胶体金免疫标记技术培训班技术资料

浙江大学电子显微镜室 浙江大学生物技术研究所 胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维 洪 健 徐 颖 浙江大学 2001年 10月 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 1 一、胶体金的制备 根据不同的制备方法，可以制备出直径 1－500nm 的胶体金粒子，但做为免疫标记探 针，其直径应在 3-30nm 范围内。 在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同 种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最 初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多 的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍， 数量减少为原来的 1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径 3～16nm 的胶体金。因 此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残 留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加 0.1～0.2％的 H2O2 能够去除这些残基。双标记或制备 5-10 nm 的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂，可以制备 12～150 nm 直径的胶体金。但制备大体积的胶体金 时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备 12-16 nm 直径 的胶体金。 除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备 5 nm 的胶体金，它避免了单宁酸残 基的问，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理， 故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g 或 1g），因此在配制氯化金溶液 时一次配完，暂时不用的可以用 1.5 ml 试管分装为 1 ml 保存（-20℃）。注意各种玻璃器皿 一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1％双氯硅烷/氯仿浸泡 1 小时， 烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用 0.22 μm 微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可 反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长，可 4℃保存 6 个月以上或室温下保存 1-2 个月。当出 现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如 出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备 3～16 nm 胶体金 (1) 取一 250 ml 三角瓶，加入 79 ml 双蒸水和 1 ml 1％氯化金，预热至 60～70℃。 (2) 取一 50 ml 烧杯，加入 4 ml 1％柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不 同用量的单宁酸及等量的 25 mM K2CO3。预热至 60～70℃。K2CO3 的作用是保持 溶液的中性 pH。因此如果单宁酸的量少于 0.5 ml 时，对 pH 的影响不大，K2CO3 可以省略。 (3) 将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温 10 分钟。自然冷却。 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 2 柠檬酸钠（ml） 单宁酸（μl） 胶体金（nm） 4 5000 3 4 2000 4 4 500 6 4 120 8 4 70 10 4 10 16 2、白磷还原法制备 5 nm 胶体金 (1) 取 250 ml 三角瓶一个，加 79 ml 双蒸水，1 ml 1%氯化金，并用 0.25 M K2CO3 将 溶液调至中性（pH7.0）。 (2) 取 0.2 ml 饱和磷/乙醚溶液加到 1.5 ml 试管中，再加 0.8 ml 乙醚，混匀。取 0.7 ml 加入溶液（1）中(磷有毒且易燃，操作请带手套，多余的磷溶液用 CuSO4 进行中 和)。 (3) 室温下轻轻摇匀 15 min，然后加热沸腾并保持 5 min，自然冷却。 3、柠檬酸三钠法制备 12-30 nm 胶体金(Frens, 1973) (1) 取 250 ml 三角瓶一个，加 100 ml 双蒸水及 1 ml 1%氯化金，加热沸腾； (2) 取不同量的 1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀，再保持沸腾 30 min，溶液颜色首 先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，则 颜色偏向紫色。 注 意： 柠檬酸钠(ml) 胶体金(nm) 5 12 4 16 3 24 2.8 30 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 3 (1) 由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差，以及制备过程中的其它问题，胶体金粒子的大 小及一致性与理论值可能有偏差，因此，在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太 大，粒子凝聚，粒子边缘不清晰等问题，须重新制备。 (2) 胶体金溶液最好保存在 4℃冰箱中；也可保存在室温下，一般可保存 1-2 个月。但决不可保存 在 0℃以下，否则金粒子发生凝聚。 二、蛋白-金复合体的制备 一般认为胶体金粒子表面为一层 AuCl2，因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒 子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液。 金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来 电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于 pH 值，这是因蛋 白的净电荷取决于溶液的 pH 值，在 pH=pI 时为中性。由于在 pH=pI 时蛋白溶解度最小， 因此这时它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备 中，一般胶体金调整为 pH=PI+0.5，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。 胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于（1）去除高浓度的盐分，高浓 度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用 低浓度缓冲液中进行。（2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋 白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定 量。（3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30 kD），形成的蛋白复合体往 往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知 蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长 探针寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如 BSA，牛血清蛋 白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探针。 当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳 pH 值。对于理化性质不 确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同 pH 值得胶体金结合后，只有某一特定 pH 值能够形成结合最稳定的探针。在高浓度电解质（如 NaCl）作用下不会凝聚。不同蛋白的 适宜 pH 范围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜 pH 值为最佳 pH 值。但有些探针的实际 情况并不完全如此，最稳定发探针并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。 在确定最佳 pH 值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定探针的蛋白的最小量。 如果在制备探针时加入太多的蛋白，不仅造成浪费，而且更为严重的是容易造成探针凝聚， 并严重影响标记活性。因为探针溶液中的游离蛋白容易抢先与标记位点结合，起到“封闭” （Blocking）作用，而胶体金探针标记不上。在标记位点希少、被标记物含量较少的情况 下要特别注意。 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 4 这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全 不同外，往往最佳 pH 也有一定变化。 因此，在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。 1、抗血清的前处理 一般抗血清中 IgG 的含量为 10-25%，而绝大部分为其它蛋白。用抗血清直接制备探 针其标记活性与特异性均不理想。因此需去除其中多数杂蛋白。但处理环节不宜太繁，在 实验室设备与经验缺乏的情况下更是如此，否则会导致 IgG 活性的大幅降低。如果你的实 验室在蛋白纯化方面有很强的技术支持，高度纯化后效果会更好。 大量工作表明，只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性的 IgG 蛋白。其基本步 骤如下： (1) 取抗血清 0.2 ml； (2) 加生理盐水（0.85％ NaCl）0.3 ml，混匀； (3) 逐滴加入饱和 (NH4)2SO4 0.5 ml，充分振荡混匀，4℃静置 1 h； (4) 10000 rpm/min 离心 20 min，弃上清； (5) 加 0.5 ml 生理盐水重悬浮，混匀； (6) 逐滴加 0.25 ml 饱和 (NH4)2SO4，充分振荡混匀，4℃静置 1 h； (7) 10000 rpm/min 离心 20 min，弃上清； (8) 重复 5～8 步骤一次； (9) 加生理盐水 0.5 ml 重悬浮，混匀； (10) 生理盐水中透析 12～24 h； (11) 在 0.2 M pH 9.0 硼酸缓冲液透析 12～24 h； (12) 分装，即将使用时 4℃保存，备用-20℃保存。 为最大限度保持抗体活性，整个过程应在 4℃下进行。对于冻干抗血清或长时间保存的血清，将生 理盐水透析改为 3 M KCNS 透析，促使聚合的多聚体解聚。如果抗血清效价较低时，不宜准备胶体金探 针。 2、亲和纯化抗体的处理 亲和纯化抗体多是一些商品化的通用抗体，即二抗。一般为羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人 的抗体。这些抗体一般有两个问题，一是 IgG 分子往往聚集为多聚体分子，二是往往含有 较多的盐分。因此前处理的目的在于脱盐和解聚。 其基本步骤如下： (1) 将亲和纯化抗体用生理盐水稀释为 0.5-1 mg/ml 浓度 (2) 在 3 M KCNS（硫氰酸钾）溶液中透析 12 h 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 5 (3) 在 2 mMol pH 9.0 的硼酸缓冲液中透析 12 h（更换透析液数次） (4) 分装备用 其它蛋白可参考此方法进行。但注意后一种透析液的 pH 值应与交联时 pH 值一致。 在实际运用中，一般省略去 3M KCNS 透析这一步，特别是当蛋白分子量较小，且为非糖 蛋白时。我们建议在制备通用探针（如二抗 IgG，Protein A，Protein G，Streptavidin）等时， 严格使用该方法，而制备直接标记探针时，也可以忽略处理步骤。 3、IgG Fab 片段的制备 一般来说体积较小的探针具有相对较高的标记活性。主要原因在于胶体金颗粒较小时 有利于在标记溶液中的扩散运动；在胶体金直径一定时，蛋白分子量越小，金表面吸附的 蛋白分子越多，活性位点也越密集，也容易于靶位点结合。 IgG 分子量为 150 kD 左右，由 4 个亚基组成，即两条重链（H）和两条轻链（L）。用 水解酶（木瓜蛋白酶）水解后可得到两种片段，即 Fab 和 Fc。其中 Fab 是具有抗原识别活 性的部分，回收后制备探针。Fc 能够与 Protein A 和 Protein G 特异性结合。但这种分离只 能在有条件的实验室进行。 其基本过程如下： (1) 用 PBS（pH 7.0，含 10 mM EDTA，20 mM 盐酸半胱氨酸）溶解纯化的 IgG (2) 加固化木瓜蛋白酶 (3) 37℃处理 5h (4) 离心，去除固化木瓜蛋白酶（沉淀） (5) 过 Protein G 柱 (6) 纯化的 Fab 片段按前文方法做进一步处理 注：Fab 与胶体金结合的 pH 值为 6.5 4、蛋白与胶体金结合最佳 pH 测定 (例纤维素酶，pI 未知) (1) 取若干个 1.5ml 试管，分别加入 1 ml 10 nm 胶体金； (2) 用 25 mM K2CO3 将 pH 分别调为 3，4，5，6，7，8，9，10； (3) 取一 96 孔培养板，按 pH 从低到高分别将上述胶体金分别取 100 μl 加入孔中，重 复三次； (4) 每孔分别加入 3 μl 浓度为 1 mg/ml 的纤维素酶，混合，室温下放置 10-15 min； (5) 每孔分别加入 20 μl 浓度为 10％ NaCl 溶液，混合，室温下放置 10 min； 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 6 (6) 观察胶体金颜色变化，保持红色的最低 pH(X)； (7) 重复(1)-(5)步，pH 梯度为 X-0.6；X-0.3；X；X+0.3；X+0.6；X+1。 (8) 观察胶体金颜色变化直到室温下放置 2 小时，记录仍保持红色的最低 pH。 注意： 1．如胶体金粒子直径较小（3～6nm），加 NaCl 需放置较长时间（几个甚至十几个小时）后才能观 察到颜色变化。必要时可放大反应体积（1 ml 胶体金），并借助离心来判断。 2．有些蛋白最佳 pH 范围较窄，设置的梯度不能太大。 5、最小蛋白浓度的确定 (1) 用 0.22 μm 微孔滤膜过滤或高速离心去除蛋白中残物或多聚体； (2) 取一 96 孔滴定板，每个重复为若干个孔，分别加入最佳 pH 的胶体金 100 μl，重 复 3 次； (3) 各孔依次加入不同量的蛋白（一般浓度为 0.05-0.1 mg/ml）1～20 μl，混匀，室温 下放置 15min； (4) 加入 20 μl 10％ NaCl，室温下放置 10min； (5) 颜色仍保持红色的最小蛋白用量即最小蛋白浓度。 (6) 为确保结果准确性，可放大反应体积重复以上步骤。 注：在实际探针制备工作中，蛋白浓度往往为最小浓度的 130％。 6、IgG-gold 的制备 (1) 取两个 1.5 ml 试管，分别加入 1.2 ml 10 nm 胶体金； (2) 加入适量 25 mM K2CO3 把 pH 调整为 9.0； (3) 分别加入 10 μl 浓度为 1 mg/ml IgG，混匀，室温放置 10min； (4) 分别加入 12 μl 2% PEG20000，室温放置 5 min； (5) 10000 rpm 离心 20 min，轻轻吸除上清； (6) 用 20 μl BL 溶液重悬浮松散的胶体金沉淀，并集中到新管中； (7) 分别加 20 μl 甘油，充分混匀； (8) -20℃保存备用。 注意： 1).不同直径胶体金所需要的蛋白量差别很大； 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 7 2).不同直径胶体金所需离心速度完全不同。以绝大部分探针形成松散沉淀为原则。离 心力太大，会产生不可逆的探针凝聚；离心力太小，探针无法沉下。最好能够直接用胶体 金在不同转速下离心以确定适当的离心力。 3).在冷离心机中可适当延长离心时间，同时适当减小离心力，探针活性较好。 4).IgG 的最佳交联 pH 有多种报导，从 7.4-9.0。一般认为，7.4 时胶体金结合的蛋白最 多，9.0 时制备的探针最稳定。 三、样品的固定、包埋与标记 1．固定 为了减少对标记底物结构的破坏，细胞化学样品固定的时间相对较短，多为 1-3 小时。 环境温度一般在 25°C 以下。 低温固定剂一般采用 2-3%甲醛与 1%戊二醛。甲醛分子量小、渗透快，对蛋白质结构 影响小，可较好地保存其抗原活性。但对细胞整体的细微结构保存欠佳。戊二醛对细胞的 细微结构保存较好，但往往导致蛋白失去抗原活性。因此，在标记低物不是蛋白质或多肽 时（如纤维素、多酚类化合物、β-1,3-葡聚糖、几丁质等），可用常规方法进行 4%戊二醛 和 1%锇酸的双固定。 2．包埋 根据标记低物的不同，可以选择常规（常温）包埋剂或低温包埋剂包埋样品。如果标 记物为蛋白质，特别是性质不稳定或不清楚时，建议使用低温包埋剂包埋，以最大程度保 存抗原活性。大量实验表明，K4M 是目前使用最为普遍的低温包埋剂。当选择常温包埋剂 时，建议使用 Spurr 包埋剂。Spurr 包埋剂粘性小，易渗透，易操作；包埋块不吸潮，保存 时间长。 3．标记 根据标记程序的不同，标记分直接与间接标记。直接标记指胶体金探针直接与被标记 底物结合；而间接标记指胶体金探针通过一或多个中间标记物后与底物结合。 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 8 直接标记 间接标记 直接标记需要制备胶体金探针，其好处是标记特异性好，背景小，能够做阴性对照。 间接标记无需制备胶体金探针，可以直接购买通用二抗探针，缺点是标记特异性较难把握， 背景较高，不能够做阴性对照。 在做病毒粒子标记时，直接标记法可用抗体直接富集低浓度或稀有病毒而不会增加任 何背景。 影响标记的因素主要包括以下方面： （1）pH pH 变化会对探针蛋白的结构与活性中心产生影响，继而影响到标记强度与特异性。 在很多情况下探针作用的最佳 pH 值往往与该蛋白作用的最佳 pH 值有一定差别。例如有 一种来自真菌的纤维素酶本来在 pH 4.8 时活性最强，但结合到胶体金上后，pH 在 6.0 左 右时最强，当 pH 到 7.2 时仍有较强的标记活性。 （2）离子环境 有些蛋白只有在一定离子环境中才有生物活性，其中很多涉及 Ca2+，Mg2+，Mn2+， Cu2+等阳离子。有时溶液中 Ca2+、Cu2+等容易形成不溶性沉淀而导致标记失败；因此，在 配制标记溶液时要注意各种阴阳离子的配伍，添加顺序及溶液 pH。 （3）温度 标记温度对标记活性及特异性影响最大，也最容易出问题。以水解酶类做成的胶体金 探针对温度变化也更为敏感，不同温度、不同时间标记出的切片其视觉效果完全不一样。 在此特别指出一点，在用内切的水解酶探针时，切忌温度过低，时间过长，否则会出现标 记的扩散现象。建议在可能时尽量使用外切酶探针。 在使用 IgG 或 Protein A，Protein G 探针时，有人认为在 4℃下长时间标记特异性最好。 但我们研究发现事实并非如此，在 25℃以上的室温下标记 20-60 min 其特异性更好。 一般来说，如果用来自植物或微生物的蛋白做探针，标记温度最好在 25℃左右；用来 自动物的蛋白做探针时，标记温度最好在 30℃左右。 （4）封闭液组成 封闭液对封闭有关非特异性活性基团，特别是醛基至关重要。在多数情况下封闭液与 探针重悬浮液、标记溶液是一样的。目前最常用的封闭液组分有 BSA、卵清蛋白、脱脂奶 粉、PEG20000 等。在用 IgG、Protein A、Protein G 等标记时，应优先选用 BSA(组分五)； 在植物凝集素类探针标记时，应优先选用 PEG20000。也有人发现 IgG 探针标记时脱脂奶 粉最佳。 如果是用交联蛋白做成的探针，那么封闭液中最好有载体蛋白的成分。 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 9 4．样品的低温包埋的基本程序 (1) 将新鲜样品切成 1×1×3 mm3 的小块，立即放入 3%甲醛和 1%戊二醛的磷酸缓冲 液(100 mM, pH 7.2)中 4°C 下固定 2 h； (2) 在 4°C 依次用 30%、50%乙醇溶液脱水，每步 30 min； (3) 在-20°C 冰箱中依次用 50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇溶液脱水，每 步 60 min；（注意乙醇溶液首先在冰箱中预冷！） (4) 在-20°C 冰箱中依次用 30%、70%、100%的 K4M 渗透，每步 120 min；注意不断 轻轻摇动样品使渗透完全。 (5) 在 4°C K4M 树酯包埋。注意包埋剂应尽量装满，否则气泡中的氧气会抑制包埋剂 的聚合。 (6) 在-20°C 冰箱中长紫外线照射聚合 72 h。室温下聚合 48 h。注意每天翻动 2 次样品 使紫外光照射均匀。 (7) 聚合后的样品应及时切片，长时间放置会导致样品与包埋剂之间分离而无法切片。 (8) 超薄切片应收集在镍网、金网或铍网上做胶体金标记。 与其它标记用包埋剂相比，K4M 可在-35°C 低温下仍保持较低的黏度；K4M 有极性， 亲水，易脱水，易标记；聚合后交联度高，易切片。 K4M 的配方根据的性质确定。植物或坚硬的材料包埋剂的硬度要高；动物或幼嫩 材料包埋剂的硬度要低。具体参见包埋剂说明。 注意： (1) K4M 有毒，须带 PVC 或 PVDV 手套谨慎操作。溅入眼睛或皮肤时请立刻用清水 冲洗。 (2) 所有脱水乙醇须提前预冷。 (3) 脱水过程中防止样品结霜吸潮。 5．样品常温包埋（常规）的基本程序 （1） 将新鲜样品切成 1×1×3 mm3的小块，立即放入 4%戊二醛的磷酸缓冲液(100 mM, pH 7.2)中 4°C下固定 6－12 h； （2） 样品用磷酸缓冲液冲洗 3次每次 5 min；然后在 2%锇酸溶液中固定 1 h；冲洗 3 次，每次 5分钟。（通风橱中戴手套进行，含锇酸废液倒入食用油中！） （3） 在 4°C 或室温下依次用 30%、50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇溶液 脱水，每步 15 min； （4） 依次用 30%、70%、100%的 Spurr 包埋剂渗透，每步 120 min；然后在 100%的 Spurr包埋剂中过夜。 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 10 （5） Spurr包埋剂包埋。可包埋在 0.5 ml的离心管中，每管加 0.3 ml包埋剂即可。加 入纸标签。 （6） 在 70°C温箱中聚合 12－16 h。 （7） 聚合后的样品可长时间保存。超薄切片应收集在镍网、金网或铍网上做胶体金标 记。 6．胶体金直接标记基本程序 (1) 在培养皿中铺上石蜡膜(parafilm)；四周加吸水纸和水以保湿； (2) 加一滴 dd H2O，镍网切片向下漂浮 2 min； (3) 另滴 50 μl 封闭液(BL)，将镍网切片向下漂浮 30 min； (4) 另滴 50 μl 封闭液(BL)，加入 2-3 μl 胶体金探针，充分混匀；将镍网切片向下漂浮 30 min； (5) 标记后镍网的在 dd H2O 上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗 3 次，每次 5-10 min；晾干； (6) 常规染色，观察。 7．胶体金间接标记基本程序 (1) 镍网切片向下在 dd H2O 上漂浮 2 min； (2) 在封闭液(BL)上漂浮 30 min； (3) 把一抗用 BL 稀释 100-500 倍，将镍网切片向下漂浮 30-60 min； (4) dd H2O 漂洗两次各 5 min，除去多余一抗； (5) 在封闭液(BL)上漂浮 30 min； (6) 用胶体金探针标记 30 min； (7) dd H2O 上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗 3 次，每次 5-10 min；晾干； (8) 常规染色，观察。 8．利用胶体金间接标记法进行双标记的基本程序 (1) 镍网切片向下在 dd H2O 上漂浮 2 min； (2) 在封闭液(BL)上漂浮 30 min； (3) 把一抗 A 用 BL 稀释 100-500 倍，将镍网切片向下漂浮 30-60 min； (4) dd H2O 漂洗两次各 5 min，除去多余一抗 A； (5) 在封闭液(BL)上漂浮 30 min； (6) 用小颗粒胶体金探针 A 标记 30 min； (7) dd H2O 漂洗两次各 5 min，除去多余胶体金探针 A； (8) 重复步骤(2)-(7)，其中抗体和探针改用一抗 B 和大颗粒胶体金探针 B； 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 11 (9) dd H2O 上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗 3 次，每次 5-10 min；晾干； (10) 常规染色，观察。 9．利用胶体金直接标记法进行双标记的基本程序 如果两种探针的重悬浮液相同（如同为 IgG-gold），可直接混合，按上述 5 的方法进 行。单混合时大颗粒胶体金的量要适当增加。 如果两种探针的重悬浮液差别较大，可分别进行直接标记。步骤如下： (1) 镍网切片向下在 dd H2O 上漂浮 2 min； (2) 在封闭液 1 上漂浮 30 min； (3) 用胶体金探针 1 标记 30 min； (4) dd H2O 上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗 2 次，每次 5-10 min； (5) 在封闭液 2 上漂浮 30 min； (6) 用胶体金探针 2 标记 30 min； (7) dd H2O 上漂洗除去未标记的胶体金探针，共漂洗 3 次，每次 5-10 min；晾干； (8) 常规染色，观察。 10．直接法标记粗提纯病毒 (1) 取新覆膜镍网，在用 BL 稀释 500 倍的病毒抗血清上漂浮 3 min； (2) 在病毒溶液上吸附 10 min； (3) BL 封闭 30 min； (4) 一抗胶体金探针标记 30-120 min； (5) 水洗 3 次，每次 5-10 min； (6) 2%醋酸双氧铀负染。 注意： (1) 如果使用间接标记方法，不能采用或只能采用高度稀释的抗体吸附病毒。否则，高强度的标 记背景影响正确判断。 (2) 该方法允许多探针直接混合一步法同时标记多种病毒。特别适应于对未知病毒的。 胶体金标记技术路线的选择 1．包埋剂 根据抗原或标记底物性质决定包埋剂种类。 蛋白类，推荐使用 K4M；包埋后立即切片标记。 外泌蛋白可选择 spurr。可长期保存使用。 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 12 细胞结构组分，如纤维素、β-1,3-葡聚糖、几丁质、多酚化合物等，可选择 spurr。 2．胶体金体积 精细定位如病毒、细胞器定位等选用 5 nm 胶体金。细胞壁组分采用 15-20 nm 胶体金。 多标记时，胶体金直径推荐选用 6 nm、10 nm、15 nm；稳定抗原采用较大颗粒胶体金。一 般蛋白标记采用 10 nm。 3．通用探针选择 IgG-gold：-20°C 可保存 1 年；但定位时胶体金距离标记位点较远，不适于精细定位。 Protein A/G：-20°C 可保存 3 个月；但定位时胶体金距离标记位点较近，适于精细定 位和多标记。 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 13 Protein A 和 Protein G 与不同抗体之间的亲和性 抗体来源 IgG类型 与 Protein A的亲和性 与 Protein G的亲和性 IgG(正常) ++++ ++++ IgG1 ++++ ++++ IgG2 ++++ ++++ IgG3 － ++++ 人 IgG4 ++++ ++++ IgG1 + ++++ IgG2a ++++ ++++ IgG2b +++ +++ 小鼠(mouse) IgG3 ++ +++ IgG1 － + IgG2a － ++++ IgG2b － ++++ 大鼠(rat) IgG2c + ++ 山羊(goat) IgG － ++ 绵羊(sheep) IgG －／+ ++ 家兔 IgG ++++ +++ 狗 IgG ++++ ++++ 猪 IgG +++ +++ 鸡 IgG － + 马 IgG ++ ++++ 豚鼠(guinea-pig) IgG ++++ ++ 仓鼠(hamster) IgG + ++ 猫 IgG ++++ － 小牛 IgG ++ ++++ 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 14 胶体金制备与标记中常见的缓冲液配方 1．醋酸盐缓冲液（200 mM） pH 200 mM NaAc (ml) 200 mM HAc (ml) pH 200 mM NaAc (ml) 200 mM HAc (ml) 3.6 0.75 9.25 4.8 5.9 4.1 3.8 1.20 8.8 5.0 7.0 3.0 4.0 1.8 8.2 5.2 7.9 2.1 4.2 2.65 7.35 5.4 8.6 1.4 4.4 3.7 6.3 5.6 9.1 0.9 4.6 4.9 5.1 5.8 9.4 0.6 200 mM NaAc 溶液的配制：NaAc·3H2O 定容于 1000 毫升。 2．磷酸盐缓冲液（PBS, 200 mM） pH 200mM Na2HPO4 (ml) 200mM NaH2PO4 (ml) pH 200mM Na2HPO4 (ml) 200mM NaH2PO4 (ml) 5.8 8.0 92 7.0 61 39 6.0 12.3 87.7 7.2 72 28 6.2 18.5 81.5 7.4 81 19 6.4 26.5 73.5 7.6 87 13 6.6 37.5 62.5 7.8 91.5 8.5 6.8 49 51 8.0 94.7 5.3 1 M Na2HPO4溶液的配制：178.05 克 Na2HPO4·2H2O 或 358.22 克 Na2HPO4·12H2O 定容于 1000 毫升。 1M NaH2PO4溶液的配制：138 克 NaH2PO4NaAc·H2O 或 156 克 NaH2PO4·2H2O 定容于 1000 毫升。 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 15 3．Tri·HCl 缓冲液（50mM） pH 23°C 37°C 200mM Tris (ml) 100mM HCl (ml) pH 23°C 37°C 200mM Tris (ml) 100mM HCl (ml) 9.10 8.95 25 5.0 8.05 7.90 25 27.5 8.92 8.78 25 7.5 7.96 7.82 25 30.0 8.74 8.60 25 10.0 7.87 7.73 25 32.5 8.62 8.48 25 12.5 7.77 7.63 25 35.0 8.50 8.37 25 15.0 7.66 7.52 25 37.5 8.40 8.27 25 17.5 7.54 7.40 25 40.0 8.32 8.18 25 20.0 7.36 7.22 25 42.5 8.23 8.10 25 22.5 7.20 7.05 25 45 8.14 8.00 25 25.0 50 mM Tris 溶液的配制：36.3 克 Tris 定容于 1000 毫升。 4．硼酸盐缓冲液（200 mM） pH 50mM Na2B4O7 (ml) 200mM H3BO3 (ml) pH 50mM Na2B4O7 (ml) 200mM H3BO3 (ml) 7.4 1.0 9 8.2 3.5 6.5 7.6 1.5 8.5 8.4 4.5 5.5 7.8 2 8 8.7 6 4 8.0 3 7 9.0 8 2 200 mM H3BO3 溶液的配制：12.37 克 H3BO3 定容于 1000 毫升。 50mM Na2B4O7·溶液的配制：19.07 克 Na2B4O7·3H2O 定容于 1000 毫升。 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 16 5．碳酸盐缓冲液（100 mM） pH 20°C 37°C 100 mM Na2CO3 (ml) 100 mM NaHCO3 (ml) pH 20°C 37°C 100 mM Na2CO3 (ml) 100 mM NaHCO3 (ml) 9.16 8.77 1 9 10.14 9.99 6 4 9.40 9.12 2 8 10.28 10.08 7 3 9.51 9.40 3 7 10.53 10.28 8 2 9.78 9.50 4 6 10.83 10.57 9 1 9.90 9.72 5 5 100 mM Na2CO3溶液的配制：28.62 克 Na2CO3定容于 1000 毫升。 100mM NaHCO3溶液的配制：8.4 克 NaHCO3 定容于 1000 毫升。 本缓冲液临用前配制，不能长时间保存。实验系统中有 Ca2++、Mg2++时不能使用。 图 1. IgG的基本结构 H，重链；L，轻链；HC，重链保守区；HV， 重链变异区；LC，轻链保守区；LV轻链变 异区。 箭头为木瓜蛋白酶与胃蛋白酶的酶切位点。 Fab、Fc分别为木瓜蛋白酶水解后的两种片 段。Protein A和 Protein G可识别 Fc部分。 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 17 主要参考文献 1. Beesley JE ed. Immunocytochemistry, a Practical Approach. Oxford University Press. 1993 2. Benhamou N, Lafontaine PJ. 1995. Ultrastructural and cytochemical characterization of elicitor-induced responses in tomato root tissues infected by Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici. Planta 197: 89–102 3. Benhamou N, Lafontaine PJ, Nicole M. 1994. Seed treatment with chitosan induces systemic resistance to Fusarium crown and root rot in tomato plants. Phytopathology 84: 1432–1444 4. Brangeon J and Sossutzov L. l993. Electron microscopic in situ hybridization to RNA and DNA in plant cells. in Morel G ed., Hybridization Techniques for Electron Microscopy. Boca Ratront: CRC Press. pp302-348 5. Couble P. 1993. Principles of probe preparation for in situ hybridization. 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London: Academic Press. pp:181-2l8 临床实验室收集 www.clin-lab.com 临床实验室收集 www.clin-lab.com 浙江大学胶体金免疫标记培训班资料 19 常见胶体金探针制备条件（10ml 直径 10nm 胶体金） 探针蛋白 来源 分子量 (kD) 交 联 pH 最佳标记 pH 蛋白用量 (μg/ml) 重悬浮液 特异性标记底物 IgG 哺乳动物 150-160 7.0-9.0 120 BL 1 各种抗原 IgG Fab IgG 水解 45 7.5 150 BL 各种抗原 Protein A 葡萄球菌 42/32(recomb) 60 8.2 60 BL 多种抗体(Fc 片段) Protein G 链霉菌 45-47 6.0 90 BL 多种抗体(Fc 片段) 麦胚凝集素(WGA) 大麦 36 7.2/9.5 125 BL 几丁质 伴刀豆凝集素(Con A) 伴刀豆 102 8.0 250 1mM Ca2++1mM Mn2+ in BL α-甘露糖>α-葡萄糖>几丁质 蓖麻凝集素 I(RCA I) 蓖麻 120 8.0 60 BL β-半乳糖>α-半乳糖>>几丁质 大豆凝集素(SA) 大豆 110 7.4 65 BL D-氨酰化半乳糖 花生凝集素(PA) 花生 110 6.3 130 BL D-氨酰化半乳糖 亲和素(avidin) 鸡蛋 67 11.0 120 BL 生物素(biotin) 链亲和素(streptavidin) 链霉菌 60 7.5 200 BL 生物素(biotin) β-1,3-葡聚糖酶 烟草 5.5 180 BL β-1,3-葡聚糖 纤维素酶 绿色木霉 9.0/7.5 160 BL 纤维素 漆酶(lacasase) 白色腐霉 4.0 100 BL (pH 6.0) 多酚类化合物 通用 BL配方：50 mM PBS, pH 7.0,，内含 1% BSA，0.02% PEG20000，100 mM NaCl，1% NaN3。 临床实验室收集 www.clin-lab.com