内皮细胞生物反应器构建的初步研究

　复旦学报 (医学版)Fudan Univ J Med Sci 2009 Mar ,36 (2) 内皮细胞生物反应器构建的初步研究 谢琼虹1 　丁　峰1 △ 　刘骏峰1 　尤　莉1 　钟建泳1 　李　冰2 　李　一2 　顾　勇1 　林善锬1 (1复旦大学附属华山医院肾脏科　上海　200040 ; 2博傲西腾医疗科技 (上海)有限公司　上海　201201) 【摘要】　目的 　采用培养液循环式人工毛细管培养系统构建血管内皮细胞生物反应器 ,并对其形态和功能进行 鉴定。方法 　将内皮细胞种植于无纺布中空纤维生物反应器的外腔 ,用培养液循环式人工毛细管培养系统进行 培养 ,定期检测培养液中乳酸、葡萄糖、一氧化氮 ( nit rogen oxide , NO) 和血管性血友病因子 (von Willebrand Factor ,vWf)的浓度。根据乳酸的浓度变化计算反应器内细胞的数量 ,通过葡萄糖的消耗和 NO、vWf 的产生反 映内皮细胞的活力和功能。对其中的无纺布进行电镜、DA PI染色荧光显微镜检查 ,观察内皮细胞在生物反应器 外腔无纺布上的生长情况。结果 　随着时间变化 ,培养液中的乳酸浓度进行性升高 ,升高的速度逐渐增大 ;葡萄 糖浓度则逐渐降低 ,降低的速度逐渐增大 ;反映内皮细胞功能的 NO 在最初数小时轻度降低后也逐渐升高 ;在培 养液中检测出内皮细胞的特异性标志物 vWf ;荧光显微镜和电镜下观察细胞在无纺布上生长良好 ,并具有内皮 细胞的形态。结论 　血管内皮细胞能在无纺布中空纤维生物反应器外腔的无纺布上生长 ,并具有良好的形态和 功能 ,提示未来在治疗脓毒症中的潜在价值。 【关键词】　生物反应器 ; 　内皮细胞 ; 　脓毒症 【中图分类号】　R 318 ,R 631 + . 1 　　【文献标志码】　A 　△Corresponding aut hor 　E2mail :dingfeng @fudan. edu. cn The fabrication of endothel ial cell bioreactor XIE Qiong2hong1 , DIN G Feng1 △ , L IU J un2feng1 , YOU Li1 , ZHON G Jian2yong1 , L I Bing 2 , L I Yi2 , GU Yong1 , L IN Shan2yan1 (1 Division of N ephrology , H uashan Hos pital , Fudan Universit y , S hanghai 200040 , China; 2 B iosystem Medical Technolog y Co. L t d. , S hanghai 201201 , China) 【Abstract】　Objective 　To const ruct an endothelial bioreactor . 　Methods 　Endothelial cells were planted in the outer space of non2woven fabric polytet rafluoroethylene ( PTFE) bioreactor with it s intra2capillary space connecting to a medium perfusion system. The medium from the int ra space was obtained every day and collected for lactic acid , glucose , nit rogen oxide ( NO) , protein C and von Willebrand Factor (vWF) analysis. Non2woven fabric PTFE was collected for fluorescent microscope and scanning elect ric microscope examination. 　Results 　Lactic acid levels in culture media sampling from the lumen space rose continuously and the rising rate was also increased. A cont rary result was observed in glucose level . vWF can be detected in the extra space. The cells on the non2woven fabric PTFE had the character of endothelial cells under fluorescent microscope and scanning elect ric microscope examination. 　Conclusions 　Endothelial cells can be planted in the outer space of non2 woven fabric P TFE hollow fiber bioreactor and have good shape and functions ,suggesting it s value in the therapy of sepsis. 【Key words】　bioreactor ; 　endothelial cell ; 　sepsis 　　生物反应器是一个由具有内在网络通道的聚合 物构成的立体框架结构 ,同时辅以流动的培养液提 供营养。通道内外相隔一层半透膜 ,这样便为大量 有效地培养细胞并使之发挥功能提供了条件。生物 反应器在生物型人工肝脏的应用已有 30 多年的历 史。自从 1972 年 Knazek 了中空纤维生物反 应器 ,1975 年 Wolf 等[1 ] 将其应用于肝细胞的培养 后 ,生物反应器在人工肝上的应用不断扩展。除此 591 复旦学报 (医学版) 　2009 年 3 月 ,36 (2) 　 之外 ,中空纤维生物反应器也被应用于人工肾小管 辅助装置的构建[2 ] ,研究者在采用该装置治疗急性 肾功能衰竭和脓毒症的过程中 ,发现肾小管上皮细 胞可通过调节机体炎症反应水平影响脓毒症的 预后[ 3 ] 。 脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征 ,具 有发病率和死亡率高、治疗效果差等特点。在脓毒 症的发生发展过程中 ,内皮细胞无论是形态还是功 能上均受到严重的损害 ,而内皮细胞的损害又进一 步加重了脓毒症时的炎症和凝血。那么 ,采用细胞 疗法体外替代内皮细胞的功能是否能通过影响机体 其他细胞的免疫功能 ,调节机体炎症反应水平 ,从而 改善脓毒症的预后呢 ? 基于此设想 ,本研究通过在 中空纤维生物反应器的外腔种植内皮细胞 ,构建内 皮细胞生物反应器 ,并对内皮细胞的形态和生物活 性进行鉴定 ,以期为脓毒症的治疗提供一项新的 手段。 材 料 和 方 法 实验仪器和试剂 　猪髂动脉内皮细胞 (购自中 国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物 学研究所细胞库) ; Nikon TE2000 E 活细胞工作站 (日本 Nikon TE2000 E 显微镜 , Till Polychrome Ⅳ 单色仪 , Hamamat su ORCA2ER CCD 相机) ; RPMI 1640 (Sigma 公司) ;胎牛血清 ( FBS ,美国 Gibco 公 司) ;血滤器 ( AV400S , Fresenius 公司) ; Ⅰ型胶原 (Sigma 公司) ;无纺布生物反应器 [博傲西腾医疗科 技 (上海 ) 有限公司 ] ; DA PI ( 4′262Diamidino222 p henylindole) 试剂 (Vector 公司) ;乳酸试剂盒 (南 京建成有限公司) ;葡萄糖试剂盒 (普利莱基因技术 有限公司) ;一氧化氮 ( nit rogen oxide , NO) 试剂盒 (南京建成有限公司) ; 血管性血友病因子 ( von Willebrand Factor ,vWf)试剂盒 (美国 ADL 公司) ; 蠕动泵 (Nikkiso 公司) ;酶标仪 (美国 BIO RAD 公 司) ;荧光显微镜 (Olymp us IX70) ;扫描电镜 (日立 S2520) 。 内皮细胞培养 　采用猪髂动脉内皮细胞 ,以 RPMI 1640 培养液 , 内含 10 %胎牛血清培养 , 37 ℃、5 % CO2 培养箱孵育 , 0. 25 % 胰蛋白酶 - 0. 02 % ED TA 1∶1 混合液消化传代 ,第 3～5 代 的细胞用于实验。 局部实验 　取出血滤器的中空纤维 ,其成分为 聚砜膜 ,将聚砜膜中空纤维丝缠绕在干净的载玻片 上 ,环氧乙烷浸泡消毒过夜 ;生理盐水清洗至符合细 胞培养要求 ,用 0. 01 %的 Ⅰ型胶原冰醋酸溶液浸泡 1 h ,37 ℃放置过夜 ;次日用 PBS 液清洗 ,将无菌聚 砜膜片置于培养皿中 ,加入内皮细胞和培养液 ;3 d 后光镜和荧光显微镜 (DA PI 染色) 下观察内皮细胞 在聚砜膜中空纤维外面和培养皿底的生长情况。 内皮细胞生物反应器的构建 　采用无纺布生物 反应器 (如图 1 所示 ,中空纤维位于生物反应器内 , 材料为聚砜膜 ,中空纤维数量 5 000 根 ,膜分子截流 量 60 ×103 ,内腔容积 30 mL ,外腔容积 254 mL ,中 空纤维外缠绕着一层无纺布 ,无纺布上涂有聚氨基 甲酸乙酯 ,该物质具有促进细胞黏附的作用 ,无纺布 面积 0. 1 m2 , n = 5) ,用前生理盐水预冲后排空 ,外 腔封闭 ,内腔与培养液循环式人工毛细管培养系统 相连。该系统由反应器、循环管路、氧合器和泵四部 分组成 ,氧合器内装有 500 mL ( RPMI 1640 + 10 % FBS)培养液 ,并通过滤器和外界空气相通 (图 1) 。 将制备的细胞悬液缓慢移至反应器的外腔 ,封闭外 腔口。以上整个过程均在超净台中严格无菌操作。 启动泵 ,将培养液从氧合器中泵出 ,通过反应器内 腔 ,再回到氧合器中 ,泵的循环速度为 35 mL/ min。 将整个反应装置置于 37 ℃、5 % CO2培养箱中孵育。 细胞在反应器中的培养时间为 5 d ,3～4 d 时更换 氧合器中的培养液。 图 1 　内皮细胞生物反应器的构建装置模式图 Fig 1 　Schematic diagram of the fabrication of endothelial bioreactor 　　内皮细胞生物反应器鉴定 　从取样孔定时取 样 ,测定培养液中乳酸和葡萄糖的含量 ,间接计算内 皮细胞生长数量 ;测定培养液中 NO 的含量 ,反映内 皮细胞功能情况。反应器构建结束后倒出外腔培养 液 ,测定反应器外腔培养液中 vWF 的含量 ,间接对 内皮细胞进行鉴定 ;并 1 800 r/ min 离心外腔培养液 后观察游离内皮细胞数量。取出无纺布即刻行 DA PI 荧光染色观察内皮细胞密度 ;2. 5 %戊二醛固 定 ,扫描电镜观察内皮细胞形态及贴附情况。 结　　　果 局部实验 　如图 2 所示 ,聚砜膜中空纤维在光 691 　谢琼虹 ,等.内皮细胞生物反应器构建的初步研究 镜下是不透光的 ,纤维的侧面光滑 ,未见内皮细胞黏 附、铺展、生长 ;在荧光显微镜下亦不透明 ,纤维表面 仅见数个被 DA PI 染色的内皮细胞细胞核 ;而放置 聚砜膜中空纤维的培养皿中内皮细胞生长良好。 图 2 　局部实验后内皮细胞的生长情况 Fig 2 　Micrographs of pig il iac endothelial cells after local experiment Endot helial cells were planted in t he culture dish which contained polysulfone hollow2fiber for 3 days. A : The flank of polysulfone hollow2fiber was smoot h (Light microscope ×100) ; B : Few endot helial cells adhere to polysulfone hollow2fiber (DAPI ×100 ) ; C : Endot helial cells in t he culture dish grew well (Light microscope ×100) 　　无纺布生物反应器中内皮细胞的形态观察 　内 皮细胞在无纺布生物反应器外腔中生长 5d 后剖开 反应器 ,即刻取出其中的聚砜膜中空纤维和无纺布 , 两者分开 ,分别行 DA PI 染色后在荧光显微镜下观 察。中空纤维丝外表面光滑 ,未见内皮细胞贴附生 长 ,见图 3A。而无纺布上可见大量内皮细胞贴附生 长 ,部分细胞可见双核 ,增殖明显 ,但尚未互相衔接 , 连接成片 ,见图 3B。电镜下观察到无纺布是由丝状 物不规则交错编织而成 ,内皮细胞在无纺布上贴壁 伸展 ,伸出触角 ,具有内皮细胞的形态特征。偶见内 皮细胞成团状生长 ,多数内皮细胞单个生长 ,尚未互 相衔接 ,见图 3C、3D、3 E。 图 3 　内皮细胞在无纺布生物反应器内的生长情况 Fig 3 　Micrographs of pig iliac endothelial cells adherent to nonwoven fabric PTFE of the cartridge The nonwoven fabric P TFE was observed by fluorescence microscope and scanning elect ron microscope ( SEM) after endot helial cells were cultured in t he ECS of t he cart ridge for 5 days. A : Polysulfone hollow2fiber ( DAPI ×100 ) ; B : Nonwoven fabric P TFE ( DAPI ×40 ) ; C : Nonwoven fabric P TFE (scale = 60μm) ; D : Nonwoven fabric P TFE (scale = 30μm) ; E :Nonwoven fabric P TFE (scale = 20μm) 791 复旦学报 (医学版) 　2009 年 3 月 ,36 (2) 　 　　培养液中乳酸和葡萄糖浓度变化 　随着时间变 化 ,培养液乳酸浓度进行性升高 ,升高的速率也在逐 渐增加 ,如图 4 所示 ,箭头 A、B、C 的斜率反应的是 0 h、48 h 和 110 h 时乳酸浓度升高的速率 ,箭头 C 斜率 (1. 3)是箭头 A 斜率 (0. 13) 的 10 倍 ,是箭头 B 斜率 (0. 4) 的 3. 3 倍。94 h 时培养液颜色变黄 ,测 定 p H 值 7. 1 ,更换培养液后乳酸含量明显下降 ;与 0 h 相比 ,48 h 以后葡萄糖浓度的变化具有统计学 差异 ( n = 5 , P < 0. 01) 。相反 ,培养液的葡萄糖浓度 则进行性下降 ,下降的速率也逐渐增加 ,更换培养液 后 ,葡萄糖浓度明显增加 ;与 0 h 相比 ,48 h 以后乳 酸浓度的变化具有统计学差异 ( n = 5 , P < 0. 01) 。 图 4 　培养液中乳酸和葡萄糖浓度随时间变化 Fig 4 　Changes of lactate acid and glucose levels in the culture media of the intra2capillary space of the bioreactor after cell plantation 　　细胞数量 　内皮细胞悬液在移入反应器外腔时 进行细胞计数 ,细胞总量约 3 ×108 。在无纺布生物 反应器外腔生长 5 d 后 ,倒出外腔培养液 ,离心后细 胞数量很少。取出无纺布 ,对无纺布不同部位行 DA PI 染色 ,细胞计数 ,细胞的密度约 2 ×106 / cm2 。 无纺布面积为 0. 1 m2 ,那么内皮细胞数量达 2 ×109 以上。如图 4 所示 ,箭头斜率代表乳酸产生的速率 , 箭头 A 时反应器外腔的细胞数量为 3 ×108 ,箭头 C 斜率是箭头 A 斜率的 10 倍 ,那么内皮细胞数量约 3 ×109 。反应器 96～120 h 产生乳酸 2. 291 mmol/ L ,如果内皮细胞产生乳酸的速率为 (0. 43 ±0. 01) μmol ·10 - 6 ·d - 1 ,那么内皮细胞的数量达 4. 86 ×109 。 vWF和 NO 　反应器构建结束后 ,取反应器外 腔和内腔的培养液进行 vWF 的检测 ,结果示外腔 培养液中 vWF 的浓度为 28. 538 pg/ mL ,内腔培养 液中 vWF 检测不出。如图 5 所示 ,培养液中 NO 的 浓度在最初 6 h 内下降 ,之后缓慢上升。与 20 h 相 比 ,96 h 和 120 h NO 浓度的变化具有显著的统计 学差异 ( n = 5 , P = 0. 002) 。 图 5 　培养液中 NO浓度随时间的变化 Fig 5 　Changes of NO levels in culture media sampling form the lumen space 讨　　　论 生物膜对于反应器的构建是至关重要的 ,因此 我们对膜进行了严格的选择。目前使用的生物膜种 类繁多 ,其中聚砜膜是性能好、使用最为广泛的品种 之一。除广泛应用于人工肾外 ,聚砜膜还可以单独 用于人工肺膜和人工肝脏。鉴于聚砜膜有诸多优点 以及在人工肝、人工肾小管辅助装置中的应用经 验[2 ,4 ,5 ] ,本实验将其作为内皮细胞生物反应器构建 的膜材料。此外 ,膜的通透性也是我们选择生物反 应器考虑的另一重要因素[6 ] ,一方面它必须能使有 益的细胞因子通过 ,发挥其治疗作用 ;另一方面应具 有免疫绝缘作用 ,保护种植于反应器外腔的内皮细 胞免受免疫攻击。现已证实膜截留物质的相对分子 量在 50 ×103～100 ×103 之间能有效的阻止免疫成 分通过。而与炎症相关的细胞因子和凝血因子多数 在 100 ×103以下 ,因此我们选择的中空纤维膜的分 子截留量为 65 ×103 。 我们最初的设想是让内皮细胞在聚砜膜中空纤 维的外表面生长。反应器构建时 ,中空纤维内通培 养液 ,为内皮细胞提供养分和氧气 ;用于治疗时 ,中 空纤维内侧通血液 ,这样可以让血液隔着一层聚砜 膜而和内皮细胞充分的交流。但是 ,内皮细胞能否 在聚砜膜中空纤维外表面生长 ,聚砜膜对内皮细胞 的生长是否会产生抑制 ,这并不清楚 ,因此我们设计 了局部实验。由实验结果可以看出 : (1) 内皮细胞 并不能在聚砜膜中空纤维表面黏附、生长、铺展 ; (2) 聚砜膜对内皮细胞的生长不产生抑制作用。该结果 和王英杰等[7 ]对猪肝细胞在聚砜膜生物界面生长的 研究是相符的。可见 ,使内皮细胞生长于中空纤维 外表面的方法是不可行的。因此 ,我们选择了一种 新型的生物反应器 ———无纺布中空纤维生物反应 器。曾有研究者把肝细胞养植在无纺布上 ,构建肝 891 　谢琼虹 ,等.内皮细胞生物反应器构建的初步研究 细胞生物反应器用来治疗肝衰竭 ,并取得一定的疗 效。浙江大学医学院第一附属医院传染科的李兰娟 等[8 ] 也做过这方面的研究 ,其将原代猪肝细胞种植 在无纺布生物反应器中构建生物型人工肝 ,对 D2氨 基半乳糖胺诱导的猪暴发性肝功能衰竭模型进行治 疗 ,结果发现所构建的人工肝可显著降低受试动物 血氨和乳酸浓度 ,改善 Fischer 指数 ,延长动物存活 时间。无纺布能为肝细胞提供生长界面 ,这已经得 到许多实验的证实 ,但是 ,内皮细胞是否能生长于无 纺布上呢 ,目前国内外尚无研究证实。本研究采用 培养液循环式人工毛细管培养系统将内皮细胞培养 于无纺布生物反应器中 ,并对内皮细胞的形态和功 能进行鉴定。 在实验结束后留取反应器外腔的培养液 ,检测其 中 vWF 的含量为 28. 538 pg/ mL。vWF 是内皮细胞 特异的标志物 ,能够检测得到也间接的对内皮细胞进 行了鉴定。形态学上我们分别对内皮细胞进行荧光 显微镜下细胞核染色检查和扫描电镜检查。从结果 可以看出 ,无论是荧光显微镜还是电镜下 ,内皮细胞 均具有良好的形态。代谢方面我们分别对反应器内 腔培养液中乳酸和葡萄糖含量进行连续的监测。在 我们使用的培养液中 ,葡萄糖是细胞代谢的主要能 源 ,它主要通过糖酵解 (无氧酵解)途径为细胞提供能 量。因此 ,从葡萄糖的消耗和乳酸的产生可以反映内 皮细胞的代谢活性。本实验结果显示 ,培养液中的葡 萄糖含量随时间进行性下降 ,下降的速度逐渐增加 , 乳酸含量则进行性上升 ,上升的速度逐渐增加 ,这也 从另一方面说明内皮细胞是具有活力的。 Humes 等[ 2 ] 在研究人工肾小管辅助装置的过 程中是采用乳酸的产生速度来计算肾小管上皮细胞 的数量的。我们也借鉴了此方法 ,测定出内皮细胞 产生乳酸的速度为 (0. 69 ±0. 03)μmol ·10 - 6 · d - 1 ,根据反应器内 96 ～ 120 h 产生乳酸 2. 291 mmol ,那么内皮细胞的数量达 3. 32 ×109 。另一方 面 ,从内皮细胞产生乳酸前、后速度的变化也能推测 出内皮细胞的数量 ,如图 4 所示 ,箭头斜率代表乳酸 产生的速度 ,实验开始时内皮细胞的数量 (即从培养 瓶中消化后的细胞数) 为 3 ×108 ,箭头 A 表示此时 乳酸产生的速度 ,箭头 C 则表示实验即将结束时乳 酸产生的速度 ,其斜率是箭头 A 的 10 倍 ,那么估计 内皮细胞数量约 3 ×109 ,结果与前一种方法接近。 但是 ,根据乳酸产量的变化来计算内皮细胞的数量 是在假定单位数量内皮细胞单位时间产生乳酸速度 恒定的前提下进行的。也有研究认为乳酸的产量和 细胞数量并不成线性关系。因此利用乳酸的产量来 判断内皮细胞数量的方法仍需置疑 ,而怎样计算无 纺布生物反应器中的细胞数量可能还需进一步 探索。 内皮细胞功能的鉴定相当困难。虽然内皮具有 强大而复杂的病理生理功能 ,表现在 :既能产生舒血 管物质如 NO、前列环素 (p rostacyclin , P GI2 ) 、肾上 腺髓质素 (adrenomedullin ,ADM) ,又能产生缩血管 物质如内皮素 - 1 (endot helin , ET - 1) 、血管紧张素 转化酶 ( angiotensin converting enzyme , ACE) ;既 能产生抗血栓形成物质如内皮细胞蛋白 C 受体 (endot helia cell p rotein C recptor , EPCR) 、组织因 子途径抑制物 ( tissue factor pat hway inhibitor , TFPI) 、组 织 型 纤 溶 酶 原 激 活 剂 ( tissue2type plasminogen activator ,t2PA) ,又能产生促血栓形成 物质如组织因子 ( tissue factor , TF) 、尿激酶型纤溶 酶原 激 活 剂 抑 制 剂 1 ( plasminogen activator inhibitor21 ,PA I21) ;既能产生炎性介质如肿瘤坏死 因子2α( t umor necrosis factor , TN F2α) 、白介素21 (interleukin21 , IL21) 、白介素26 ( interlerkin26 , IL2 6) ,又能产生抗炎介质如白介素24 (interlerkin24 , IL24) 、白介素210 (interlerkin210 , IL210) 。但上述物 质通常情况下并不都表达 ,只有在特定的情况下才 出现 ,如生理条件下 ,内皮细胞是不表达 TF 的 ,只 有在血管损伤、内毒素等病理刺激下才表达 ;炎性介 质和抗炎介质也是在病理情况下产生的[9 ,10 ] 。内皮 细胞的这些特性给内皮细胞功能的鉴定带来极大的 困难。本实验采用测定培养液中 NO 的含量来初步 判断内皮细胞的功能状态。许多研究证实 NO 是内 皮细胞产生的主要生理性物质之一 ,糖尿病、高血 压、脓毒症等病理状态下 ,内皮细胞功能障碍 , NO 产生减少[9 ] 。因此 ,检测培养液中 NO 的含量可初 步判断内皮细胞的功能。我们的实验结果显示 : NO 在最初数小时出现轻度下降 ,之后进行性升高 , 由此可初步判断内皮细胞是有生物活性的。但是内 皮细胞的功能极其复杂 ,仅通过 NO 的检测来判断 内皮细胞的功能有其局限性 ,将来我们还需对与内 皮细胞相关的血管活性物质、炎症介质和凝血物质 进行检测 ,以及对内皮细胞进行干预后观察内皮细 胞的功能变化以更进一步评价内皮细胞的功能。 总之 ,本研究采用培养液循环式人工毛细管培 养系统 ,通过在无纺布中空纤维生物反应器内种植 内皮细胞 ,构建内皮细胞生物反应器 ,并对其形态和 功能进行初步的鉴定 ,提示其在未来脓毒症治疗中 的潜在价值。 参 　考 　文 　献 [ 1 ] 　Riordan S , Williams R. 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