应用PVA构建妊娠相关血浆蛋白A固相时间分辨荧光免疫试剂

应用PVA构建妊娠相关血浆蛋白A固相时间分辨荧光免疫试剂 　　［关键词］ 妊娠相关血浆蛋白A；固相时间分辨荧光免疫；亲和素—生物素—聚乙胺—4,7二氯磺苯基?1，10啡罗?2，9二羧酸—复合物；唐氏综合征 　　Develop A Direct Solid Phase Lanthane Time?resolved Fluoroimmunoassay Reagent of PAPP?Autilizing PVA 　　Abstract :Objective To develop a direct solid phase lanthane time?resolved fluoroimmunoassayreagent of PAPP?A by synthesizing a complex of (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3 . Methods Polyvinylamine (PVA) was labeled with biotin?streptavidin and europium chelate of 4,7?bis(chlorosulfophenyl)?1,10?phenanthroline?2,9?dicarboxylic?acid(BCPDA). Using labeled PVA complex,We designed two?site sandwich time?resolved fluoroimmunoassay of PAPP?A and evaluated assay characteristics of PAPP?A kit .Results We successed synthesizing a conjuagete of (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3 and a reagent of PAPP?A. Detection limits achieved were 0.7mIU/L.The calibration curve was linear 0?10000mIU/L.Intra? and interassay imprecision (CV) was 3.89%?4.96% and 7.35%?9.27%.Recovery was 95.8%?104.2%. Conclusions The conjugate of (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3 synthesizied was reactive ,highly fouorescent. A sorts of kit could be synthesized ,taking advantage of it. The reagent of PAPP?A was potentially suited for use in clinical with highly analytical sensitivity. 　　Key words: Pregnancy associated plasma protein A;Direct solid phase lanthane time?resolved fluoroimmunoassay; Streptavidin?biotin?Polyvinylamine? europium chelate of 4,7?bis(chlorosulfophenyl)?1,10?phenanthroline?2,9?dicarboxylic?acid; Down's Syndrome 　　妊娠相关血浆蛋白A(Pregnancy associated plasma protein A，PAPP?A)是一种高分子α2糖蛋白，20世纪70年代在孕妇血清中被发现［1］。在孕妇血中主要PAPP?A是胎盘滋养层组织分泌，它是一种异源四聚体，由两个分子量为200 000~250 000亚基构成。PAPP?A亚基和两个嗜红细胞主要基础蛋白(Proform of eosinophil major basic protein)以二硫键结合而成［2］，在孕妇血中只存在微量游离单体PAPP?A。PAPP?A亚基由1 547个多聚核苷酸构成，包括1个拉长的锌指结构，3个Lin—notch重复序列，以及5个短一致重复序列［3］。在体内PAPP?A是一种蛋白酶，主要针对胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP?4)和胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP?5)起作用。胰岛素样生长因子I(IGF?I)在促进细胞分裂和增殖起重要作用，它主要通过IGF?1受体起作用，IGF?I、II的生物活性受6个高亲和性IDFBP调节［4，5］。PAPP?A主要用于产前筛查唐氏综合征(Down's Syndrome，DS)，迄今医学上对此病尚无有效的治疗和预防措施，只能通过产前筛查防止DS儿的出生，但目前开展的绒毛活检,羊水穿刺及脐带血穿刺均为侵入性检查,有1%～3%的流产率,且方法繁琐,出报告时间长,不适宜大范围孕妇的普查,仅限于高危人群的诊断。大量报道认为PAPP?A可作为DS胎儿产前筛查的的标志物。在15周～20周通过结合孕妇孕周、超声诊断和Freeβ?HCG可以鉴别65%～75%，但要在3个月～6个月结合AFP、游离E3以及抑制素上述成分可鉴别85%～90%［6］。有文献［7］报道PAPP?A在急性冠状动脉综合征(ACS)的早期诊断有一定的意义，PAPP?A在ACS患者血清含量＜30 mIU/L，同时结构不同于孕妇体内的PAPP?A且存在动态变化，必须利用超灵敏的方法进行检测。国内PAPP?A的诊断试剂大多为ELISA和PerkinElmer公司生产的解离增强时间分辨荧光免疫(dissociated enhance lanthane time?resolved fluoroimmunoassay,DELFIA)试剂，无国产PAPP?A时间分辨荧光试剂。我们利用PVA(聚乙胺)作为载体结合BCPDA镧系螯合物合成一种高灵敏的固相时间分辨荧光免疫分析(direct solid phase lanthane time resolved fluoroimmunoassay,DSLFIA)试剂。为提高检测灵敏度和克服BCPDA标记抗体使抗体失活的问题，我们引入了生物素?亲和素(biotin?streptavidin system)系统。