利于科学地制定该制剂质量标准，并显著提高该制剂研究的水平，从而开发出易与国际接轨的高档次的中药复方药物；其次，该组方有效物质基础的阐明， 也将为治疗慢性肾炎的中药新药的开发奠定坚实的基础。因此，开展本项目研究，有利于一系列具有自主知识产权的中药新药的开发，对于其他中药新药研究和开发也有重要的指导意义。同时，开展本项目研究，可揭示黄芪与三七配伍后各类成分结合衍化的重要途径，将为祖国医药学方药配伍规律的科学阐述提供可靠的理论依据。 Ⅱ.作用机制的研究：目前对中药治疗慢性肾炎作用机制的研究多数还局限于肾脏的功能与形态、肾血流动力学等方面的研究，而细胞生物学与分子生物学水平研究较少，已有研究证实黄芪与三七对细胞因子网络有影响，如黄芪可以降低慢性肾炎患者血中sIL-2R和IL-6水平[38],可以使慢肾衰患者外周血中升高的IGF1、TGF-β1、TNFα和IL-6下调[39]，三七总皂甙可以降低背部滑膜炎模型大鼠血中TNF水平[40]及有机磷农药中毒患者血清IL-6 、IL-8等水平[41]。但两药相互配伍后对细胞因子网络的影响目前还没有研究报道。细胞因子具有多种生物学效应，目前已证实，几乎所有肾脏固有细胞，均具有产生细胞因子的能力，同时又是细胞因子生物学作用的靶细胞。肾脏疾病时细胞因子至少通过两种途径参与病变过程：一是作为“攻击性”炎症介质，启动或促进肾组织的炎症和损伤，如IL-1β、TNF-α等；二是作为抗炎症因子，参与肾脏的自身防御，促进炎症消散和组织修复，如IL-4、IL-10等。肾小球疾病进展的最终结果取决于促增殖与抑制性因子相互作用的综合结果[42]。肾小球系膜细胞是肾小球内最活跃的固有细胞，已有报道系膜细胞可以自分泌IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症反应细胞因子并可表达这些细胞因子的受体，而这些细胞因子可趋化单核细胞、淋巴细胞并促使它们释放炎性介质进一步激活系膜细胞，使局部炎症不断扩大并形成恶性循环，加速肾小球硬化[43]。因此本研究拟通过观察慢性肾炎时系膜细胞对细胞因子（IL-1β及IL-10）的表达及通脉口服液对其表达的影响，从促炎症因子及抗炎症因子两方面入手，研究中药通脉口服液的作用机制。为以益气活血为主的通脉口服液治疗慢性肾炎提供坚实的理论基础和更充分的科学依据。 参考文献 1. 王海燕主编.肾脏病学(第二版).北京:人民卫生出版社.1996:1385 2. 洪钦国.慢性肾炎的中医治疗.广州医药,1998,(3):4-5 3. 王伯岳,王育仁.中医儿科学.北京:人民卫生出版社,1984.473-474 4. 许方荣.中医治疗急慢性肾小球肾炎血尿29例临床观察.江西中医药,1998,29(1):22 5. 余绮明.通补兼施治疗慢性肾炎28例临床观察.湖北中医杂志,1995,17(4):22 6. 郭连川.分型辨治慢性肾炎36例.辽宁中医杂志,2000,27(2)89 7. 包崑,杨霓芝.慢性肾小球肾炎气虚证及其兼夹标证分析.江苏中医,2000,5:10~11 8. 沈庆法主编.中医临床肾脏病学.第1版.上海:上海科学技术文献出版社,1997.64 9. 杨立,等.川产膜荚黄芪化学成分的研究.华西药学杂志,1990，5（4）：211 10. 王伟,陈伟, 陈虎彪,等. 红花岩黄芪化学成分研究. 北京大学学报· 医学版 ，2001， 33(3): 205-208 11. 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　 通脉口服液中的有效物质群是通过影响肾脏的细胞因子网络，抑制促炎症细胞因子的表达及/或促进抗炎症细胞因子的表达而起到治疗慢性肾炎、防治肾小球硬化的作用。 　 ⑵.研究目标：通过系统研究，阐明通脉口服液的配伍规律及治疗慢性肾炎的有效物质基础。 并从细胞生物学和分子生物学水平探讨通脉口服液治疗慢性肾炎、防治肾小球硬化的作用机制。为通脉口服液治疗慢性肾炎提供坚实的理论基础和更充分的科学依据。 (3) .研究内容 ①.黄芪、三七单味药材的质控研究。 ②.配伍前黄芪、三七单味药材的成分类别、含量及指纹图谱研究。 ③.不同比例(黄芪与三七剂量比分别为4:1、3:1、2:1)配伍后组方的成分类别、含量及指纹图谱研究。 ④.配伍后各组方主要部位及其匹配的药效学筛选研究。 ⑤.配伍后组方有效物质群的药效学评价。 ⑥.配伍后组方有效物质群对肾小球系膜细胞(MsC)的增殖及促炎症细胞因子IL-1β和抗炎症细胞因子IL-10蛋白及基因表达的影响。 ⑷.拟解决的关键问题 ①.阐明配伍前后组方各类化学成分的变化规律。 ②.阐明配伍后组方治疗慢性肾炎的有效物质群及其作用机理。 2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 研究方法及实验方案 配伍规律及药效学研究部分: ⑴.单味药材的质控研究：对黄芪供试药材(黑龙江产)以HPLC法测定其黄芪甲甙含量，以硫酸-苯酚法测定其多糖含量，；对三七供试药材(云南产)以HPLC法测定三七皂甙R1含量，以分光光度法测定总皂甙含量；并制定两供试药材上述成分及部位的限量标准，确保所用各批药材的质量均衡可控。 ⑵.配伍前各药材成分类别、含量及指纹图谱研究：在参考前人资料的基础上分别以TLC法配合颜色反应等对两药材水提液不同萃取部分的成分类别进行研究，再以分光光度法等测定总皂甙、总黄酮、及多糖等主要化学部位的含量；并分别以HPLC法或HPCE法制定各药材不同萃取部分或部位指纹图谱，配合HPLC-MS法等对所含主要成分定性，并确定相对含量。 ⑶不同比例配伍后组方成分类别、含量及指纹图谱研究：以TLC法配合颜色反应等对组方水提液不同萃取部分的成分类别进行研究，再以分光光度法等测定主要化学部位的含量；并分别以HPLC法或HPCE法制定其各萃取部分或主要部位的指纹图谱，配合HPLC-MS法等对所含主要成分定性，并确定相对含量。 ⑷不同比例配伍后组方及各萃取部分、主要部位及其匹配的药效学筛选研究： ①肾小球系膜细胞培养方法的建立：取水囊引产胎儿之肾脏，在无菌条件下分离提取肾皮质肾小球组织块，照《当代肾脏病学》（林善锬）法进行肾小球MsC培养和鉴定。 ②组方各萃取部分、主要部位匹配：照正交设计法，对组方各萃取部分进行匹配，并对总皂甙、总黄酮、多糖等主要部位进行匹配。 ③组方及各萃取部分、主要部位及其匹配抗慢性肾炎作用的筛选研究 ：以金水宝为阳性对照,通过组方水提液及各萃取部分、主要部位及其匹配对体外培养的MsC增殖影响的研究，确定配伍后最隹组方及各组方的最佳匹配。 (5)各组方配伍前后及不同匹配有效物质群指纹图谱对比研究：应用HPLC-MS法对配伍前后各萃取部分、主要部位及其匹配进行指纹图谱研究，确定并比较其主要成分种类及相对含量，结合药效学筛选，确定组方有效物质群及其配伍前后的变化规律。 （6）配伍后组方有效物质群的药效学评价: ①.大鼠慢性肾炎模型的制备：采用抗Thy-1抗体制备大鼠系膜增生性肾炎（MsPGN）模型，参照文献[1]方法，将A、B、C、D组大鼠由尾静脉注射ATS 1ml/100g·bw（体重），每周1次，连续4周。 ②.大鼠“气虚血瘀证”模型的建立：参照文献[2]方法，在实验第2周时，予A、B、C、D组大鼠行游泳疲劳试验，连续两周。 ③.动物处理：全部大鼠于造模第2周末及四周末用代谢笼收集24小时尿液，并于第四周末行眼球摘除采血，后处死取肾组织。 ④.观察指标：尿蛋白定量：尿纤维蛋白降解产物（FDP）测定；血尿素氮、血肌酐测定；血液流变学测定；T淋巴细胞亚群测定及肾组织学检查。 免疫荧光学检查： 光学显微镜观察： 电子显微镜观察。 机理研究部分: ⑴.人肾小球系膜细胞的培养和鉴定：(方法同前) ⑵.实验血清制备： ①肾炎模型血清制备：（造模方法同前）。 ②含药血清制备 ⑶.细胞增殖测定：采用MTT比色法 ⑷.ELISA法测定IL-1β和IL-10蛋白水平 ⑸.系膜细胞IL-1βmRNA和IL-10mRNA表达检测 1 细胞总RNA提取 ②cDNA第一链合成 ③PCR反应，PCR产物分析 参考文献： 1．陈广平，郭慕依，张月娥，等.大鼠Thy-1抗血清制备及系膜增生性肾炎模型的建立.临床与实验病理学杂志，1996，3：241~243 2．李仪奎主编. 中药药理实验方法学.上海：上海科学技术出版社，1991.146. 技术路线： 标准化的黄芪、三七药材 建立肾小球系膜细胞培养方法 确定不同配伍比例 提取分离 各组方及单味药各物质群 各组方物质群药效筛选 HPLC-MS 确定各组方物质群组成 及其配伍前后的变化规律 确定组方有效物质群 有效物质群作用机制研究 阐明组方有效物质群 及配伍前后的变化规律 阐明组方作用机制 阐明通脉口服液配伍规律及作用机制 可行性分析 ⑴.通脉口服液组方简单、药源丰富、制剂稳定，为本项目的顺利开展提供了保障。 ⑵.通脉口服液有良好的前期工作基础，现已证实黄芪、三七配伍后组成的通脉口服液对慢性肾炎有确切的疗效，显著优于配伍前的单味药；对配伍前后水提液酯萃取等部分的预试验显示，其指纹图谱已产生显著变化，为本项目提供了初步的科学依据。 ⑶.申请人及项目组主要成员长期从事通脉口服液相关研究，已完成广东省科技厅相关项目研究，并通过省级鉴定。已建立开展本申报项目所需的肾小球系膜细胞培养技术和指纹图谱技术，所需仪器基本齐备，有能力如期完成本申报项目的研究工作。 ⑷.本项目组成员均为本校人员及研究生组成，科研经验丰富，主要成员经长期合作，配合默契,能确保本项目顺利进行。 3. 项目特色与创新之处 ⑴.首次将在“宏观上反映中药物质群的指纹图谱法”与“显示中药微观作用的肾小球系膜细胞筛选法”相结合，建立有效物质群评价法，系统研究黄芪与三七组方配伍前后有效物质群的变化规律，科学地阐明通脉口服液配伍规律及有效物质基础。 ⑵.首次从促炎性细胞因子及抑炎性细胞因子两方面探讨中药对慢性肾炎的作用机制。 4. 年度研究计划及预测进展 全部工作将在三年内完成： ⑴.2003.1~2003.3 试验前期准备工作 ⑵.2003.3~2004.3 组方配伍前后物质群的变化规律研究 ⑶.2004.1-2004.12 药效学及配伍规律研究 ⑷.2005.1~2005.10 组方作用机理研究 ⑸.2005.10~2005.12 项目总结及结题报告的撰写：对所研项目完成情况及取得的进展进行和技术总结，整理研究资料并写出结题报告。 5. 预期研究成果 (1).首次科学地阐明通脉口服液治疗慢性肾炎的有效物质基础，为该制剂的深入开发奠定坚实的基础，在此基础上将开发出多层次的具有自主知识产权的中药新药，从而产生巨大的社会效益和经济效益。 (2).建立能科学地阐明中药复方配伍规律的有效物质群评价法。 (3). 阐明通过影响肾脏的细胞因子网络，抑制致炎细胞因子的表达及/或促进抗炎细胞因子的表达是通脉口服液治疗慢性肾炎的机制。 (4).在国家或国外核心期刊发表5~8篇研究论文。 (5).培养博士后及博士研究生各一名。 三、研究基础 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩 ⑴.经过1997.8~2000.8广东省科委重点攻关项目《通脉口服液防治慢性肾炎气虚血瘀证的临床与实验研究》三年多严格的临床与实验研究，充分证明通脉口服液是治疗慢性肾炎气虚血瘀型患者的有效药物，疗效确切，临床总有效率达93.75%，优于对照组（P<0.01）；动物实验提示该药可显著减轻肾脏病理损害，突出表现在减轻了系膜区IgG的沉积，抑制了系膜细胞与系膜基质的增生，达到防治肾小球硬化的目的；且未发现明显毒副作用。课题按期结题，经鉴定，成果水平达国内领先。2000年“通脉口服液及其配制研究”已申报中国发明专利，专利申请号01129938.X。 ⑵.已在国家核心刊物上发表通脉口服液相关论文多篇 ⑶.通过多年的持续研究，已建立了与本项目相关的植化、药理学、化学分析（含指纹图谱）、细胞培养等研究技术及方法,所需仪器设备基本齐备。 （4）主要研究人员曾承担广东产化橘红指纹图谱的研究课题,其相关技术可应用于本项目研究。 （5）经过初步的临床研究、药效学研究、急性毒性试验、药物工艺、剂型及质量标准的研究，通脉口服液现已被制成院内制剂，临床上应用于防治慢性肾炎及其他各种肾病，收到了满意的疗效,创造了良好的经济效益和社会效益 附已发表的与该课题有关的论文: 1.包崑,杨霓芝.慢性肾小球肾炎气虚证及其兼夹标证分析.江苏中医,2000,5:10~11 2.杨霓芝,包崑,王立新,等. 通脉口服液对慢性肾炎气虚血瘀证大鼠模型的药效学研究.广州中医药大学学报,2000,17(4):332-336 　⒊杨霓芝,包崑,王立新,等. 通脉口服液对大鼠慢性肾炎“气虚血瘀证”模型的组织形态学影响.中国中医药信息杂志,2001,15(3):31-33 ⒋王立新,杨霓芝,包崑,等.通脉口服液对系膜增生性肾炎大鼠血液流变学的影响.中医药研究,2001,17(1):42-43 5.王立新,杨霓芝,包崑,等. 通脉口服液对慢性肾炎气虚血瘀证免疫功能的影响,中医药研究,2000,16(5):16-18 1. 已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况） 已落实设于本校的国家中药现代化技术工程研究中心的质量标准及药理室、中心实验室等实验室，可供本项目优先使用。有关预试验已在本校植化室、仪器分析室、中心实验室进行。 经长期的相关研究积累，目前项目所需仪器设备基本齐备。 需购置实验相关的动物、试剂等 3. 申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著目录*和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务；青年科学基金申请者还应注明学位论文名称及导师姓名与工作单位 杨霓芝，女，52岁，教授、博士生导师。毕业于广州中医药大学，在广州中医药大学二附院从事临床、教学与科研工作20多年，先后承担、参与多项科研课题如： 广东省科委课题《通脉口服液治疗慢性肾炎的临床和实验研究》（课题负责人），广东省科委、广东省中医药管理局课题《中药综合疗法延缓慢性肾功能不全的临床与实验研究》（课题负责人），广东省科委课题《尿毒康延缓慢性肾功能衰竭进展的临床与实验研究》已结题并获奖（课题负责人之一），国家中医药管理局课题《加味阳和汤治疗难治性肾综的临床与实验研究》已结题并获奖（主要研究人员），国家中医药管理局课题《皮肤透析治疗慢性肾功能衰竭的临床研究》（主要研究人员）。主编、参编《心肾疾病临床证治》、《中西医结合治疗内科常见病》、《泌尿系统专病中医临床诊治》等专著三部。获省、校级科技进步三等奖三项。在省级以上刊物及全国性学术会议上发表论文20余篇。如： ⒈杨霓芝,包崑,王立新,等. 通脉口服液对大鼠慢性肾炎“气虚血瘀证”模型的组织形态学影响.中国中医药信息杂志,2001,15(3):31-33 ⒉王立新,杨霓芝,包崑,等.通脉口服液对系膜增生性肾炎大鼠血液流变学的影响.中医药研究,2001,17(1):42⒊杨霓芝,包崑,王立新,等. 通脉口服液对慢性肾炎气虚血瘀证大鼠模型的药效学研究.广州中医药大学学报,2000,17(4):332-336 ⒋王立新,杨霓芝,包崑,等.通脉口服液对慢性肾炎气虚血瘀证免疫功能的影响.中医药研究，2000，10（10）：16-18 ⒌杨霓芝，徐大基，王立新，等.中医综合疗法对延缓慢性肾功能衰竭的疗效观察.新中医1998；30（12）：22 专著：《心肾疾病临床证治》.广东人民出版社，2000，3 （主编） 《专科专病中医临床诊治丛书. 泌尿科专病中医临床诊治》 北京:人民卫生出版社,2000,9.（主编） 黄兆胜，教授，博士生导师，1984年广州中医药大学中药专业硕士研究生毕业，1987年3月至1989年12月由卫生部公费赴日本富山医科药科大学留学，学成回国后返广州中医药大学中药研究所工作。近年来主持并完成“生命力口服液”、“脑力宝丸”“田参胶囊”等中药新药的开发项目，并主持和承担多项国家和省部级科研课题的研究。其中主持广东省科委重点课题“补肾中药治疗药源性性功能障碍的实验研究”，1994年获广东省科委科技进步二等奖；目前承担两项国家中医药管理局课题：“虎金丸抗肝纤维化作用机理研究”和“养寿丹对老年痴呆β-淀粉样蛋白的影响”，并承担广东省中医药管理局课题“养寿丹延缓脑衰老的作用机理研究”及广州中医药研究院科学基金项目“养寿丹拆方神经生长因子活性的研究”，先后在国内外医药学术刊物发表学术论文30多篇，多篇被IM、CA和SCI等国际学术刊物所收载。 近年发表的主要论著： ⒈黄兆胜,等.虎杖甙对CCl4损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用.中国药理学通报，1998，14（6）：543 ⒉Huang Zhao-Sheng,et al.The protective effect of polydatin on rat hepatocytes injury induced by CCl4. World Journal of Gastroenterology,1999, 5(1)：41 3. Huang Zhao-Sheng, et al. Study on emodin in plant resource and pharmacology. International Journal of Oriental Medicine,1998,23(4):177 ⒋黄兆胜,等.养寿丹抗应激及免疫调节作用 《中药药理与临床》1996;(6):1 ⒌黄兆胜,等.养寿丹延缓衰老作用的实验研究 《中药新药与临床药理》1993;4(4):32 ⒍黄兆胜,等.抗衰老中药的临床药理学研究 《中药药理与临床》1997;(2):46 刘旭生, 男，37岁，副教授、硕士生导师， 1987年毕业于广州中医药大学，获学士学位，毕业后一直在广州中医药大学二附院从事临床、教学与科研工作。其间曾在中山医科大学肾病研究所进修八个月，1997年成为全国第二批名老中医学术继承人, 2001年3月出师。曾主持和参与国家级课题1项、省部级课题5项、厅局级课题1项、校级课题2项，如《川芎嗪提高腹膜透析效能的实验研究》（广州中医药大学课题：1998，1—2000，1；已结题 ，课题负责人）、《通脉口服液治疗慢性肾炎的临床与实验研究》（省中医药管理局课题：1997，1-1999，12；已结题 ，第5名）、《加味阳和汤治疗难治性肾病综合征的临床及实验研究》（国家中医管理局课题， 第三完成者）。获省级、校级科技成果三等奖各1项，获医院医疗技术成果奖三等奖4项。论文论著：发表论文30篇（其中第一作者12篇），参与编写专著4部（其中二部为副主编）。 近期已发表与本项目有关的主要论著 1．中药对提高尿毒症患者血液透析效果的作用 广州中医药大学学报1998. 2 :91-93 2．中药配合血液透析治疗尿毒症的临床研究 中国中西医结合杂志 1998.12:712-714 3．《心肾疾病临床证治》.广东人民出版社，2000，3 （副主编） 4．《泌尿科专病中医临床诊治》 第一版. 北京:人民卫生出版社,2000,9.（副主编） 林励 1982年毕业于江西中药学院中药专业，获理学士学位，先后在江西省医学科学研究所和海南大学热带生物工程研究中心从事植化、药理及资源等研究工作。1987年到广州中医药大学从事中药资源化学研究至今，其间曾赴日本旭川医科大学进行中药资源的合作研究。现任广州中医药大学副研究员，硕士生导师，博士生副导师，享受国务院颁发的政府特殊津贴。主持完成芬达宁搽剂的研制，获新药证书及96年度广东省医药科技进步二等奖，省优秀新产品奖和省科技进步三等奖。先后承担并完成国家自然科学基金“引种栽培进口南药药材质量评价”、国家八五攻关项目“常用中药材品种整理及质量评价（诃子、降香）”及部、省级项目多项，其中两项目分获广东省97、98年度中医药科技进步二等奖（均排名2），八五攻关项目98年度获国家科技进步三等奖（分课题排名2）。出版专著3部，发表研究论文60余篇。近期发表的相关论著目录如下： ⒈林励,等.木豆黄酮类成分的研究.中国药科大学学报.1999;20(1):21 ⒉林励,等.不同引种地大风子仁质量研究.中国中药杂志.1996;21(1):81 ⒊林励,等.不同品种及采收期诃子质量研究.中国中药杂志.1997;22(3):86 ⒋林励,等.木豆牡荆甙和异牡荆甙的分离与鉴定.广州中医药大学学报.1999;16(1):63 ⒌林励,等.芳香挥发性汉方中药的开发与药效研究.东洋医学杂志(日).1998;48(6):145 * 论文：作者·题目·刊名·年份·卷（期）·页码 专著：作者·书名·出版者·年份 －8a－ 五、经费预算 支 出 科 目 金 额 （万元） 计 算 根 据 及 理 由 合 计 20 1.科研业务费（合计） 3.5 (1) 调研费 1.5 含产地调研及学术会议费用。 (2) 业务资料费 2.0 含论文发表费、资料整理、打印及鉴定等费用。 2. 实验材料费(合计) 11.7 (1)试剂、药品费 7.0 含提取分离、测试试剂及药效用药盒、药品等费用。 (2)实验动物费 3.5 含实验动物购置、饲养所需费用 (3)低耗材料费 1.2 HPLC、HPLC-MS分析用相关软件的购买、升级等费用。 3. 仪器设备费(小计) 1.0 (1)仪器保养费 1.0 含HPLC-MS、HPCE、HPLC等仪器保养、维修费用。 4.实验室改装费 0.5 植化实验室的改装费用。 5.协作费 2.3 协作费用。 (1)测试分析费 2.3 含化学成分的测试分析费、实验室化验指标检测等费用。 6.项目组织实验费 1.0 科研经费等的管理、项目实施。 注: 预算支出科目按下列顺序填写: 1. 科研业务费 2. 实验材料费 3. 仪器设备费 4. 实验室改装费 5. 协作费 6. 项目组织实施费。开支范围详见《国家自然科学基金资助项目财务》第二章。 －9－ 六、申请者正在承担的其它研究项目 （攀登计划、863计划、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号、任务来 源、 起止年月、负责或参加以及与本申请项目的关系等情况） 《益气固肾透析液对维持性血液透析病人的影响》 300012 广东省中医药管理局2000滚动项目 2000-2002 负责 七、申请者承担（负责或参加）国家自然科学基金资助项目的情况 批准号 项目名称 起止年月 负责或参加 进展或完成情况 －10－ 对申请者负责的前一个已结题科学基金资助项目（项目名称及批准号）完成情况，后继研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目《研究工作总结摘要》（300字）及已发表主要相关论文首页复印件（限三篇）。 八、申请者承诺 我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助，我与本项目组成员将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，按计划认真开展研究工作，按时报送有关材料。 申请者（签章） 2002年3月10日 －11－ 九、推荐意见 （不具有高级专业技术职务的申请者，须有两名具有高级专业技术职务的同行专家推荐。推荐时，请认真负责地介绍申请者及其项目组成员的业务基础、研究能力、科研态度及研究条件等。项目组成员不能做推荐者） 推荐者（签章） 专业技术职务 专长 所在单位： 推荐者（签章） 专业技术职务 专长 所在单位： －12－ 十、申请者所在单位及合作单位的审查与保证 1. 申请者所在单位学术委员会的审查意见（包括：对项目的意义、特色和创新之处及申请者的研究水平与学风签署具体意见） 慢性肾炎是临床常病,也是目前我国引起慢性肾功能衰竭的主要原因,祖国医学在治疗慢性肾炎方面有着长足的优势，申请者在长期的临床实践中研制出通脉口服液（黄芪、三七组成）治疗慢性肾炎取得了较好的疗效.该课题组已对该项目开展了大量的前期工作,研究结果证实,临床总有效率达93.75%，动物实验提示该药可显著减轻肾脏病理损害，达到防治肾小球硬化的目的,且未发现明显毒副作用。因此有必要对通脉口服液的配伍规律及作用机制做进一步的深入研究,为开发出具有自主知识产权的治疗慢性肾炎、防治肾小球硬化的中药新药提供坚实的理论基础和科学依据。 本项目首次将在“宏观上反映中药物质群的指纹图谱法”与“显示中药微观作用的肾小球系膜细胞筛选法”相结合，建立有效物质群评价法，系统研究黄芪与三七组方配伍前后有效物质群的变化规律，科学地阐明通脉口服液配伍规律及有效物质基础。并首次从促炎性细胞因子及抑炎性细胞因子两方面探讨中药对慢性肾炎的作用机制。 申请人及项目组主要成员长期从事通脉口服液相关研究，已完成广东省科技厅相关项目研究，并通过省级鉴定。已建立开展本申报项目所需的肾小球系膜细胞培养技术和指纹图谱技术，所需仪器基本齐备，有能力如期完成本申报项目的研究工作。 本项目组成员均为本校人员及研究生组成，科研经验丰富，科研作风严谨，主要成员经长期合作，配合默契,能确保本项目顺利进行。 同意该课题申报。 主任或副主任(签章) 年 月 日 主任或副主任（签章） 年 月 日 －13－ 2. 合作单位的审查意见与保证 同意参加合作研究，保证对参加合作研究人员时间及工作条件的支持、督促其按计划完成所承担的任务（及需要说明的其它问题） 合作单位1（公章） 合作单位2（公章） 合作单位3（公章） 3. 申请者所在单位领导的审查意见与保证 已按填报说明对申请人进行了资格审查，对申请书内容进行了审核，同意学术委员会的审查意见，并保证在项目获得资助后做到以下几点： (1) 保证对研究计划实施所需的人力、物力和工作时间等条件给予支持。 (2) 严格遵守科学基金委员会有关资助项目管理、财务等各项规定。 (3) 督促项目负责人和本单位项目管理部门按科学基金委员会的规定及时报送有关报表和材料。 需要说明的其它问题： 单位负责人 （签章）