枯草杆菌转化方法

枯草芽孢杆菌电转（高渗透法）转化 1）接种B . subtilis于3mlLB培养基中，过夜培养.。 2）取2.6ml过夜培养物接入40ml（LB+0.5M 山梨醇）中，37℃，200rpm培养至OD600=0.85~0.95. 3）将菌液冰水浴10 min，然后5000r，5 min，4℃离心收集菌体。 4）用50ml预冷的电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖），重新吹悬菌体，5000r，5min，4℃离心去上清，如此漂洗4次。  5）将洗涤后的菌体吹悬于1ml电转培养基中，每EP管分装120。  6）将60μl感受态细胞中加入50ngDNA（1~8μl），冰上孵育2min，加入预冷的电转杯（1mm）中，电击一次。 电转仪设置：2.0kv,1mm,电击1次。（电击结果：时间常数=4.5~5.0ms,如果时间常数<4.2 ,则需要增加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数来获得更高的转化效率） 7）电击完毕取出杯子并立即加入1ml RM（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养。 准备 40ml（LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10g/l , 酵母粉5g/l , NaCl 10g/l , 3.6g山梨醇pH=7.2 200ml电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖）：18g 山梨醇，18.5g甘露醇，20g葡萄糖。 10ml RM（0.5M山梨醇，0.38M甘露醇）：0.9g山梨醇，0.7g甘露醇。 2个50ml离心管，灭菌。 090818       8：30 将过夜培养物接种3.2ml到50mlGM ‘       10：30 测600nm OD值        1号样品7.774      2号样品9.091 将1号继续培养10分钟 后感受态制作       19：30    电击 60ul菌液+1ul DNA      对照：60ul菌液+1ul ddwater        20KV/cm      空白 3.2ms       样品 3.0ms    （时间和预期不对 但可以用）     因为对质粒抗性还有不明了地方           只做一组 用kana筛选       1. 看是否是kana 抗性       2.若是kana抗性 看转化效率      为明天做电场梯度作准备