T细胞表型及脾细胞分离ppt课件

研究生实验一、T细胞表型测定（一）二、小鼠脾细胞分离技术实验一、T细胞表型测定（一）---免疫细胞的分离、细胞涂片、固定及保存原理：T细胞是一个复杂的，不均一的整体，根据其发育的不同阶段，表面标记以及功能，可将其分为不同的亚群。T细胞介导细胞免疫应答，并且对B细胞介导的体液免疫应答起到辅助和调节作用。 T细胞共有标志：CD3+为总细胞 T细胞特有标志：CD4+细胞为辅助细胞，CD8+细胞为杀伤细胞。T淋巴细胞表面标志正常值： 正常人外周血中：CD3为60%～80%；CD4为35%～55%；CD8为20%～30% CD4/CD8的正常值约1.4～2.0。 CD4／CD8＜1.4：①免疫缺陷病，如艾滋病的比值常小于0.5；②恶性肿瘤；③再生障碍性贫血；④某些病毒感染。 CD4／CD8＞2.0：自身免疫性疾病，如SLE、类风湿关节炎等。 T淋巴细胞表面标志的检测，有助于了解机体的细胞免疫功能，对免疫缺陷病、肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、移植排斥反应等疾病的诊断、分型、预后和疗效观察有着重要的意义。SABC-AP法测定T细胞亚群 SABC：为链酶亲和素－生物素，AP为碱性磷酸酶。 链酶亲和素：是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子结合。亲和素与生物素一经结合就极为稳定，形成一种类似晶格的复合体。实验基本流程实验材料 肝素、淋巴细胞分层液、Hank’s液、PBS等； 一次性注射器、试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、显微镜，温箱等。 鼠抗人CD3、CD4、CD8单克隆抗体（1抗）；羊抗鼠IgG（生物素化2抗）；SABC-AP；底物（BCIP/NBT磷酸甲苯胺蓝盐）等。*小鼠抗人CD3、CD4、CD8的单抗（Ab1）与T淋巴细胞反应，再加入生物素化的二抗（Ab2），然后再加入标有AP的SABC，最后加入酶底物显色剂显色。实验步骤 标本的制备：淋巴细胞悬液的制备 标本的染色： 结果的观察：标本制备：淋巴细胞悬液的制备（1）取肝素抗凝血5ml与5mlHank’s液稀释混匀，每组取2ml，用滴管贴管壁轻轻叠加于2ml分离液上，配平后1500rpm离心10mins。（2）洗涤细胞：用滴管仔细吸出位于血浆和分离液之间乳白色的淋巴细胞，放入盛有2mlHank’s液的试管，1500rpm离心10mins，弃上清，将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hank’s液重复洗涤一次，最后一次用PBS洗涤。（3）弃去上清，淋巴细胞沉淀用200μlPBS溶解，取20μl细胞涂片，下一次实验检测T细胞亚群用。标本染色 细胞涂片用记号笔划圈，滴固定液1滴，室温固定2～3分钟。 滴加鼠抗人CD3、CD4、CD8抗体15μL，轻轻摇晃，使单抗均匀铺在细胞表面，37℃孵育2～3h，PBS洗3次。 滴加生物素标记羊抗小鼠抗体15μL，37℃孵育30～45分钟，PBS洗3次。 滴加SABC15μL，37℃孵育30～45分钟，PBS洗3次。 滴加显色剂30～50μL，室温显色20～40分钟。可在显微镜下观察，待细胞膜上出现红色标记物时，用PBS淋洗。 滴加细胞核复染液1滴，30秒后自来水淋洗。 显微镜下观察结果。注意事项： 以上操作中，37℃孵育时应将玻片置于湿盒中，切勿干片，特别是加底物后，干片将导致阴阳性结果不能分辨。 观察结果时应使涂片保持湿润。观察结果 高倍镜下计数100～200个单个核细胞。计算阳性率。阳性细胞：细胞表面呈红色。①阳性：细胞表面呈红色，可见深蓝色细胞核；②强阳性：细胞周缘及中央均呈红色，看不见细胞核；③弱阳性：细胞表面呈淡红色，可见淡兰色细胞核；④阴性细胞：细胞表面无着色反应，呈淡兰色。注意事项： 为防止试剂受到污染，加样器吸头最好为一次性使用。 分离单个核细胞中，将稀释血液加于分层液上时，务必要使之形成良好的界面，否则影响分离结果。 孵育过程中，应将涂片置于湿盒中，操作中始终要注意保持涂片的湿润，以确保得到完美的实验结果。 淋洗时不要直接对着细胞冲，避免细胞脱落。 淋洗后，加试剂前须擦干细胞圈外水分，以免试剂流散。实验二小鼠脾细胞分离与制备技术 分离小鼠脾细胞，细胞计数板进行细胞计数，胎盘蓝染色进行细胞活性检测。实验材料： 实验动物：小鼠。 细胞培养液。 试管，滴管，离心机，培养皿，100目细胞筛等。 选择小鼠，拉脱颈椎处死，用碘酒、酒精消毒皮毛。剪开皮肤，打开腹腔。找到红色的脾脏，用镊子分离后摘除。 将脾脏放入盛有5-10ml培养液的平皿中轻轻漂洗，并细心剥除脾脏周围的结缔组织。 将脾脏移入另一个盛有5-10ml培养液的平皿中，轻轻漂洗后置于100目细胞筛中，轻轻挤压使脾细胞通过筛孔进入培养液中，反复冲洗，以取得脾细胞悬液。1、分离小鼠脾细胞 收集分离出的脾细胞，置于10ml离心管内加入培养液吹打，取10μl细胞，与10μl胎盘蓝染液混匀后染色并观察细胞活力，同时进行细胞计数。 细胞活力观察（台盼蓝染色）：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，被染成淡蓝色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，可以鉴别死细胞与活细胞。 细胞计数：采用细胞计数板。2、细胞活力观察及计数 材料：4%台盼蓝母液（称取4g台盼蓝，加蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，用PBS稀释至0.4%）、血细胞计数板、显微镜等。 步骤：①制备单细胞悬液；②染色：取10μl细胞悬液与10μl台盼蓝溶液并混匀；③计数：在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞。 注意事项：台盼蓝对人体有毒，尽量避免直接接触。染色时间不宜过长，否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。台盼蓝染色细胞计数： 步骤：①用乙醇清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干；②用微量移液器取少许细胞悬液（10μl），将细胞样本从室的一个口注入，液体在室中扩散，空气从另一个口排除；③观察计数板四角大方格中的细胞数，并计算细胞浓度。 注意事项：①计数前，应充分混匀细胞；②对于分布在刻线上的细胞，依照“数上不数下，数左不数右“的原则进行计数；③计数时，如发现各中方格的红细胞数目相差20个以上，表示细胞分布不均匀，必须重新计数。实验报告T细胞表型测定、小鼠脾细胞分离技术原理、步骤及结果分析。*小鼠抗人CD3、CD4、CD8的单抗（Ab1）与T淋巴细胞反应，再加入生物素化的二抗（Ab2），然后再加入标有AP的SABC，最后加入酶底物显色剂显色。