应用PCR芯片筛查人重度肾积水组织的

应用PCR芯片筛查人重度肾积水组织的 国睦处整堂盘查！塑生Ｚ旦筮堑鲞筮！魍丛翌趔型墅型鱼塾魁 地兰塑，型：堑，奠！：！ ＋４４５’ 应用ＰＣＲ芯片筛查人重度肾积水组织的纤维化相关基因 姚颐１ 张杰２‘ 叶达夫１ 谭大清１ 彭建平１ ｆａｃｔｏｒ－ｔｔ， 【摘要】目的探讨纤维化相关基因，特别是与转化生长因子母（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ＴＧＦ—Ｂ）信号通路相关的基因在人重度积水肾与正常肾组织中的差异表达变化。方法（ｂｏｎｅ 收集临床重 度肾积水新鲜标本１２例，正常肾组织标本６例，分别提取总ＲＮＡ并纯化。选择ＴＧＦ—Ｂ／骨形成蛋白 ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ）信号通路ＰＣＲ一芯片，采用比较阈值法（ＡＡＣｔ法）比较两组基 因的差异表达。以表达差异（即上调或下凋）大于２倍的基因为有意义的差异基因。结果共筛查出表达具有显著性差异的基因４９个，包括ＴＧＦ．Ｂ超家族成员基因及其受体、ＴＧＦ．Ｂ信号通路靶分子和相关调控分子等等。其中上调２５个，包括ＢＭＰ３、Ｉ型胶原仅ｌ链（Ｃｏｌ－Ｉａ１）、Ｎｏｄａｌ、ＧＳＣ、胰岛素样生长因子Ｉ（ｉｎｓｕｌｉｎ—ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ １，ＩＧＦｌ）等；下调２４个，包括Ｌｅｆｔｙｌ（１ｅｆｔ－ｆｉｇｈｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｆａｃｔｏｒ １）、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２和骨形成蛋白内皮结合调节因子（ＢＭＰｒｅｇｕｌａｔｏｒ，ＢＭＰＥＲ）等。结 论证明了Ｎｏｄａｌ、ＧＳＣ和ＩＧＦＩ等是促进肾纤维化改变的重要因子，并推测Ｌｅｆｔｙｌ与ＢＭＰ家族的部分成员，包括ＢＭＰ２—３、ＢＭＦ７和ＢＭＰＥＲ等，在调控终末期肾积水纤维化改变中占有重要地位。 【关键词】肾积水；肾纤维化；基因芯片；功能基因组学 ＰＣＲ－ｍｉｃｒｏａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｆｉｂｒｏｓｉｓ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｆｉｂｒｏｔｉｃｒｅｎａｌｔｉｓｓｕｅｒｅｓｕｌｔｉｎｇｆｒｏｍｈｙｄｒｏｎｅｐｈｒｏｓｉｓ ＴＡＮＤａ—ａｎｇ，ＰＥＮＧＣｈｉｎａ ＹＡＯＹｉ，ＺＨＡＮＧ ｍ，ＹＥＤａ．凡， Ｊｉａｎ一只昭Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ０ｆＵｒｏｌｏｇｙ，ＲｅｎｍｉｎＨ∞ｐｉｔａｌｏｆＷｕｌｕｍＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｌｍｎ４３００６０， 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｄｍｎｅｐｈｒｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｎｏｒｍａｌｒｅｎａｌ ｔｈｅｆｉｂｒｏｓｉｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅｓ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｔｈｏｓｅｍｍｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏ讲ｈ ｉｎｔｈｅｔｉｓｓｕｅｏｆｅｘｔｅｎｓｉｖｅｆｉｂｒｅｔｉｅｋｉｄｎｅｙｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｆａｃｔｏ卜Ｂ（ＴＧＦ一１３）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｆｒｏｍ∞ｖｅｒｅｂｙ－ Ｃｏｍｐａｒｅｄ１２ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｆｉｂｍｔｉｅｋｉｄｎｅｙｓｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｗｅｒｅ ｆｒｏｍ跎Ｄｖｅｒｅｈｙｄｒｏｎｅｐｈｒｏｓｉｓｗｉｔｈ６ｈ∞ｐｉｔａｌｆｒｏｍＡｕｇ．２００５ ｔｏ ｔｉ￥￥ｕ船ｕｓｉｎｇＰＣＲａｒｒａｙ．Ａｌｌｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ ｏｕｒ Ｄｅｃ． ２００６．ＴｈｅｄａｔａｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＡ△Ｃｔｍｅｔｈｏｄ．Ｗｈｅｎ２ＡＡＣｔ≤０．５ｏｒ≥２．ｔｈｅｄｉ自ｆｅｒｅＩｌｃｅｎｉｆｉｃａｎｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｗｈｉｃｈ，２５ｗｅｒｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓｏｆ Ａｔｏｔａｌｏｆ４９ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｗ髂ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｓｉｇ－ ｏｕｔ． ｇｅｎｅｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｆｉｂｒｏｔｉｃｒｅｎａｌｔｉｓｓｕｅｓｗｅ陀ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｄｏｗｎ－ｒｅｓｕｈｌｅ‘ｔ．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ａｎｄ２４ｗｅｒｅ ｇｅｎｅｓｉｎｃｌｕｄｅｄｍｅｍｂｅｒｓａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅｏｆ ＴＧＦ—Ｂ ａｎｄ ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）ｆａｍｉｌｙ，ｔａｒｇｅｔＴＧＦ－９ ｏｒ ＢＭＰｓｉｇｎａｌｐａｔｈｗａｙａｎｄｓｅｖｅｒａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ｔｏ Ｔｈｒｏｕ＃ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｗｅ ａ ｗｉｔｈＰＣＲａｒｒａｙ，Ｗｅｃｅｒｔｉｆｉ— ｅａｔｅｄ ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆＮｏｄａｌ，ＧＳＣａｎｄＩＧＦＩｒｏｌｅｉｎｒｅｎａｌｆｉｂｒｏｓｉｓ，ｗｈｉｌｅＢＭＰｆａｍｉｌｙ ｒｅｎａｌｆｉｂｒｏｓｉｓ．ＡｎｄＬｅｆｔｙｌｗｏｒｋｉｎ ｓｕｐｐｏｓｅｔｈａｔ ＴＧＦ－Ｂ曲ａ ｓ∞－ 伽ｄａｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｅｉｎｔｈｅｒｅｓｕｌａｔｉｎｓｏｆ ｒｅｎａｌｆｉｂｒｏｓｉｓ． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｈｙｄｒｏｎｅｐｈｒｅｓｉｓ；ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ；ｇｅｎｅｃｈｉｐ；ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓ 梗阻性肾积水常导致肾纤维化的发生。延缓或逆转这一过程，是外科医师在解除积水前后都应重视 关系如何，尚未得出满意的答案。本文即通过基因芯片筛查，试图从基因表达的差异谱中找到突破。１与方法１．１材料 选取武汉大学人民医院泌尿外科２００５年１０月～２００７年８月因重度积水导致肾脏无功能而手 的问题。迄今已发现，与肾纤维化有关的信号通路有 数十条之多，肾纤维化的分子机制正日益清晰。但是 哪一条（或几条）通路是最为关键的，各通路之间的 ＤＯＩ：１０．３７６０／ｅｍａ．ｊ．ｉｔａｎ．１６７３－４２０３．２００９．０７．０６ 基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（Ｎｏ．２００６０４８６０５４） 作者单位：１４３００６０湖北，武汉大学人民医院泌尿外科；２４３００７０ 术切除的。肾组织标本１２例、因肾癌行肾切除的癌旁 正常肾组织标本６例，－７０℃保存。经病理学检查， 所有肾积水组织均呈现弥漫性纤维化，所有癌旁组织 均为结构完整、形态正常的肾组织。核素肾动态显像 湖北．武汉大学生命科学院病毒学国家重点实验室 通讯作者：张杰，Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｊｉｅ８８８＠ｓｈｕｔ．嗍提示，所有积水肾脏的肾小球滤过率（ＧＦＲ）为 ・４４６’ 国匪处叠堂塞盍！Ｑ塑生！旦筮堑鲞筮！翅 堕幽！趔』螋！趔煎！坚翌翌 趔ｚ！Ｑ塑，！丛：堑：塑！：Ｚ （１８．７士３．５）ｍＬ／ｍｉｎ，分肾功能为（７．８４４－１．４）％。根据本组芯片筛查结果，１２例积水肾组织中表达一致性较好的基因有８９个。按照我们的，与正常对照比较表达差异具有统计学意义的基因有４９ 抒Ｐｒ曲ｌｅｒⅢＰＣＲ芯片购于美国ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ，含 １ １３个ＴＧＦ—Ｂ／ＢＭＰ通路相关基因（Ｎｏ．ＡＰＨＳ旬３５Ａ）。 ＴＲＩＺＯＬ试剂购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ。ＲＮｅ嬲ｙ８ＭｉｎＥｌｕｔｅＴＭ纯个。其中显著性上调２５个，主要有ＢＭＰ３、Ｃ０１．Ｉ仅１、 Ｎｏｄａｌ、ＧＳＣ、ＩＧＦｌ等；显著性下调２４个，主要有Ｌｅｆｔ．ｙｌ、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２和ＢＭＰＥＲ等。部分数据详见表１和表２（其中２出。值越高提示该基因在积水肾组织中上调程度越大，反之则提示下调越明显）。３讨论 随着人类基因组ＤＮＡ测序的完成，功能基因组学（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓ）成为基因研究的主流。它利用结构基因组（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｇｅｎｏｍｅ）提供的信息，在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因／蛋白的研究转向对多个基因／蛋白同时进行系统的研究。众所周知，肾积水．纤维化是一个多基因、多细胞因子、多信号通道共同参与的复杂病理过程。要了解其发生机制，以基因芯片为代表功能基因组学技术可能是解决问题的重要手段。 该方法能在同一条件下一次性筛检众多基因的差异表达，具有高通量、高并行性、高效率、上样量相对少等优点，目前在肿瘤、遗传性和感染性疾病的研究中已有较为广泛的应用【２Ｊ。我们之所以选用ＴＧＦ．ｔ３／ＢＭＰ信号通路芯片，主要因为：（１）这两条通路在器官纤维化的过程中占有至关重要的地位；（２）从较为主要的通道人手，初步探索终末期肾积水组织中纤 化试剂盒购于Ｑｉａｇｅｎ，甲醛上样染液购于Ａｍｂｉｏｎ，其 他试剂均购于华美生物。反应平台为ＡＢＩ１．２方法 １．２．１总ＲＮＡ的提取与纯化取８０ｍｇ组织样品， Ｐｒｉｓｍ ７７００高通量荧光ＰＣＲ系统（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。 用Ｔｆｉｚｏｌ一步法提取总ＲＮＡ，参照ＲＮｅａｓｙ８ ＭｉｎＥｈ． ｔｅｌＭ试剂盒说明书进行纯化，所得总ＲＮＡ和ｍＲＮＡ经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳进行质量分析。１．２．２实时定量ＰＣＲ将总ＲＮＡ混合液２５斗Ｌ加到芯片上对应的孔中，小心密封芯片并置于冰上。实时定量ＰＣＲ程序设置完后，将加好样的芯片置于ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００高通量荧光ＰＣＲ系统进行反应，反应 体系中荧光信号强度（Ｃｔ）。 １．２．３结果分析采用比较阈值法（ＡＡＣｔ法）…，将 两组中每个基因的表达记为ＡＣｔ（ＡＣｔ＝平均Ｃｔ一管家基因平均ｃｔ）。每个基因表达的组间差异记为ＡＡＣｔ（ＡＡＣｔ＝ＡＣｔ（组Ｈ）一ＡＣｔ（组Ｎ））。其中Ｎ为正常对照组，Ｈ为积水组，通过计算２址。比较两组基因的表达差异。当某２址。值≤０．５（下调）或Ｉ＞２（上调）时，认为该基因在两组间表达的差异有统计学意义。２结果 表１ 部分在重度积水肾组织中表达显著性上调的基因 表２部分在重度积水肾组织中表达显著性下调的基因 ＡＣｔ 基因名称（缩写） Ｈ组 Ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎ ２．△△ｃｔ Ｎ组 ７．４６５．２６１２．４５８．０８７．３９１２．３１４．９３１２．２７１３．７８５．８４９．５６１４．３３９．４２１０．２ Ｏ．０５０．０７Ｏ．０９０．１６Ｏ．１７Ｏ．１７Ｏ．２０．２２Ｏ．２２Ｏ．２９Ｏ．２９０．３３０．３４Ｏ．４０．４１Ｏ．４４ ２（ＢＭＰ２）１（Ｕｅ兀ＴＹｌ） １１．８６９．０２１５．９５１０．７２９．９８１４．８４７．２２ Ｌｅｆｔ．ｒｉ【ｇｈｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＢＭＰｂｉｎｄｉｎｇｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ（ＢＭＰＥＲ） １Ａ（ＣＤＫＮｌＡ）ｒｅｃｅｐｔｏｒⅢ（ＴＧＦＢＲ３） Ｃｙｃｌｉｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｂｅｔａＢｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎＴＧＦＢ．ｉｎｄｕｃｅｄ ５（ＢＭＰ５） ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＩＦ） ６（ＢＭＰ６） ｌ＇ｅｃｅｐｔｏｒⅡ（ＴＧＦＢＲ２） １（ＳＴＡＴ） Ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ １４．４４１５．９５７．６２１１．３５１５．９５１０．９６ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｂｅｔａ Ｓｉｓｎ丑ｌｔｒａｎｓｄｕｃｅｒａｎｄａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＢｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｔｙｐｅＩＡ（ＢＭＰＲＩＡ） ＧｒｏｗｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＢｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ ５（ＧＤＦ５）７（ＢＭＰ＇／） １（ＴＧＦＢＲｌ） ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｂｅｔａｒｅｃｅｐｔｏｒＳＭＡＤ，ｍｏｔｈｅｒ８ａｇａｉｎｓｔＤＰＰｈｏｍｏｌｏｇＳＭＡＤ，ｍｏｔｈｅｒｓａｇａｉｎｓｔＤＰＰｈｏｍｏｌｏｇ １１．５１８．２４６．５ｌ １（ＳＭＡＤＩ）２（ＳＭＡＤ２） ６．蟪 ５．３２ 维化相关基因的表达，为进一步开展更多通路的筛检提供基础。 本研究结果提示：（１）Ｎｏｄａｌ【３］、ＧＳＣ［４］、ＩＧＦ”１等与ＴＧＦ一１３信号通路相关的基因，在重度积水肾组织中显著上调，证明了它们对肾纤维化的促进作用。其中前３者的上调更为明显，而ＴＧＦ一１３（包括ＴＧＦＢｌ、 处理的ＵＵＯ肾中，巨噬细胞浸润减少了５５％一ｊ７５％，ＩＶ型胶原和Ｑ．ＳＭＡ的表达亦明显减弱。本结果显示，重度积水后的肾纤维化改变伴随着ＢＭＰ７基因的下调（降低为原来的３４．４％），从相反的方向（果 ＿因）证明了ＢＭＰ＇／对纤维化的负调节作用。此外也 有文献报道，ＢＭＰ２在体内不仅能抑制小管细胞增生，还可抑制系膜细胞增生，而ＢＭＰ４与囊性纤维化的病理改变有关¨０Ｉ。那么如何解释它们在肾纤维化过程中的作用？从功能基因组学的角度我们推测，这是因为它们在整个纤维化过程中各司其责，既有促纤维化作用的成员（上调基因）又有抗纤维化作用的成员（下调基因），形成了一个彼此联系又相互影响的功能基因组，和其他基因组（如：ＴＧＦ一［３／Ｓｍａｄｓ、Ｎｏｄ—ａｌ、Ｌｅｆｌｙ等）一起共同参与调节肾脏胶原蛋白的产生和降解，维持着肾脏细胞外基质（主要是胶原蛋白）的“稳态（Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）”【７Ｊ，一旦由于肾积水等外界因素的干预刺激了促纤维化基因的表达，这种稳态即被打破，接下来就会发生肾纤维化等一系列的病变。 综上所述，功能基因组学着眼于全局，从整体上“横向”、“逆向”地研究和分析组织中各基因的作用和功能。虽然肾积水在不同的发展阶段，其病理生理变化以及基因、蛋白等的表达会有不同，与终末期肾脏广泛纤维化的情况可能存在差异，但后者基本可反映整个病变的规律。通过本实验我们不仅证明了 ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３）作为“最强的纤维化诱导因子”旧ｏ，其 上调幅度则相对较小。由此我们可以推测：当肾积水－肾纤维化进展至终末期（广泛纤维化）时，ＴＧＦ—Ｂ不再是诱导／参与病变的主要因子，而是由Ｎｏｄａｌ、ＩＧＦ等因子代之以继续发挥其致纤维化的作用。同理，由于Ｌｅｆｔｙｌ基因在重度积水肾组织中极低表达（－ １３．５５倍），结合文献一］，我们也预测Ｌｅｆｉｙｌ对纤维化 病变具有抑制作用，但以上结论均需进一步实验证明。（２）ＢＭＰ家族及其受体的基因表达增减各异。如表１、２所示，表达显著上调的有ＢＭＰ３～４、ＧＤＦ７，显著下调的有ＢＭＰ２、ＢＭＰ５～７、ＧＤＦ５—６；其受体表达上调的有ＢＭＰＲＩ Ｂ、ＢＭＰＲ ＩＩ、ＡＣＶＲＬｌ，显著下调 的有ＢＭＰＲＩＡ、ＡＣＶＲＬｌ。参照文献，ＢＭＰ家族中报道最多的是ＢＭＰ７对肾纤维化（因＿÷果）的抑制作用。Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ等哺１用ＢＭＰ７治疗单侧输尿管梗阻（ｕｕｏ）大鼠模型，发现治疗组梗阻解除后，ＧＦＲ较对照组恢复明显加快，小管问质纤维化和小管细胞萎缩、凋亡程度明显降低。Ｈｒｕｓｋａ等一１也发现ＢＭＰ７ 鱼匾处拄堂盘盍至坚生２旦筮堑鲞筮！朗 Ｎｏｄａｌ、ＧＳＣ和ＩＧＦｌ等是促进肾纤维化改变的重要因 子，并提出了Ｌｅｆｔｙｌ和ＢＭＰ家族的部分成员，如ＢＭＰ２—３、ＢＭＰ７和ＢＭＰＥＲ等，可能也参与调控终末期肾积水纤维化改变的假设。当然，以上结论只有经过进一步研究证实，方可为今后更有效的防治肾纤维化提供更加科学、完整的依据。 参考文献 ［１］ ＡｍａｌａｌＦＣ，ＴｏｒｔｅｓＮ，Ｓａ路ｉｏｌＢＦ，ｏｔａ１．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ］ｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ 丛塑型ｉ型』删堕塾她！ 』尘１２塑：！尘：堑，塑！：２ ｔｕｍｏｒ ｇｅｎｅ，Ｇ‘删ｄ，ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｃｉＵＳ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｅａｄ Ａ，２００６，１０３（５０）：１８９６９—１８９７４． Ｃ．Ｇａｒｃｉａ．Ｍｍ咖ｏＣ。ＴｕｒｂｉＣ，ｄａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆ ＯＩｌ ［５］ Ｍｅｎｄｅｚ．Ｄａｖｉｌａ １７ｂｅｔａ－ｅｓｔｒｅｄｉｏｌ，ｔａｍｏｘｉｆｅｎａｎｄｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｍＲＮＡ ｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｉｎｔｅｄｅｕｋｉｎ－６，ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ口ｍ曲ｆａｏｔｏｒ－ｂｅｔａｌａｎｄｉｎ－ｓｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－Ｉｉｎｐｒｉｍａｒｙｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］． Ｉｎｖｅｓｔ，２００４，２７（１０）：９０４－９１２． ｉｎ ｏｆ ＪＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ［６］ ［７］［８］ ＢｏｔｔｉｎｇｅｒＥＰ．ＴＧＦ．ｂｅｔａ ｒｅｎａｌ ｉｎｊｕｒｙａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．‰ ｂｙＴＧＦ－ｂｅｔａａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ一 Ｎｅｐｈｒｏｌ，２００７，２７（３）：３０９－３２０． ＴａｂｉｂｚａｄｅｈＳ．Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｈｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｌ咖［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＢｉｏｓｃｉ，２００２，７：ｄ１２３１－１２４６． ＭｏｒｒｉｓｓｅｙＪ，ＨｍｓｋａＫ，ＧｕｏＧ，ｏｔａ１．Ｂｏｎｅ ７ｉｍｐｒｏｖｅｓ ＡＣＴＨ－ｓｅｃ！ｒｅｔｉｎｇｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｏｍｏｍ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＥｎｄｏｅｒｉｎｏｌ ｍｏｒｐｂｅｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｎａｌｆｉｂｒｏｓｉｓｓｏｃ Ｍｏｔａｂ，２００９，９４（１）：３２０－３２３． ［２３ ＳｏａｒｅｓＡＲ，ＰｅｒｅｉｒａＰＭ。ＳａｎｔｏｓＢ，ｏｔａ１．ＰａｒａｌｌｅｌＤＮＡ ｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｙｒｏｓｅ－ ａｎｄａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓｔｈｅｒｅｔｕｒｎｏｆｒｅｎａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ ［Ｊ］．Ｊ ［９］ ｖｅｎｔｓ Ａｍ Ｎｅｐｈｒｏｌ，２００２。１３（Ｓｕｐｐｌ１）：Ｓ１４－２１． Ｇ，ＷｏａｎｉａｋＭ，ｅｔａ１．Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎ－ｌｐｌ｝ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｍ ｕｎｖｅｉｌｓ ｎ肼ｚｅｂｒａｆｉｓｈｍｉｃｍＲＮＡｓ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ。 ＨｒｕｓｋａＫＡ，Ｇｕｏ ２００９，１０（１）：１９５．［３３ ＭａｖｒａｋｉｓⅪ，Ａｎｃｈ－ＩｅｗＩｕＬ，ＬｅｅＫＬ，ｃｔａ１．Ａｒｋａｄｉａｅｎｈａｎｃｅ８ＮｏｄａＬ／ ＴＧＦ－ｂｅｔａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｎａｌｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｕｒｅｔｅｒａｌ ＪＰｈｙｓｉｏｌＲｅｎａｌ ｂｙｃｏｕｐｌｉｎｇｐｈｏｓｐｈｏ—Ｓｍａｄ２／３ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄｔｕｒｎ・ ［１０］ＣｈｅｎＤ，ＺｈｓｏＭ，ＭｕｎｄｙＧｒｏｗｔｈ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０００，２７９（１）：Ｆ１３０—１４３． ＧＲ．Ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］． （收稿日期：２００９－０５－０６） ｏｖｅｒ［Ｊ］．ＰＬｏＳＢｉｏｌ，２００７，５（３）：ｅ６７．［４］ ＨａｒｔｗｅｌｌＫＡ，ＭｕｉｒＢ，ＲｅｉｎｈａｒｄｔＦ，ｏｔａ１．Ｔｈｅ Ｆａｃｔｏｒｓ，２００４，２２（４）：２３３－２４１． ｓＩ把Ｉｍｍ ｏｒｇａｎｉｚｅｒ 免疫组化方法观察乙肝病毒感染肝星状细胞的研究 马雪梅１ 【摘要】 王字２＋ 赵宏颖３ 目的研究ＨＢＶ能否体外感染ＬＸ－２细胞，以期为阐明慢性乙肝的致病机制提供新的 实验依据。方法体外培养ＬＸ－２细胞细胞数目达到１０６／培养瓶时，用ＨＢＶ感染者的血清进行感染，ＨＢＶＤＮＡ终浓度分别为１０４、１０５、１０６、ｌＯ７拷贝／ＩｎＬ，同一浓度的感染时间均为２４、４８和７２ｈ。按照观察时间点收取细胞，免疫组织化学法（ＤＡＢ显色）测定ＨＢＶ在细胞内是否表达乙肝表面抗原（ＨＢ．ｓＡｇ）和乙肝核心抗原（ＨＢｃＡｇ）。结果用免疫组化方法标记ＨＢｓＡｇ和ＨＢｃＡｇ时，ＬＸ－２细胞中未发现阳性颗粒；ＨｅｐＧ２．２．１５细胞中有少量棕黄色颗粒，位于胞质中；慢性乙肝患者肝组织中可见大量棕黄色颗粒。结论在体外培养中ＨＢＶ不能感染ＬＸ－２细胞和进行抗原表达。 【关键词】乙型肝炎病毒；肝星状细胞；感染；复制 Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｔｕｄｙｍａｎｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌｓ ｇｅｒｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＦｒｉｅｎｄｓｈｉｐＨｏｓｐｉｔａｌＡｆｆｉｌｉａｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙｏｆｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓｅｓ ｏｎ ｈｕ・ ＭＡ髓圮．Ｍｅｉ，ＷＡＮＧＹｕ。ＺｔｔＡＯＨｏｎｇ－Ｙｉｒ曙ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｅｎｅｒａｌＳｕｒ－ ｔｏ ＣａｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌ ｗａｓｔＯ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｏｉｊｉｎｇ１０００５０，ＣｈｉｎｓｗｈｅｔｈｅｒＨＢＶ ｃａｎ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｔｈｅ ｔｒａｔｉｏｎｓｆｒｏｍ０．０１ ｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙ ｏｂｓｅｒｖｅｉｎｆｅｃｔＨＳＣ讥ｖｉｔｒｏ．ＬＸ－２ ａｔ ｅｄｌｓ。 ｔｈｅｈｕｍａｎａｃｔｉｖａｔｅｄＨＳＣｃｅｌｌｌｉｎｅ．ｗｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈ ｔｏ ｈｕｍａｎｓｅｎｌｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＨＢＶＤＮＡ ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎ． １０ ｃｏｐｉｅｓ／ｃｅｌｌａｎｄ ｃｏｒｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄａｆｔｅｒ２４，４８ａｎｄ７２ｈｏｕｒｓ．ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ ｂｙＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （ＨＢｓＡｇ）ａｎｄｈｅｐａｔｉｔｉｓＢａｎｔｉｇｅｎ（ＨＢｃＡｇ）ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄａｎｄ ｄｙｅｄ ｂｙＤＡＢ．Ｂｙ ａｎｄＨＢ—ｆｏｕｎｄｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｎｏｐｏｓｉｔｉｖｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｎＬＸ－２ｃｅｌｌｓ，ａｆｅｗｏｆｄａｒｋｂｒｏｗｎ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＨＢｓＡｇ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ＨＢＶ ｗｅｒｅｃａｎ ｅ／ｇ）ｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎｃｙｔｏｐｌａｓｍｎｕｃｌｅｏｌｉｏｆＨｅｐＧ２．２．１５ｃｅｌｌｓ，ａｌｏｔｏｆｄａｒｋｂｒｏｗｎ ｌｉｖｅｒｂｉｏｐｓｉｅｓｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ．／ｎ ｖｕｒｏ．ｔｈｅｒｅ懈Ｂｏｅｖｉｄｅｎｃｅｔｈａｔ ｉｎｆｅｃｔａｎｄ 唧嘲８ ａｎｔｉｇｅｎｓｉｎＬＸ－２ｃｅｌｌｓ． Ｂｖｉｒｕｓ；ｈｅｐａｔｉｃｓｔｅ］］ａｔｅ 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｃｅｌｌ；ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ 旦匪盐型生盘盘型业圭卫上苤至■￡簦三塑—二——且堕型巫生卫业丝』曼竖罂Ｌ———————血ｋ垫堕。些Ｌ堑—竖Ｌ・５０５ 图Ｉ：结直肠癌肝转移组织免疫组织化学染色结果 Ａ：正常肝细胞在６５４－ｉ染色下呈弱阳性染色。Ｂ：正常肝细胞在（／６２％染色下也呈弱阳性，但染色较６５４４稍淡。ｃ：６５４一ｌ 在癌组织边缘的肝细胞染色明显加深。癌巢之间可见到散在的Ｔｐ阳性的问质细胞。Ｄ：ＩＣ６－２０３和６５４—１的ＴＰ用性细胞分布基本一致，但鞍６５４－１染色浅淡。 雕醚．羲辫溅鬻 图２：结直肠癌肝转移组织免疫组织化学染色结果 Ａ：转移癌细胞基本为ＴＰ（６５４—１）阴性，阳性细胞为癌巢周围、或者癌巢与癌巢之间的间质细胞。Ｂ：１Ｃ６－２０３染色具有和６５４－ Ｉ同样的阳性细胞分布，但染色颜色稍饯。Ｃ：６５４—１阳性的巨噬细胞围绕在癌巢的周围。Ｄ：分布在癌巢之间的ＩＣ６－２０３染色阳性巨噬细胞。ＴＰ阳性细胞比较大，形态多样，细胞内可见到颗粒状物质。Ｅ、Ｆ：仅２份标本发现２种抗体染色下阳性的癌细胞。 ≥鞴黼鬣澜鬻豳黼 图３：绪直肠癌肝转移组织免疫组织化学 注释：图１～图３见：结直肠癌肝转移组织中胸昔 磷酸化酶表达（Ｐ４４０） 染色结果Ａ：ＣＤ６８阳性巨噬细胞呈铁锈色，主要分布于癌巢与癌 巢之间的间质组织中。Ｂ、Ｃ在相问部位，６５４－Ｉ和ＩＣ６—２０３染色阳性细胞的分布形态、部位几乎完全一致，中央与周围的癌巢为ＴＰ阴性。 解酗站麓鲮篡． 毋：。 囤Ｉ ｉ雾鬻塾 ｘ 蝴澳 １５细胞免疫组化照片２０× 、．Ｂ，１：ｉ、’一！ｋ ＬＸ－２细胞免疫组化照片２０ 囤２ ＨｅｐＧ２ ２ Ａ为ＨＢｓＡｇ染色，细胞中没有见到棕黄色颗粒。Ｂ为ＨＢｃＡｇ染色，在细胞中没有棕黄色颗粒。Ｃ是未加一抗的空白对照，细胞中没有棕黄色颗粒。 Ｄ为ＨＢｓＡｇ染色，少量细胞内有棕黄色颗粒。 Ｅ为ＨＢｃＡｇ染色．少量细胞内有棕黄色颗粒；这些颗粒位于胞浆和核内。 Ｆ是未加抗的空白对照，来见阳性颗粒。 因而，在Ⅱ｛细胞中，免疫组织化学染色没有发现阳性颗粒 结果为阴性。 、％、｝ 滋 、 注释：图１一图３见原文：免疫组化方法观察乙肝病 毒感染肝星状细胞的研究（ｐ４４８） ， 。． ． Ｈ ０ ｘ 图３慢性乙型肝炎肝组织免疫组化照片２０ Ｇ为ＨＢｓＡｇ染色．肝细胞内有大量棕黄色颗粒。Ｈ为ＨＢｅＡｇ染色，肝细胞内有较多的棕黄色颗粒。１是未加抗的空白对照，未见阳性颗粒。