乳酸菌细胞固定化发酵的研究进展

专论与综述 中 　国 　酿　造 2009年第 5期 总第 206期 ·11　　　· 乳酸菌细胞固定化发酵的研究进展 赵春燕 ,张 　颖 ,王 　丹 ,刘 　臻 (沈阳农业大学 食品学院 ,沈阳 110161) 摘 　要 :乳酸菌是能利用糖发酵产生乳酸的一类细菌 ,在食品、医药、工业、农业和科研等领域均有广泛的应用。本文综述了利用 乳酸菌进行细胞固定化发酵生产乳酸、乳制品以及 N isin的国内外研究进展情况。并对乳酸菌固定发酵技术的应用前景进行了简 要论述。 关 　键 　词 :乳酸菌 ;固定化 ;发酵 中图分类号 : TQ 92　　　文献标识码 : A　　　文章编号 : 0254- 5071 (2009 ) 05- 0011 - 04 D evelopm en t on ferm en ta tion of imm ob ilized Lactic ac id bacter ia ZHAO Chunyan, ZHANG Ying, WANG Dan, L IU Zhen (D epartm en t of food Science, Shenyang Agricultural U niversity Shenyang 110161) Abstract: Lactic acid bacteria is a kind of bacteria which can p roduce lactic acid by fermenting sugar, it is extensively used in the field of food, medicine, industry, agriculture, scientific research and so on. This paper is a brief review of the research p rogress at home and abroad about p ro2 ducing lactic acid, dairy p roducts, and N isin by immobilized Lactic acid bacteria. The app lication foreground of fermentation of immobilized Lactic acid bacteria is also included in this article. Key words: Lactic acid bacteria; immobilized; fermentation 　 　　　　　收稿日期 : 2009202226 　　　　　基金项目 :辽宁省教育厅资助项目 (05L387) 　　　　　作者简介 :赵春燕 (19662) ,女 ,辽宁沈阳人 ,副教授 ,研究方向为食品生物技术。 　　乳酸菌细胞固定化发酵在 20多年前就开始引起人们 的关注 [ 1 ] ,随着研究的不断深入 ,利用固定化乳酸菌发酵 生产的范围越来越广泛。 1 固定化乳酸菌发酵生产乳酸 乳酸是一种重要的有机酸 ,乳酸及其盐类、衍生物在 食品、医药工业中广泛用作酸味剂、防腐剂、还原剂、杀菌 剂 ,并且可用来生产生物可降解塑料 [ 2 ]。国内多以传统的 间歇法发酵生产乳酸 ,即在发酵过程中不断添加碳酸钙以 中和发酵液中的乳酸。这不仅增加了发酵染菌率 ,而且工 艺繁杂。如何在发酵过程中 ,降低细胞周围的乳酸浓度 , 消除产物抑制 ,提高原料的利用率 ,缩短生产周期 ,降低生 产成本 ,是乳酸发酵生产需要解决的关键问 [ 3 ]。利用固 定化乳酸菌发酵乳酸可以提高乳酸产率 ,降低对培养基的 要求 ,减少产物的抑制作用。 HANG Y D等 [ 4 ]研究明 :游离细胞的乳酸产率只在 第一个循环中比固定化细胞高 ,在随后的分批循环发酵中 乳酸产量急剧下降。海藻酸钙固定化细胞能长时间保持 反应活力 ,在 18d中成功完成 9个循环发酵生产乳酸 ,在 第 5个反应中得到最大的乳酸产量为 62g/L。L INKO P等 使用海藻酸钙固定保加利亚乳杆菌和瑞士乳杆菌 ,研究了 不同种类碳水化合物对乳酸生产的影响。R ICHTER K 等 [ 5 ]在分批发酵中 ,使用含菌体数量达 1011个 /L的凝胶 珠进行发酵 ,结果每小时的乳酸的最高产量达到 139g/L 每升凝胶珠。ROUKAS T和 KOTZEKIDOU P研究了共固 定化混合培养方法 ,即将干酪乳杆菌和乳酸乳球菌共固定 在海藻酸钙 ‰ k2角叉莱胶 ‰琼脂和聚丙烯乙酰胺上 ,发酵 去蛋白乳浆生产乳酸 ,结果表明共固定化混合培养所获得 的乳酸产量高于单独固定化细胞的乳酸产量 ,其中海藻酸 钙是最好的固定化材料。 吕线红等 [ 6 ]通过实验得出海藻酸钙固定化乳酸菌发 酵生产 L2乳酸是一种比较理想的固定化方法。固定化细 胞发酵的最适培养基为葡萄糖 5010g/L、酵母粉 310g/L,比 游离细胞的发酵培养基氮源用量减少。陈晔等 [ 7 ]在单因 素试验基础上 ,利用响应曲面法 ,对固定化植物乳杆菌发 酵生产 L2乳酸的条件进行优化 ,建立了显著影响因素和 响应值之间的函数关系 ,得到回归方程。结果表明 ,最适 合乳酸发酵的固定化细胞制备条件为海藻酸钠浓度 2%、 包埋量 20mL菌悬液 /mL凝胶、固定化增殖时间 22h、颗粒 直径 1mm左右、氯化钙浓度 2%。 传统的乳酸制备主要以粮食为原料 ,为了节约粮食 , 降低乳酸发酵成本 ,近年来 ,国内外开展了利用有机废弃 物为原料发酵乳酸的研究。GIVRY S等 [ 8 ]利用海藻酸钙 固定化乳杆菌 ,发酵半纤维水解液生产乳酸 ,乳酸产量为 62177g/L,而自由细胞发酵产量只有 4113g/L。SHEN X L 等 [ 9 ]研究了海藻酸钙固定化德氏乳杆菌 ZU2S2发酵纤维 质水解液生产乳酸。最终的乳酸产量和糖利用率分别为 ·12　　　·　　 2009 No. 5 S e ria lNo. 206 C h ina B rew ing Forum and Summary 4817g/L和 9512% ,而且固定化细胞十分稳定 ,重复利用性 好 ,在 12批反复发酵中乳酸的转化率为 95%。在稀释率 为 0113h - 1的连续化生产中乳酸的转化率为 9214%。徐忠 等 [ 10 ]对影响固定化乳酸菌发酵大豆秸秆酶解液的因素进 行了研究 ,并与游离乳酸菌进行了对比 ,结果表明 ,随着底 物糖浓度的增加 ,游离乳酸菌与固定化乳酸菌发酵乳酸的 产量均有提高 ,但固定化发酵的乳酸产量要明显高于游离 乳酸菌发酵。固定化乳酸菌对温度以及 pH值的稳定性 也比游离乳酸菌好。 在固定化细胞反应器使用方面 , ARNAUD J P等 [ 11 ]将 k2卡拉胶固定化细胞接入一个连续化搅拌反应器 (CSTR) 中 ,并将搅拌速度由 50提高到 150转 ,结果表明 ,乳酸的 转化率由 10%提高到 24%。齐香君等 [ 12 ]在柱式反应床 中对固定化乳酸菌发酵生产乳酸进行了研究 ,结果表明 , 固定化细胞在柱式反应床中可以连续化进行乳酸菌发酵 , 连续发酵 5批次无细胞泄漏 ,产酸稳定。具有良好的操作 稳定性 ,乳酸产量为 69128g/L,未固定化细胞产酸量为 371 6g/L,可见固定化乳酸菌的产酸量明显提高。为了消除产 物的反馈抑制作用 ,柳萍等 [ 13 ]提出了固定化细胞发酵生 产乳酸的新方法。确定固定乳酸菌的条件为海藻酸钠浓 度 310% , CaCl2 浓度为 5% ,细胞悬浮液体积 ∶海藻酸钠溶 液体积为 1∶4。该法以海藻酸钙为载体包埋固定干酪乳 杆菌发酵生产乳酸 ,用离子交换树脂从发酵液中分离出乳 酸 ,分离出产物后的发酵液返回反应器循环利用 ,成功地 消除了产物的反馈抑制作用 ,缩短了发酵时间 ,提高了乳 酸的生产速率。与常规的发酵法相比 ,利用离子交换树脂 吸附发酵使糖转化率和乳酸生产速率分别由 8612%和 01328g/ (L·h)提高到 9417%和 01482g/ (L·h)。 在降低固定化载体成本方面 ,张强等 [ 14 ]用市售的卡 拉胶和廉价易得的木质刨花制备了 2种固定化乳酸菌。 用 015%戊二醛和 012mol/L乙二胺混合水溶液处理 1h使 卡拉胶交联加固 ,强化后的卡拉胶包埋乳酸菌连续使用 11次 ,共 528h,其产酸能力不变。同时半连续发酵产酸实 验表明 ,刨花吸附乳酸菌反复产酸 8 次 ,持续时间达 384h,其产酸能力仍为初始状态的 90%。同时对刨花吸 附乳酸菌的机理作了进一步的研究 ,指出这是一种静电吸 附作用。 2 固定化乳酸菌发酵生产乳制品 在食品中工业广泛应用的固定化技术是将细胞包埋 于食品级的多孔聚合载体 [ 15 ]。k2卡拉胶、琼脂糖、明胶、 海藻酸盐、壳聚糖都可以用来生产凝胶珠。这些聚合体作 为食品添加剂得到广泛的认可 ,尤其是在乳品工业 [ 16 ]。 余冬生等 [ 17 ]通过游离乳酸菌和固定化乳酸菌的凝乳实验 证明 ,固定化乳酸菌能使发酵体系的 pH 值下降最低 ,酸 度上升最高 ,凝乳现象明显 ,适合制备酸奶。海藻酸钙固 定化乳酸菌的胶珠放置 7d时间 ,其乳酸菌的含量仍可制 备酸奶。PREVOST H等 [ 18 ]利用海藻酸钙凝胶包埋固定化 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行连续发酵生产酸奶。 施安辉 [ 19 ]报道了利用固定化细胞技术连续发酵生产酸牛 奶的方法 ,与传统的间歇生产工艺相比 ,具有简化菌种制 备过程、乳酸菌种和发酵设备利用率高、控制简单等优点。 贺银凤等 [ 20 ]对乳酸菌固定化工艺参数及发酵特性进 行了研究 ,结果表明 ,乳酸菌包埋法固定最佳工艺条件为 : 海藻酸钠的浓度为 2% ,菌体的稀释比例为 1∶1, CaCl2 溶 液的浓度为 115% ,固定化温度为 42℃。固定化细胞胶珠 含菌量为 4159 ×109 个 /g。凝胶珠直径不同 ,对产酸能力 影响不同。小胶珠 (直径 2mm～215mm )在发酵过程中比 大胶珠 (直径 4mm～415mm)产酸速度快 ,更适合用于发酵 制备酸奶。固定化乳酸菌产酸和耐酸能力强 ,菌种活力得 到保持 ,具有持久和可重复利用的特点。 王树宁等 [ 21 ]探讨了海藻酸钙包埋乳酸菌技术 ,并对 凝胶珠的保藏性进行了研究 ,认为乳酸菌固定在海藻酸钙 凝胶珠中 ,可使乳酸菌长期保存活力不减 ,避免过多传代 造成的菌种退化。在所制得的嗜热链球菌凝胶珠中 ,菌种 活力在保存过程中几乎与活化后的嗜热链球菌活力相当。 由此可知 ,利用凝胶珠包埋乳酸菌的方法是可行的 ,可以 直接用于酸奶的生产 ,极为方便。 海藻酸钙包埋细胞时 ,凝胶颗粒的稳定性和机械强度 一般 ,不利于固定化细胞的多次利用。采用混合包埋 ,凝 胶机械强度明显提高 [ 22 ]。吴定等 [ 23 ]将 112%海藻酸钠与 115%聚乙烯醇混合作包埋试剂 ,分别制备嗜热链球菌和 保加利亚杆菌固定化球 ,按照 1∶2组合 ,前发酵 ( 38℃～ 40℃)时间约为 20m in, 后发酵时间控制为 12h ( 8℃～ 10℃) ,可确保大豆酸乳有良好的风味。蔡华珍等 [ 24 ]以甘 蔗作吸附材料 ,以海藻酸钠作包埋剂 ,吸附包埋嗜酸乳杆 菌、嗜热链球菌 ,以此作发酵剂连续发酵酸乳。结果表明 , 包埋甘蔗方块的海藻酸钠胶体溶液的浓度为 3% ,固化剂 CaCl2 为 3% ,固化 6h～8h,制得的甘蔗菌块机械强度高 , 性能优良。 固定化乳酸菌在干酪生产中也有应用 , SOD IN I I 等 [ 25 ]以 k2卡拉胶包埋的固定化细胞接种于混合培养基中 发酵生产干酪 ,干酪的凝乳时间比传统的发酵过程降低了 约 50%。党亚丽等 [ 26 ]对海藻酸钠固定化乳酸菌促熟干酪 的效果进行了研究。结果表明 ,在干酪粒中添加 106 cfu /g 固定化乳酸菌 ,水溶性氮 (W SN)、三氯乙酸氮 ( TCASN)和 磷钨酸氮 ( PTASN )含量较对照组明显增加 ;感官评定结 果表明 ,干酪粒中添加 105cfu /g固定化乳酸菌 ,干酪成熟 60d时风味和质地较好 ,可比对照组干酪成熟期缩短 30d 专论与综述 中 　国 　酿　造 2009年第 5期 总第 206期 ·13　　　· 左右。 3 固定化乳酸菌发酵生产 N is in 细菌素是某些细菌利用核糖体合成机制产生的一种 具有抗菌作用的蛋白质或多肽类物质。近年来 ,用乳酸菌 生产细菌素引起了人们相当大的兴趣。N isin是应用比较 广泛的细菌素之一 ,极易受消化酶的分解而降解成氨基 酸 ,具有天然、高效、无毒的特点 ,可用作食品防腐剂。 分批发酵是 N isin生产最常用的方法 ,但并不适合工 业化生产。以固定化乳酸菌进行连续发酵生产 N isin是降 低生产成本的好方法。许多文献报道了乳酸菌质粒的不 稳定性是连续化生产的一个限制性因素 ,而细胞固定化能 够改进许多重组细胞质粒的稳定性 ,尤其有利于质粒编码 的细菌素的生产。 在国外有关 N isin的研究中 , SCANNELL A G M等 [ 29 ] 的研究表明乳酸菌固定化提供了一个更稳定长期的生产 N isin的可能性。将海藻酸钙固定化细胞接入 MRS培养 基连续发酵 180h,同时以游离细胞做对照来证明固定化 在细菌素生产中的作用。由游离细胞细胞生产细菌素要 比固定化细胞快。然而 ,达到反应平衡后 ,固定化菌株能 够在连续发酵中保持其最大生产力。相反 ,游离细胞在反 应中途效价急剧下降 ,在反应进行到 80h后效价由 18h时 的 5120AU /mL下降为 160AU /mL。在含有固定化细胞的 反应器中最大生产力能维持相当长的一段时间。 SONOMOTO K等 [ 28 ]研究了用不同材料吸附或包埋固定化 N isin产生菌株 ,指出吸附法要好于包埋法 ,将细胞吸附于 多孔渗水的壳聚糖珠子 ( Chitopearl SH22510) , N isin的产 量比自由细胞发酵生产提高了 117倍。然而在反复培养 期间 ,发现 N isin的效价下降。但将细胞吸附于光敏树脂 凝胶珠 ( ENTG23800) , N isin产量比游离细胞提高 ,而乳酸 产量下降 ,操作稳定性也很好。 国内也有关于固定化乳酸菌生产 N isin的报道 ,孔健 等 [ 29 ]以海藻酸钙为材料 ,固定乳酸乳球菌 SM526,研究不 同条件对 N isin合成的影响。结果表明 ,利用 2%海藻酸 钠在 10mmol/L CaCl2 条件下 ,得到的固定化细胞颗粒稳 定性较好 ,可维持 90h无破裂 ,在研究中 ,去掉三种缓冲盐 成分 ,而向培养基中加入 10mmol/mL CaCl2 ,提高了颗粒 的稳定性。通过 72h 3批次循环的半连续培养 , N isin活性 为 850 IU /mL,无明显的细胞渗漏现象。连续化生产 70h, N isin活性达 1150 IU /mL,相当于游离细胞的发酵水平。 而且连续生产 N isin,大大提高了生产效率 ,发酵液中游离 细胞少 ,有利于产品分离纯化。 王永华等 [ 30 ]以卡拉胶为材料对乳酸乳球菌进行固定 化 ,分别测定分批发酵和连续发酵情况下发酵液效价、细 胞游离数等参数 ,分批发酵效价达 1420 IU /mL,但发酵过 程伴随着细胞的大量游离 ,连续发酵则克服了这一缺点 , 发酵连续运行 144h未见发酵液效价下降 ,发酵液效价稳 定在 600 IU /mL～800 IU /mL。研究采用柱式填充床反应 器进行发酵 ,该反应器操作平稳可以避免固定化细胞的大 量脱落。 焦中高等 [ 31 ]采用 k2卡拉胶作为固定化载体 ,并添加 磷酸三钙 ,包埋固定化乳酸乳球菌 DL2203发酵生产 N i2 sin。确定最佳固定化条件为 k2卡拉胶 315% (w /v) ,磷酸 三钙 011% (w /v) ,细胞浓度 5%～10% ( v/v) ,发酵培养基 添加 012%吐温 220, 30℃摇床培养进行分批重复发酵 ,连 续使用 5批以上 ,发酵液 N isin效价未有下降 ,达游离细胞 发酵液的 50%～60%。采用柱式填充床反应器进行固定 化连续发酵生产 N isin,可连续稳定生产 150h以上 ,而且 固定化小球未有明显的细胞外漏 ,发酵液 N isin效价可达 游离细胞发酵液的 30%～40%。虽然不能达到游离细胞 的发酵水平 ,但由于缩短了发酵时间 ,避免了频繁接种可 能带来的杂菌污染 ,易于自动化控制 ,因此仍是一种极具 应用前景的发酵方法。相信随着科学技术的发展 ,固定化 细胞必将取代游离细胞 ,成为天然防腐剂 N isin发酵生产 的主要方式。 以上的研究充分证明了固定化乳酸菌连续生产 N isin 是可行的 ,也为 N isin的商业化生产和应用提供了一种新 的技术和方法。 4 展望 将乳酸菌进行固定化有很多优点 ,固定化细胞应用于 食品工业的主要优点在于能保护细胞不受外界不利条件 如酸、碱、有害离子等的影响 ,并且能起到连续生产的目 的。目前 ,固定化细胞技术不够成熟 ,在细胞固定化载体 的有无毒性、性能、机械强度和微生物污染等方面还存在 不足 ,所有这些都限制了固定化细胞技术的发展和应用。 但是随着对细胞固定化技术的深入研究 ,固定化乳酸菌发 酵技术必将在医药、化学、食品等领域充分发挥潜力 ,在现 代化工业生产中占据重要地位。 参考文献 : [ 1 ] L INKO P, STENROOS S L, KO ISTINE T, et al. 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