小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验

小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验 小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验 …………………………………………………………………………………………… 【摘要】：目的：通过可移植性小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验,从感性上认识肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性,了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义。方法：使用小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移菌株进行20只近交系615小鼠脚垫接种，检测瘤株淋巴结转移能力。结果：小鼠存活率19/20，成瘤率4/19，淋巴道转移率1/4。结论：此方法操作简单，小鼠腹水型肝癌淋巴道转移率较高。 【关键词】：肝癌；淋巴道转移；动物模型；小鼠 中图分类号：R73-3 文献标识码：B 【前言】：615小鼠腹水型肝癌淋巴道转移的机制具有人肝癌淋巴道转移的特点，为肝癌的淋巴道转移研究建立适宜的研究平台。肝癌属于上皮性恶性肿瘤，以淋巴道转移为主。淋巴道转移常有一定的规律，往往先转移区域性淋巴结，之后为远膈淋巴结（主要在颈部、纵膈及腹主动脉旁淋巴结）。实验目的通过可移植性小鼠腹水癌淋巴道转移实验,从感性上认识肿瘤侵袭与转移的生物学特性,了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义。 材料与方法 1.实验材料：研究对象（1）细胞系：高转移力小鼠腹水型肝癌细胞，由大连医科大学病理教研室建株并保存。（2）实验动物：近交系615小鼠，雌雄兼用，6—8周龄，体重18—22g，由大连医科大学实验动物中心提供。 主要仪器及器皿：搪瓷盆、温度计、离心管、1ml注射器、手术刀、眼科手术剪、眼科手术镊、乳胶手套、生理盐水、1%来苏儿溶液、75%酒精棉、10%甲醛固定液等。 2.研究方法 细胞系获取。从液氮罐中取出高转移力小鼠腹水型肝癌细胞塑料冻存管，立即放入40度的温水中，一分钟内使冻存液全部融化，拉力机送入无菌室中。取出细胞悬液放入离心管中，有生理盐水洗涤2次，离心，弃上清，在加1ml生理盐水吹打均匀。向小鼠腹腔内接种0.2mlHCa-F细胞悬液，于第6天无菌条件取腹水。 3.615小鼠脚垫接种肿瘤细胞。取615小鼠癌性腹水0.1ml，接种于615小鼠脚垫上。定期观察肿瘤生长及淋巴结肿大情况。四周后处死全部小鼠，取瘤体及相关淋巴结，同时观察肺、肝、肾等器官。将上述组织固定于10%甲醛固定液中，石蜡包埋制片，HE染色，显微镜检查。 4.组织取材。将皮下瘤体、淋巴结、肺、肝、肾选取病变部位，切成厚2—3mm的小于2cm×1cm大小的组织块，10%中性甲醛固定。小块组织一般固定数小时，较大标本需固定24—48小时。经冲洗（用递升浓度的酒精等）、透明（用二甲苯等）、浸蜡（用石蜡），然后用石蜡将组织包埋成蜡块，再经切片机切片和染色制成切片。一般常规作苏木精-伊红染色。 5.切片脱色。石蜡切片法、HE染色法。 脱水程序及时间：组织固定，冲洗，然后：（1）脱水。以下列顺序进行：60%酒精30分钟→80%酒精1—2小时→95%酒精2—4小时或过夜→95%酒精2—4小时→100%酒精2—4小时→100%酒精2—4小时或过夜。（2）透明：二甲苯I30—45分钟；二甲苯Ⅱ30—45分钟。（3）浸蜡。蜡碗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（各30—45 分钟）；包埋。（4）修蜡块。修蜡块，贴号。（5）切片。（6）烘烤。烘烤切片60—70摄氏度，1小时。（7）染色。 HE切片染色程序与方法: 1.切片脱蜡水洗：将烘干的切片浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5-10分钟。 无水酒精3-10分钟（消除二甲苯）→95%酒精1-3分钟→80%酒精1-3分钟→70%酒精1-3分钟→50%酒精1-3分钟→自来水冲洗5分钟以上（洗去切片上的酒精，切片透明）→蒸馏水清洗（防止污染苏木精染液）。 脱蜡是水华过程，目的是通过酒精的缓冲作用，易于水洗与染色。因为染剂是谁，从无水酒精直接放入染液中，容易引起激烈的扩散作用，造成切片漂浮脱落或损伤组织。而经各级浓度酒精缓冲后即可避免发生这种现象。 2.HE染色：苏木精-伊红染色是先用苏木精将组织切片适当的果然，经水洗后再用盐酸酒精分化，弱碱性水溶液显蓝。使胞核呈明显的蓝色，胞质及背景无色。再经水洗后用伊红染胞质，染成深浅不同程度的粉红色至红色。 苏木染色（染核）5-15分钟→自来水冲洗3-5分钟→0.5%盐酸酒精溶液分化数秒钟→自来水洗1-5分钟→弱碱性水溶液显蓝30-60秒→自来水冲洗5-10分钟→蒸馏水洗1-2次→伊红1分钟→蒸馏水洗1-2次。 3.脱水、透明、封固：脱水、透明的目的是使存留在切片上的水分及漂浮的染色液全部除净，经透明剂的作用后，将脱水剂清除出来，使切片产生适宜的折光率。最后用盖玻片及封固剂封固，便于观察和长期保存。 80%酒精30-40秒→95%酒精30-60秒→无水酒精Ⅰ1-5分钟→污水酒精Ⅱ1-5分钟→二甲苯Ⅰ1-5分钟→二甲苯Ⅱ1-5分钟→中性树胶封固。 【结果】:显微镜观察淋巴结转移的分布与转移率 1．皮下瘤体： 大体：皮下瘤体较大，呈灰白色，质硬，与皮下组织黏附紧密、界限不清。ＬＭ：瘤细胞分布不规律（组织结构异型性），细胞体积较大、形态不一，核较大，胞质蓝染，呈嗜碱性（细胞异型性）。 2．同侧腋下淋巴结： 大体：比正常淋巴结大，呈卵圆形，质硬，切面灰白色。 ＬＭ：在淋巴结的边缘窦处可看到某些细胞分布不规律，细胞体积较大、形态不一，核较大，胞质蓝染，与在皮下瘤体的切片中看到的瘤细胞形态相似，表明此淋巴结中的肿瘤组织是原发在皮下的肿瘤经淋巴道转移的结果。 3．肺、肝、肾； 大体：未见异常 ＬＭ：未见到组织结构和细胞的异型性。表明此种肿瘤未经血道转移 【讨论】: 1.为什么选用615小鼠做小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移细胞株的移植瘤实验？615近交系小鼠是中国医学科学院血液学研究所1961年5月用本所饲养的昆明种白化雌性小鼠和由前苏联引进的C57BL血研黑色雄性近交系小鼠杂交而得的第一代后，用杂交第一代严格按照同胞兄妹交配的原则连续繁殖20代以上得到的一系棕色小鼠。由于615小鼠淋巴系统比较发达且有许多近交系，部分近交系 有其特定的自发性肿瘤，可利用其自发肿瘤与人体肿瘤的相似之处做为动物模型进行肿瘤发生、发展和治疗的研究。同时，胸腺严重缺陷的裸小鼠可接受人类各种肿瘤细胞的植入，成为活的癌瘤细胞"试管"，是研究人类肿瘤生长发育、转移和治疗的绝佳动物。 2.为什么选用615小鼠的右腋皮下作为肿瘤细胞的接种部位? 因为小鼠右腋皮下腋下作为肿瘤细胞的接种部位是其由于此处的淋巴结相对较多，且有血循环丰富，利于肿瘤的转移的优点。 3.恶性肿瘤细胞转移的可能机制有哪些? ①淋巴道转移（lymphaticmetastasis）:恶性肿瘤侵入淋巴管后，随淋巴流首先到达局部淋巴结。局部淋巴结发生转以后，可继续转移至下一站的其他淋巴结，最后，可经胸导管入血再继发血道转移。值得注意的是，有的肿瘤可以逆行转移（Troisiersign）或者越过相应的引流淋巴结发生跳跃式转移（skipmetastasis）。②血道转移（hematogeneousmetastasis）:恶性肿瘤细胞侵入血管后可随血流到达远处器官继续生长，形成转移瘤。血道转移的途径与血栓栓塞的过程相似，即侵入体循环静脉的恶性肿瘤细胞经右心到肺，在肺内形成转移瘤。此外，侵入胸、腰、骨盆静脉的恶性肿瘤细胞也可以通过吻合枝进入脊椎静脉丛。 ③种植性转移（transcoelomicmetastasis）：体腔内器官的恶性肿瘤蔓延至器官表面是，其肿瘤细胞可以脱落，并向播种一样种植在体腔内各个器官的表面，形成多数的转移瘤，这种方式亦称为播种。值得注意的是，手术也可能造成医源性种植性转移。 4.根据是否能贴附在支持物上生长的特点分类： 体外培养细胞可分为贴壁型和悬浮型两大类。贴壁型细胞在培养时能贴附在支持物表面生长，大多数培养细胞呈贴附型生长。要想使细胞脱离附着底物表面和离散成单个细胞，必须使用胰蛋白酶等消化液消化，如果消化过头或不当，消化液则可以使细胞膜结构损伤，影响实验结果。悬浮型细胞在培养时不贴附于支持物上，而是呈悬浮状态生长在培养液中，其优点是细胞生存空间大，容许时间长，能繁殖多量细胞，在与药物作用时，可以与药物充分接触，药物敏感性高，而且不需用消化液处理，细胞膜结构不遭到破坏。HCa—P／可在小鼠腹腔传代，呈自由悬浮式生长，短期内可获得大量活性特别好的细胞，可应用于大规模药物筛选之中。 5.目前，因缺乏特异的肿瘤淋巴道转移模型，明确的淋巴道转移相关基因还未见报道。哪些基因控制调控了肿瘤的淋巴道转移，淋巴道转移的机制与血道转移有何区别等都知之甚少。作为恶性上皮肿瘤早期转移的主要形式，淋巴道转移机制的解析对临床肿瘤转移的诊治有着更为积极的意义。 【参考文献】 1.李海燕,方肇勤,梁尚华。小鼠移植性肝癌(H22)模型的研究及在中医药抗肿瘤中的应用，中国中医基础医学杂志，2000，6（1）：27 2.凌茂英,刘希风,郑怀祖,等.小鼠肝癌细胞系H22-F25/L的建立及其生物学特性.中华肿瘤杂志,1991,13(1):13. 3.孙成荣,唐建武,孙明忠,等.采用定量蛋白质组学技术筛选小鼠肝癌淋巴道转移相关蛋白[J].生物化学与生物物理进展,2007,34(8):856-864. 4.陈桑,凌茂英,刘希风,等.小鼠腹水型肝癌高、低转移克隆稳定性的研究[J].大连医学院学报,1992,14:32-37. 5.张宏颖，唐建武，朱文婷，胡春秀，许国旺。小鼠腹水型肝癌淋巴道高 转移细胞系HCa—P／L6细胞模型的建立及其药物敏感性的评价。大连医学院学报2008，30（4）.